胡麗麗，趙小鴿，倪 磊，王愛英，楊 娟,

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院：1. 遺傳學(xué)與分子生物學(xué)系；2.環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中心， 陜西西安 710061)

各種動物模型建立后，研究人員通常期望能夠從DNA、RNA以及蛋白質(zhì)水平對某一特定的組織或部位進(jìn)行深入的研究。 但是，所研究的動物具有個(gè)體差異性，采用不同的動物分別進(jìn)行DNA、RNA以及蛋白質(zhì)3個(gè)水平的研究極有可能出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不一致性；其次，所研究的特定部位通常具有不可分割性，或者動物的組織材料量較少，不足以分別進(jìn)行DNA、RNA以及蛋白質(zhì)3種物質(zhì)的提取。因此，如果同時(shí)從某一特定的組織或部位提取DNA、RNA以及蛋白質(zhì)這3種物質(zhì)進(jìn)行后續(xù)檢驗(yàn)分析，將提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性和準(zhǔn)確性。

海馬區(qū)又名海馬回、海馬體或大腦海馬，是位于腦顳葉內(nèi)的一個(gè)部位的名稱。人有兩個(gè)海馬，分別位于左右腦半球。海馬屬于大腦邊緣系統(tǒng)的組成部分，與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)[1-2]；其參與調(diào)節(jié)衰老引起的自主神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的活動[3]；也是大腦中與抑郁癥密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)之一[4]。此外，在各種應(yīng)激模型中，海馬與HPA軸及糖皮質(zhì)激素密切關(guān)聯(lián)[5-6]。

本研究以單側(cè)海馬組織為材料采用Trizol法，分別從上層水相、中間相和有機(jī)相中制備總RNA、基因組DNA 和總蛋白質(zhì)。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對Trizol法提取海馬基因組DNA的效果和試劑盒提取效果進(jìn)行比較，采用蛋白免疫印跡(Western blot)法將Trizol法對海馬蛋白的提取效果和傳統(tǒng)的蛋白裂解液裂解法進(jìn)行比較，分析Trizol法的優(yōu)勢。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物成年雄性Sprague-Dawley大鼠8只，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2主要試劑及儀器Trizol試劑(Invitrogen公司)；RIPA裂解液；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Primescript RT reagent kit(TaKaRa公司)；SYBR Premix EXTaqⅡ(TaKaRa公司)；DNA提取試劑盒(BioTeke 公司)；PremixTaqTM(TaKaRa公司)；抗β-actin抗體(博奧森)；GR抗體(Santa Cruz Biotechnology)。凝膠成像系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)；PCR熱循環(huán)儀(Biometra Thermocycler)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(Bio-Rad)。引物由上海生工公司合成，β-actin引物[7]：上游：5′-CTATCGGCAATGAGCGGTTC-3′，下游：5′-GATCTTGATCTTCATGGTGCTAGG-3′，PCR產(chǎn)物長242 bp；Nr3c1引物：上游：5′-AGGCAGTGTGAAATTGTATCCCAC-3′，下游：5′-GAGGCTTACAATCCTCATTCGTGT-3′，PCR產(chǎn)物長206 bp。

1.3大鼠海馬組織的取材與保存用40 mL/L水合氯醛麻醉SD大鼠，在低溫環(huán)境下快速斷頭取腦，冰上分離海馬組織。將左右兩側(cè)海馬均放入凍存管中，液氮速凍后放入-80 ℃低溫冰箱備用。

1.4Trizol法同時(shí)提取大鼠海馬組織RNA、DNA和蛋白質(zhì)

1.4.1提取大鼠海馬組織RNA 將左側(cè)海馬從-80 ℃低溫冰箱中取出，移入無菌無酶1.5 mL EP管中，加入100 μL Trizol，使用電動研磨器研磨海馬組織15～30 s，加入900 μL Trizol。按照Trizol說明書操作步驟，室溫放置5 min，冰上放置10 min(期間不時(shí)顛倒混勻)，加入200 μL氯仿，劇烈震蕩15 s，4 ℃ 12 000×g 離心10 min，小心取上層水相于一新的無菌無酶1.5 mL EP管中，中間層白膜和下層粉紅色有機(jī)相保留。在上層水相中加0.5 mL異丙醇，混勻，室溫放置15 min，4 ℃ 12 000×g 離心10 min，小心棄去上清，加入1 mL 750 mL/L無水乙醇，渦旋混勻，4 ℃ 7 500×g離心5 min。用1 mL 750 mL/L無水乙醇再次洗滌沉淀。小心棄去上清，然后室溫干燥5 min，用40 μL DEPC水溶解RNA沉淀，用槍頭反復(fù)吹打助溶。保存于-80 ℃低溫冰箱中。

