李利利，楊浩杰，張文靜，尹愛平，孫吉平

(1.西安交通大學醫(yī)院；2.西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎病中心腎內(nèi)科，陜西西安 710061)

IgA腎病(IgA nephropathy, IgAN)已成為世界范圍內(nèi)最常見的原發(fā)性腎小球疾病，占原發(fā)性腎小球疾病的20%～50%[1-2]。IgA腎病的臨床表現(xiàn)和病理表現(xiàn)多種多樣，大多數(shù)患者病情呈進展性，約15%～40%的成人患者在10年后會進入終末期腎病[3-4]，需替代治療維持生命，給患者及社會帶來了巨大的精神和經(jīng)濟負擔。因此，正確認識和評價IgA腎病的疾病狀態(tài)，尋找與疾病活動性、進展或預后相關指標對臨床工作有重要意義。腎臟病理是IgA腎病診斷的金指標，但腎臟穿刺活檢是一項有創(chuàng)檢查，臨床上難以通過反復腎臟穿刺來監(jiān)測疾病的發(fā)展。近年來，血清、尿液中的一些無創(chuàng)傷性檢查在IgA腎病診斷及病理損傷評估的研究已成為熱點，對臨床工作有重要的指導意義。

足細胞(podocyte)與基底膜和毛細血管內(nèi)皮細胞一起構(gòu)成腎小球血液濾過屏障，是維持腎小球濾過膜結(jié)構(gòu)和功能正常的主要細胞之一[5]。當足細胞受到損傷時，細胞會發(fā)生一系列的形態(tài)改變，直至從基底膜上分離剝脫到腎小囊中，隨尿液排除[6]。Podocalycin(PCX)由腎小球內(nèi)皮細胞和足細胞合成，在足細胞成熟過程中固定于腎小球足細胞頂膜，對腎小球濾過屏障起負調(diào)節(jié)作用[7]。Podocalyxin蛋白是主要的足細胞標志蛋白，通常僅以抗Podocalyxin用于鑒別足細胞[8]。因此，我們試圖通過檢測尿中足細胞的標志性蛋白Podocalyxin表達來判斷尿脫落足細胞數(shù)量，并與IgA腎病的臨床病理進行相關性分析，以期為臨床上治療、預測疾病進展及預后提供一個新的無創(chuàng)傷的指標。

1材料與方法

1.1研究對象2011年4月至2011年10月在西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科行腎臟穿刺活檢明確診斷為原發(fā)性IgA腎病的患者。入選標準：①行腎臟穿刺活檢，病理明確診斷為原發(fā)性IgA腎病，其中包括光鏡、免疫熒光及部分電鏡診斷，每例標本光鏡下腎小球數(shù)目≥5個腎小球，免疫熒光可見IgA或以IgA為主的免疫復合物在腎小球系膜區(qū)(伴有或不伴有毛細血管區(qū))沉積，強度可分為+～；②性別不限，年齡≥12歲。排除標準：①排除過敏性紫癜、慢性酒精性肝病、乙肝病毒相關性腎病、強直性脊柱炎、銀屑病、狼瘡腎炎等繼發(fā)性腎臟損害；②排除伴有其他原發(fā)性腎小球腎炎及糖尿病伴發(fā)IgA腎??；③排除各種藥物、有機溶劑以及腫瘤等原因引起的腎臟損害。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準；參試者均簽署知情同意書。

共收集到原發(fā)性IgA腎病的患者108例，有12例因光鏡下腎小球數(shù)目<5個而剔除，最終入組共96例(男性58例，女38例，男∶女=1.52∶1)；對照組10例，系來自我院泌尿外科單純腎腫瘤切除，并排除腎臟其他疾病的患者。

