趙 剛，李 紅，史海濤，鄒百倉(cāng)，魯曉嵐，董 蕾

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西西安 710004)

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)是從中國(guó)綠茶中提取的一種水溶性成分，也是茶多酚中最有效的活性成分[1]。EGCG具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗動(dòng)脈硬化、抗血栓形成、抗血管增生及抗炎等作用；也有研究顯示EGCG具有抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用，但其作用機(jī)制尚不完全清楚[2-4]。脂肪酸合酶(fatty acid synthase, FASN)是催化內(nèi)源性長(zhǎng)鏈脂肪酸合成的關(guān)鍵酶。大量的研究表明，多種惡性腫瘤組織中FASN水平往往異常升高，且其升高程度與腫瘤的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[5]，提示FASN與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，有望成為新的抗腫瘤研究的靶點(diǎn)。我們以人肝癌細(xì)胞株HepG2為研究對(duì)象，在前期工作的基礎(chǔ)上，以3個(gè)梯度濃度EGCG分別處理細(xì)胞，觀察其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用及對(duì)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax 以及FASN表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1材料人肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)自上海生物醫(yī)學(xué)工程研究中心。EGCG購(gòu)自上海佳和生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司；胎牛血清為北京元亨生物工程有限公司產(chǎn)品；胰蛋白酶、TRIzol及二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Sigma公司；Hoechst33258購(gòu)自上海君創(chuàng)生物科技有限公司；Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞檢測(cè)試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒由Promega公司提供；PCR相關(guān)引物由上海英駿生物科技有限公司代為合成。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)箱為美國(guó)Nuaire公司產(chǎn)品；德國(guó)LEICA DM B2 型熒光顯微鏡；PTC2000型PCR儀為MJ Research 公司生產(chǎn)；Gel DOC型全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)為美國(guó)Bio Rad公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 HepG2肝癌細(xì)胞在含100 mL/L胎牛血清、1×105U/L的青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、50 mL/L CO2條件下常規(guī)傳代培養(yǎng)。設(shè)對(duì)照組(無藥物干預(yù))和實(shí)驗(yàn)組，其中實(shí)驗(yàn)組又分為80、120、160 μmol/L EGCG組。細(xì)胞分別接種于24孔板和50 mL培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h，再經(jīng)藥物作用48 h后常規(guī)制片、收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析或提取全基因組RNA待檢。

1.2.2Hoechst33258染色及熒光顯微鏡觀察凋亡情況 將Hoechst33258用PBS配制成5 μg/mL染液，室溫下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行避光染色15 min，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡 收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，按照Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行染色后，上機(jī)檢測(cè)并定量分析細(xì)胞凋亡發(fā)生率。

1.2.4半定量RT-PCR方法檢測(cè) FASN及凋亡相關(guān)基因Bcl-2及Bax的相關(guān)PCR引物序列見表1。收集細(xì)胞后用Trizol試劑提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書制備模板cDNA。PCR條件為：94 ℃變性1 min，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行成像分析。

表1 PCR引物序列

2結(jié)果

2.1熒光顯微鏡觀察Hoechst33258染色結(jié)果腫瘤細(xì)胞經(jīng)EGCG作用48 h后，Hoechst33258染色可見部分細(xì)胞核濃染呈亮藍(lán)色，細(xì)胞核染色質(zhì)凝集及邊緣化，出現(xiàn)凋亡小體，而對(duì)照組細(xì)胞胞質(zhì)及細(xì)胞核呈均質(zhì)濃染的藍(lán)色(圖1)。

圖1 熒光染色觀察腫瘤細(xì)胞的凋亡情況

2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況經(jīng)EGCG作用48 h后，各實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞凋亡率隨EGCG濃度增加逐漸升高，160 μmol/L組細(xì)胞凋亡率最高，達(dá)28.6%(圖2)。

2.3RT-PCR檢測(cè)FASN及凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax的表達(dá)結(jié)果經(jīng)EGCG作用48 h后，可見各實(shí)驗(yàn)組凋亡相關(guān)基因Bcl-2表達(dá)量明顯下降，而Bax無明顯變化。FASN的mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯下降，以160 μmol/L組表達(dá)下降最為顯著(圖3)。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡率Fig.2 Tumor cell apoptosis rate detected by flow cytometryA:對(duì)照組;B:120μmol/L EGCG組;C:160μmol/L EGCG組;D:統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與對(duì)照組比較,?P<0.05,??P<0.01;與80μmol/L EGCG組比較,#P<0.05,##P<0.01。