1.4.2提取大鼠海馬組織DNA 按照Trizol說明書操作步驟，盡量移去RNA提取步驟中上層殘留水相，加入0.3 mL無水乙醇，顛倒混勻，室溫放置3 min，4 ℃、2 000×g離心5 min。移上清至一新EP管中(上清用做分離蛋白質(zhì)，操作見后)，加入1 mL 0.1 mol/L 檸檬酸鈉洗滌DNA沉淀，室溫放置30 min，其間輕輕顛倒混勻。4 ℃、2 000×g 離心5 min，棄上清，重復(fù)1次。室溫放置5～10 min，用60 μL 8 mmol/L NaOH溶解DNA。保存于-20 ℃冰箱中。

1.4.3提取大鼠海馬組織蛋白質(zhì) 按照Trizol說明書關(guān)于蛋白質(zhì)提取的操作步驟，加入1.5 mL異丙醇至DNA提取步驟中用做分離蛋白質(zhì)的上清中，混勻，室溫放置10 min，4 ℃、12 000×g離心10 min，棄上清。加2 mL 0.3 mol/L鹽酸胍洗滌液，室溫放置20 min，4 ℃、7 500×g離心5 min，棄上清，重復(fù)2次。加入2 mL無水乙醇使用同樣方法再洗1次。室溫干燥蛋白質(zhì)沉淀10 min，加入80 μL 10 g/L SDS反復(fù)吹打溶解蛋白質(zhì)。保存于-80 ℃低溫冰箱中。

1.5試劑盒提取大鼠海馬組織DNA采用細(xì)胞/組織DNA提取試劑盒(離心柱型)，購自北京BioTeke公司，實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說明書。

1.6RIPA裂解液提取大鼠海馬組織蛋白質(zhì)將右側(cè)海馬從-80 ℃低溫冰箱中取出，放入無菌研磨器內(nèi)。在裂解液中加入適量PMSF(使用前數(shù)分鐘加入)，使PMSF的最終濃度為1 mmol/L。吸取混合液700 μL加入研磨器中，冰上充分研磨組織并靜置1 h，4 ℃、14 000×g 離心15 min，取上清置于1.5 mL EP管中。保存于-80 ℃低溫冰箱中。

1.7RNA質(zhì)量的檢測

1.7.1RNA的濃度、純度鑒定 利用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)(ND2000)測定RNA在260 nm和280 nm處的吸光值，根據(jù)260 nm與280 nm吸光值的比值鑒定RNA純度。

1.7.2SYBR實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測大鼠海馬中β-actin和GR的表達(dá) 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明配置反應(yīng)體系，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min， 85 ℃ 5 s，獲得的cDNA置于4 ℃。按照SYBR Premix EXTaqⅡ試劑盒使用說明配置反應(yīng)體系，應(yīng)用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性，95 ℃ 30 s；擴(kuò)增反應(yīng)，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)；溶解曲線分析，95 ℃ 0 s， 65 ℃ 15 s， 95 ℃ 0 s。每個(gè)樣品的每個(gè)基因設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.8DNA質(zhì)量的檢測

1.8.1DNA的濃度、純度鑒定 同RNA濃度、純度的鑒定。此外，同時(shí)對總DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.8.2以Trizol法和試劑盒法提取的大鼠海馬DNA為模板的PCR擴(kuò)增 按照PremixTaqTM說明配置PCR反應(yīng)體系，模板Trizol法和DNA提取試劑盒提取大鼠海馬DNA，引物為β-actin和Nr3c1的上下游引物。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性，98 ℃ 5 min；擴(kuò)增反應(yīng)，98 ℃ 10 s， 55 ℃ 30 s；后延伸，72 ℃ 50 s；72 ℃ 5 min。

1.9Westernblot法比較Trizol法和RIPA試劑盒提取的大鼠海馬蛋白質(zhì)量蛋白定量后，各取30 μg上樣，用SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，具體條件為：80 V電壓下電泳30 min，100 V電壓下電泳1 h，用PVDF膜半干轉(zhuǎn)膜2 h，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h，加GR抗體或做內(nèi)參的β-actin抗體(一抗)，4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次，加HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(二抗)，室溫下孵育2 h，PBST洗膜3次，加化學(xué)發(fā)光底物在化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)中顯示雜交印跡。