1.2資料收集①基本資料。包括一般情況，如年齡、性別、病程、發(fā)病時是否伴有高血壓、浮腫、腰痛；②實驗室檢查指標。包括尿液檢查，如尿中紅細胞、尿中上皮細胞、尿中管型細胞、24 h尿蛋白定量、尿β2微球蛋白；血液學檢測包括白蛋白、血紅蛋白、膽固醇、血β2微球蛋白、尿素氮、血肌酐、尿酸、胱抑素及免疫學指標IgA、IgE、IgG、IgM、C3、C4；③腎臟穿刺病理指標。腎小球、腎小管間質(zhì)評分包括腎小球系膜增生程度、腎小球硬化程度、腎小管間質(zhì)評分(RTIS)等；活動性指標如內(nèi)皮細胞增生指數(shù)(endoI)、破壞腎小球毛細血管袢活動性指數(shù)(dGAI)、系膜細胞增生指數(shù)(MsHI)、系膜基質(zhì)增多指數(shù)(MsMI)、腎小球慢性病變指數(shù)(GCI)、腎間質(zhì)炎癥細胞浸潤指數(shù)(infI)，慢性化指標包括腎小管萎縮和腎間質(zhì)纖維化指數(shù)(TCI)及小動脈慢性病變指數(shù)(VCI)等。

1.3患者分組①不同程度蛋白尿分組：1組，24 h尿蛋白定量為0.3～1.0 g；2組，24 h尿蛋白定量為1.0～3.0 g；3組，24 h尿蛋白定量>3 g；對照組，24 h尿蛋白量<0.15 g。②不同程度腎功能分級分組：根據(jù)中國人改良后的公式eGFR=175×Pcr-1.234×age-0.179×[0.79 if female]計算患者eGFR，慢性腎臟病(CKD)分期按照K/DOQI慢性腎臟病臨床實踐指南分組：CKD 1期：GFR≥90 mL/(min·1.73m2)，CKD 2期：GFR 60～89 mL/(min·1.73m2)，CKD 3期GFR 30～59 mL/(min·1.73m2)，CKD 4期GFR介于15～29 mL/(min·1.73m2)，CKD 5期GFR<15 mL/(min·1.73m2)或透析。③病理分型：按照Lee病理分級將IgA腎病分為5級，標準如下：Ⅰ級表現(xiàn)為腎小球絕大多數(shù)正常，偶爾輕度系膜增寬(節(jié)段、伴或不伴細胞增生)，間質(zhì)基本正常；Ⅱ級表現(xiàn)為腎小球示局灶系膜增殖和硬化(<50%)，罕見小的新月體，間質(zhì)基本正常；Ⅲ級表現(xiàn)為彌漫性系膜增殖和增寬(偶爾局灶節(jié)段)，偶見小新月體和粘連；局灶間質(zhì)水腫，偶爾細胞浸潤，罕見小管萎縮；Ⅳ級表現(xiàn)為重度彌漫性系膜增生和硬化，部分或全部腎小球硬化，可見新月體(<40%)；小管萎縮，間質(zhì)浸潤，可見間質(zhì)泡沫細胞；Ⅴ級表現(xiàn)為病變性質(zhì)類似Ⅳ型，但更嚴重，腎小球新月體形成(>45%)；間質(zhì)類似Ⅳ病變，但更嚴重。④按照腎小管間質(zhì)損害TlL程度分為4級，標準如下：Ⅰ級腎小管間質(zhì)基本正常，輕度腎小管變性擴張；Ⅱ級小管萎縮、間質(zhì)纖維化范圍<20%，散在炎細胞浸潤；Ⅲ級小管萎縮、間質(zhì)纖維化范圍30%～40%，散在和(或)彌漫炎細胞浸潤；Ⅳ級：小管萎縮、間質(zhì)纖維化范圍>50%，散在和(或)彌漫炎細胞浸潤。

1.4方法

1.4.1主要試劑 小鼠抗人Podocalyxin單克隆抗體(美國Invitrogen 公司)；FITC標記的山羊抗小鼠IgG、牛血清白蛋白(BSA)、TritonX-100、PV-6000試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；碘化吡啶(PI，美國Sigma公司)；甘油(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.4.2免疫熒光法檢測尿中足細胞Podocalyxin表達 留取腎臟穿刺活檢當日清潔晨尿100 mL，離心(1 500 r/min，5 min)，棄上清液；沉渣混勻，取20 μL涂片于相差顯微鏡觀察并計數(shù)各類細胞及管型，初步了解尿沉渣中有無單個核細胞；取600 μL沉渣置于自動涂片離心機(Cytopro 7620)中，離心(1 200 r/min，5 min)，取出玻片，室溫干燥，4 ℃丙酮固定10 min，自然干燥；將干燥后的載玻片以PBS漂洗(3 min，3次)，置入Triton X-100浸泡5 min，PBS漂洗(3 min，3次)；牛血清白蛋白(BSA)封閉，室溫孵育30 min；滴加第一抗體小鼠抗人Podocalyxin單克隆抗體(1∶50稀釋)，4 ℃過夜；4 ℃冰箱拿出后在室溫下暖孵30 min；滴加第二抗體山羊抗小鼠抗體(FITC 1∶75稀釋)；37 ℃孵育30 min，孵育結(jié)束時不用PBS漂洗；復染細胞核，滴加碘化吡啶(PI)染核，室溫避光孵育5 min；PBS漂洗(3 min，3次)，50%甘油封片；采用雙盲法，在熒光顯微鏡下觀察(綠色熒光波長580 nm，藍色熒光波長510 nm)，每份標本低倍鏡觀察全片，高倍確認足細胞后攝像計算機儲存，選擇全片左上、左下、右上、右下、中間等位置20個高倍鏡視野，記錄完整的足細胞個數(shù)。