圖3 各組FASN、Bcl-2及Bax基因表達(dá)情況

3討論

細(xì)胞凋亡在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著極其重要的作用，亦是抗腫瘤研究領(lǐng)域備受關(guān)注的生物學(xué)過程[6]。目前，已有較多實(shí)驗(yàn)研究表明，EGCG對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)的作用[7-8]。SAEKI[9]對(duì)人白血病U937 和OCI-AML1a細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，EGCG可作用于JNK和p38信號(hào)傳導(dǎo)通路，通過活化Caspase-3、Caspase-9以及MKK3/6、MKK4、ASK1和JNK1 等誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)160 μmol/L的EGCG作用細(xì)胞48 h后，Hoechst33258熒光染色檢測(cè)結(jié)果顯示可顯著抑制細(xì)胞增殖并促使凋亡發(fā)生；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞凋亡率可達(dá)28.6%，顯著高于對(duì)照組。這進(jìn)一步證實(shí)了EGCG對(duì)人肝癌細(xì)胞的增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用。

Bcl-2基因是迄今研究最為深入和廣泛的凋亡調(diào)節(jié)基因，其基因產(chǎn)物通過抵抗細(xì)胞凋亡、延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，從而導(dǎo)致細(xì)胞存活時(shí)間延長(zhǎng)并最終參與腫瘤形成。Bcl-2可直接與線粒體結(jié)合，抑制細(xì)胞色素C的釋放，從而發(fā)揮抗凋亡效能。Bax 蛋白亦屬于Bcl-2家族，它在功能上與Bcl-2相反，其過度表達(dá)可促進(jìn)凋亡發(fā)生。Bax與Bcl-2可在細(xì)胞膜上形成Bax/Bcl-2異二聚體，而Bax/Bax同二聚體與Bax/Bcl-2異二聚體的比例則決定了細(xì)胞是否發(fā)生凋亡，一旦Bcl-2蛋白增多、Bax減少，Bcl-2/Bax比值增高，就會(huì)抑制凋亡的發(fā)生，反之亦然[10]。本研究結(jié)果顯示，EGCG作用于肝癌細(xì)胞HepG2時(shí)，Bcl-2的mRNA表達(dá)有明顯下調(diào)，而Bax表達(dá)幾乎沒有影響，從而導(dǎo)致Bcl-2/Bax比值顯著下降，這可能是EGCG誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

除凋亡抵抗外，腫瘤細(xì)胞特殊的物質(zhì)和能量代謝是其另一大生物學(xué)特性。FASN是催化內(nèi)源性長(zhǎng)鏈脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，其合成產(chǎn)物軟脂酸既是細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的主要組分，又是細(xì)胞能量代謝的重要底物。正常情況下，人體組織優(yōu)先利用從食物中攝取的脂質(zhì)，內(nèi)源性脂肪酸合成處于較低水平，因此FASN在正常組織及細(xì)胞中不表達(dá)或微量表達(dá)[11]。近年來的多項(xiàng)研究表明，F(xiàn)ASN水平在包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌及子宮內(nèi)膜癌等在內(nèi)的惡性腫瘤組織中異常升高，且統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示其表達(dá)水平與惡性腫瘤的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，提示FASN與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[12-14]。腫瘤細(xì)胞可利用FASN自身合成大量脂肪酸以取代正常情況下從食物中攝取脂肪酸的需要。腫瘤組織及細(xì)胞的此種物質(zhì)代謝特性提示通過抑制FASN活性從而減少內(nèi)源性軟脂酸的合成可能是一條重要的抗腫瘤作用途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，EGCG顯著抑制肝癌細(xì)胞HepG2中FASN基因的表達(dá)，而這種抑制作用的具體作用機(jī)制及其與肝癌細(xì)胞凋亡之間的確切關(guān)系尚有待進(jìn)一步的探討。

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