2結(jié)果

2.1RNA質(zhì)量的檢測結(jié)果

2.1.1RNA的質(zhì)量濃度和純度 經(jīng)超微量分光光度計(jì)對RNA的濃度和純度進(jìn)行測定，8個(gè)樣品的濃度、A260/A280和A260/A230的比值見表1。Trizol法提取單側(cè)海馬RNA的質(zhì)量濃度介于1 178.3 ～2 225.8 ng/μL之間，A260/A280介于2.01～2.03，A260/A230介于1.88～2.22。以上結(jié)果表明，Trizol法提取單側(cè)海馬RNA的濃度和純度較高且較為穩(wěn)定。

表1 Trizol法提取單側(cè)海馬組織RNA的質(zhì)量濃度和純度

2.1.2SYBR實(shí)時(shí)定量 RT-PCR檢測海馬組織中β-actin和GR mRNA的表達(dá)情況 通過熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測，獲得了β-actin和GR的循環(huán)域值(CT值)(表2)。擴(kuò)增曲線和溶解曲線提示擴(kuò)增產(chǎn)物高效且為特異性擴(kuò)增。

表2 β-actin和GR的循環(huán)域值

2.2DNA質(zhì)量的檢測結(jié)果

2.2.1DNA的質(zhì)量濃度和純度 經(jīng)超微量分光光度計(jì)對Trizol法和試劑盒提取DNA的質(zhì)量濃度和純度進(jìn)行的測定，8個(gè)樣品的濃度(編號1～4為Trizol法，編號5～8為試劑盒法)、A260/280和A260/230的比值見表3。

表3 兩種方法提取單側(cè)海馬組織DNA質(zhì)量濃度和純度

1～4：Trizol法；4～8：試劑盒法。

Trizol法提取單側(cè)海馬的DNA的質(zhì)量濃度介于215.7 ～271.8 ng/μL之間，A260/A280介于2.03～2.07，A260/A230介于2.33～2.49。試劑盒提取DNA的濃度和純度處于268.6 ～872.5 ng/μL之間，A260/A280介于1.54～1.86，A260/A230介于1.21～2.04。對兩種方法提取的總DNA各取10 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Trizol法提取的總DNA完整性均較好(圖1)。對Trizol法和試劑盒提取DNA的濃度、A260/A280和A260/A230進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(SPSS 16.0)，結(jié)果表明兩種方法的濃度不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，A260/A280和A260/A230具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。以上結(jié)果表明，Trizol法提取單側(cè)海馬DNA的濃度和純度較高且較為穩(wěn)定。

圖1 Trizol和試劑盒法提取的總DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2.2Trizol法和試劑盒法所提取的大鼠海馬組織DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果 以上兩種方法提取的基因組DNA為模板，經(jīng)特定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)，管家基因β-actin(242 bp)和糖皮質(zhì)激素受體基因Nr3c1(206 bp)均有清晰的條帶，未見非特異性擴(kuò)增(圖2、圖3)。所以兩種方法提取的基因組DNA均適于作為基因擴(kuò)增的模板。

2.3Trizol法及RIPA試劑盒法提取的大鼠海馬蛋白的Westernblot結(jié)果Trizol法和RIPA試劑盒提取大鼠海馬蛋白在針對特異蛋白的抗體作用下，Western blot結(jié)果顯示單一清晰的條帶(圖4)。由此可見，Trizol法和RIPA試劑盒提取大鼠海馬蛋白質(zhì)量差異不大，均適于采用Western blot法對目的蛋白進(jìn)行檢測。

3討論

Trizol法適用于從細(xì)胞和組織中快速分離RNA。Trizol法有多組分分離作用，與其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、鹽酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特點(diǎn)是可同時(shí)分離一個(gè)樣品的RNA、DNA及蛋白質(zhì)。Trizol法不僅可用于小量樣品(50～100 mg 組織、5×106個(gè)細(xì)胞)，也適用于大量樣品(≥1 g組織、>107個(gè)細(xì)胞)。對人、動物、植物組織及細(xì)菌均適用，可同時(shí)處理大量不同樣品，整個(gè)提取過程在1 h內(nèi)即可完成。分離的總RNA無蛋白質(zhì)和DNA污染，可用于 Northern Blot、dot blot、ployA篩選、體外翻譯、RNase保護(hù)分析和分子克隆。在用于RT-PCR時(shí)如果2條引物存在于1個(gè)單一外顯子內(nèi)，建議用無RNase的 DNaseⅠ處理RNA樣品，避免出現(xiàn)假陽性。共純化的DNA可用作標(biāo)準(zhǔn)，比較不同樣品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白質(zhì)可用于Western blotting實(shí)驗(yàn)[8-9]。