2結(jié)果

2.1尿脫落足細胞數(shù)量①按照蛋白尿程度分組：病例組尿脫落足細胞數(shù)量顯著高于對照組(每個高倍鏡下分別為5.334 8和0.300±0.674 9，P<0.05)；不同程度蛋白尿組之間也存在統(tǒng)計學差異(表1)。②按照腎功能不同分組：病例組尿脫落足細胞數(shù)量顯著高于對照組；隨著腎功能進展，尿脫落足細胞數(shù)量也逐漸增多(表2)。③按照不同病理分型分組：病例組尿脫落足細胞數(shù)量顯著高于對照組；隨著病理改變加重，尿脫落足細胞數(shù)量也逐漸增多(表3)。④按照腎小管間質(zhì)損害分組：病例組尿脫落足細胞數(shù)量顯著高于對照組；腎小管間質(zhì)損害越重，尿脫落足細胞數(shù)量也越多(表4)。

表1 不同程度蛋白尿水平IgA腎病尿脫落足細胞數(shù)量的比較

與對照組相比，*P<0.05；與1組相比，▲P<0.05；與2組相比，☆P<0.05。

表2 不同腎功能IgA腎病尿脫落足細胞數(shù)量的比較

與對照組相比，*P<0.05；與1組相比，▲P<0.05；與2組相比，☆P<0.05。

表3 不同病理分級IgA腎病尿脫落足細胞數(shù)量的比較

與對照組相比，*P<0.05；與1組相比，▲P<0.05；與5組相比，☆P<0.05。

表4 不同腎小管間質(zhì)損害分級IgA腎病尿脫落足細胞數(shù)量的比較

與對照組相比，*P<0.05；與1組相比，▲P<0.05；與4組相比，☆P<0.05。

2.2脫落足細胞與腎臟病理的相關性分析尿脫落足細胞數(shù)量與endoI、MsHI 、MsMI之間無相關性(P分別為0.548、0.945、0.938)；與dGAI 、GCI、infI、TCI、(VCI、總評分之間均呈顯著的正相關，相關系數(shù)R分別為0.225(P=0.003)、0.325(P=0.001)、0.243(P=0.017)、0.335(P=0.001)、0.226(P=0.027)、0.409(P<0.001)。

2.3逐步線性回歸分析尿脫落足細胞線性回歸分析：24 h尿蛋白定量、收縮壓、舒張壓以及dGAI、TCI進入回歸方程，回歸方程：尿脫落足細胞=3.520+1.070 24 h尿蛋白-0.065收縮壓+0.075舒張壓+0.316 dGAI+0.691 TCI。尿脫落足細胞與上述指標有顯著的關系，可以顯著影響尿脫落足細胞數(shù)量(表5)。

表5 尿脫落足細胞線性回歸分析

3討論

IgA腎病(IgA nephropathy, IgAN)是以腎小球系膜細胞和(或)基質(zhì)增生、伴有系膜區(qū)IgA或者IgA為主的免疫復合物的顆粒狀沉積、電鏡下系膜區(qū)可見大量電子致密物沉積為特征的一類腎小球疾病。既往研究多集中于系膜細胞在IgA腎病的腎小球硬化中的作用，但近來研究表明足細胞的損傷與IgA腎病之間有密切的聯(lián)系。足細胞除通過足突構(gòu)成分子屏障外，電荷屏障也是阻止白蛋白從腎小球濾過的重要機制。足細胞Podocalyxin蛋白正常表達可以保證腎小球濾過膜電荷屏障的完整性，其抗粘附作用可使足突裂隙隔膜得以維持[9]。