圖2 兩種方法提取的模板DNA的β-actin PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 兩種方法提取的模板DNA的Nr3c1 PCR擴(kuò)增結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳圖

圖4 Trizol法(1～4)和RIPA試劑盒(5～8)提取蛋白的Western blot結(jié)果

海馬是涉及學(xué)習(xí)記憶能力實(shí)驗(yàn)的主要研究對象，且在應(yīng)激動物模型中具有重要作用。近年來，對模型動物海馬區(qū)的研究已經(jīng)從形態(tài)學(xué)深入到分子、細(xì)胞、蛋白水平。因此，越來越多的研究需要從動物海馬組織DNA、RNA以及蛋白質(zhì)3方面來開展實(shí)驗(yàn)研究。而迄今為止，使用Trizol法從海馬組織同時(shí)提取這3種物質(zhì)的研究未見報(bào)道。本研究結(jié)果表明，Trizol法同時(shí)提取的大鼠單側(cè)海馬組織RNA 、DNA和蛋白質(zhì)，與使用已市場化試劑盒從不同海馬組織中分別提取的DNA和蛋白質(zhì)在質(zhì)量上無明顯差異，并且均適合進(jìn)行后續(xù)的PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)。從同一單側(cè)海馬組織中同時(shí)提取得到的較高質(zhì)量RNA 、DNA和蛋白質(zhì)，使得RNA 、DNA和蛋白質(zhì)3個(gè)水平的研究可以很好的保持同一性，減少了實(shí)驗(yàn)過程中不必要的干擾因素，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)方案；同時(shí)減少了實(shí)驗(yàn)人員的勞動量，提高了工作效率，使實(shí)驗(yàn)動物的使用量減少至最低。目前，同時(shí)提取海馬組織RNA 、DNA和蛋白質(zhì)的文獻(xiàn)較少，故Trizol法同時(shí)提取這3種物質(zhì)為科研人員對海馬組織的研究提供了更為合理和便利的條件。

參考文獻(xiàn)：

[1] MILLER CA, SWEATT JD. Covalent modification of DNA regulates memory formation[J]. Neuron, 2007, 53(6):857-869.

[2] BOWMAN RE, BECK KD, LUINE VN. Chronic stress effects on memory: sex differences in performance and monoaminergic activity[J]. Horm Behav, 2003, 43(1):48-59.

[3] MCEWEN BS. Sex, stress and the hippocampus: allostasis, allostatic load and the aging process[J]. Neurobiol Aging, 2002, 23(9):921-939.

[4] QI X, LIN W, WANG D, et al. A role for the extracellular signal-regulated kinase signal pathway in depressive-like behavior[J]. Behav Brain Res, 2009, 199(5):203-209.

[5] ANDRUS BM, BLIZINSKY K, VEDELL PT, et al. Gene expression patterns in the hippocampus and amygdala of endogenous depression and chronic stress models[J]. Mol Psychiatr, 2012, 17(1):49-61.

[6] ROOZENDAAL B, GRIFFITH QK, BURANDAY J, et al. The hippocampus mediates glucocorticoid-induced impairment of spatial memory retrieval: dependence on the basolateral amygdala[J]. P Natl Acad Sci USA, 2003, 100(2): 1328-1333.

[7] XIAO L, CHEN Y. Culture condition and embryonic stage dependent silence of glucocorticoid receptor expression in hippocampal neurons[J]. J Steroid Biochem, 2008, 111(6):147-155.

[8] 汪軍，金凱舟，王娟，等. 一種高效同時(shí)提取微量組織中總RNA、DNA和蛋白的技術(shù)方法的改進(jìn)[J]. 肝膽胰外科雜志, 2012, 24(4):308-313.

[9] 董華，王軍軍，應(yīng)天翼，等. 一種同時(shí)提取細(xì)胞總RNA和總蛋白的方法[J]. 生物技術(shù)通訊, 2005,16(6):649-650.