目前，公認的IgA腎病預后不良的因素有大量蛋白尿、腎功能不全、發(fā)病時高血壓等，特別蛋白尿是影響IgA腎病的獨立危險因素，而足細胞的損傷常常與蛋白尿密切相關[10]。本研究結(jié)果提示，尿中Podocalyxin表達與蛋白尿程度呈正相關，這與NAKAMURA[11]研究慢性腎小球腎炎伴高膽固醇血癥患者尿蛋白定量與尿足細胞數(shù)量呈正相關相一致。腎小球足細胞受損而導致足細胞數(shù)目的減少不僅可引起蛋白尿的發(fā)生，而且是腎小球硬化的始動環(huán)節(jié)[12-13]。而YU等[14]研究表明，尿中足細胞可能在反映腎小球損傷方面較尿蛋白更為敏感，因此尿足細胞數(shù)量有助于判斷腎小球損傷程度及預后。

當足細胞受到損傷后，細胞發(fā)生一系列的表型改變，早期表現(xiàn)為足突回縮、整個足突的消失，隨后出現(xiàn)足細胞胞體的縮小，假囊形成，陰離子電荷減少，最終從基底膜上分離剝脫到腎小囊中，這樣腎小球的濾過膜發(fā)生損傷，引起腎小球濾過率的改變，即濾過率下降。MACCONI等[15]對大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，足細胞數(shù)目的減少是足細胞功能缺陷和腎小球濾過功能障礙的決定因素。本研究發(fā)現(xiàn)，腎功能受損越嚴重，尿脫落足細胞數(shù)量越多，提示腎功能受損越嚴重，腎小球足細胞脫落越多，腎小球足細胞數(shù)量越少。研究表明，足細胞缺失與腎小球硬化的發(fā)生密切相關，當足細胞數(shù)減少10%～20%時，腎小球硬化即開始[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，足細胞數(shù)量與系膜細胞評分之間無相關，可能與腎小球系膜細胞損害無直接關聯(lián)。但是，尿中脫落足細胞數(shù)量與腎小球硬化評分、腎間質(zhì)評分及活動性指標dGAI、infI間呈正相關，推測尿中Podocalyxin表達可能提示存在活動性病變。與慢性病變指標GCI、TCI、VCI均呈正相關性，證實了足細胞脫落只有在腎小球硬化達到20%時才能脫落入尿中，推測尿中Podocalyxin表達存在腎小球硬化的基礎，可能是IgA腎病的進展因素之一。既往有學者[17]發(fā)現(xiàn)，IgA腎病尿中足細胞數(shù)量與腎臟病理活動性病變相關，連續(xù)監(jiān)測結(jié)果得出累計足細胞脫落量與病理慢性病變的加重相關，提示尿中足細胞作為一項無創(chuàng)指標不僅能反映病理活動性，也是疾病進展因素之一。對IgA腎病患者長期隨訪研究發(fā)現(xiàn)，尿足細胞持續(xù)陽性者疾病持續(xù)進展。

有研究表明，足細胞與蛋白尿、腎小球硬化及慢性腎損傷進展密切相關，足細胞的減少及丟失已成為反映腎小球損傷嚴重程度和疾病進展的重要觀測指標[10]。腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化、高血壓、大量蛋白尿和腎功能損害是學術(shù)界意見比較一致的影響IgA腎病進展的危險因素。由于腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化是不可逆的損害，因此是預后不良強有力的危險因素。本研究發(fā)現(xiàn)24 h尿蛋白定量、血壓、dGAI、TCI對尿脫落足細胞有顯著影響；根據(jù)病理指標推測尿脫落足細胞不僅提示IgA腎病的活動性病變，且與慢性基礎病變有一定關系，推測可能是IgA腎病進展因素之一。

本研究樣本量有限，僅能發(fā)現(xiàn)尿脫落足細胞與臨床病理變化存在相關性。此外，本研究為橫斷面研究，未隨訪患者病情進展情況，加入隨訪資料可能能更有力地說明尿脫落足細胞可能是IgA腎病進展因素之一。

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