張平，李鵬飛（等）

摘要：為了分析蛋白質(zhì)變性劑和金屬離子對從中華皮蠅（Hypoderma sinense）幼蟲中純化的單體乳酸脫氫酶（LDH）活力的影響，分別用3種蛋白質(zhì)變性劑[尿素、鹽酸胍、十二烷基硫酸鈉（SDS）]以及8種二價金屬離子在體外處理純化的中華皮蠅LDH，再測定其酶活力。結(jié)果表明，中華皮蠅LDH對蛋白質(zhì)變性劑尿素有一定的耐受性，對SDS敏感；在1～20 mmol/L濃度范圍內(nèi)，大多數(shù)二價金屬離子對LDH活力有不同程度的抑制作用，但3 mmol/L的Co2+對LDH活力有很強的促進作用，這不同于其他來源的LDH。該研究結(jié)果提示中華皮蠅LDH具有較高的抗變性能力，對高濃度Co2+的需求可能是其重要特征之一。

關(guān)鍵詞：乳酸脫氫酶（LDH）；中華皮蠅（Hypoderma sinense）；金屬離子；酶活力；蛋白質(zhì)變性劑

中圖分類號：S852.74+3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）07-1609-03

In vitro Effects of Protein Denaturants and Metal Ions on Activities of Monomeric Lactate Dehydrogenase from Hypoderma sinense

ZHANG Ping，LI Peng-fei，JIN Su-yu，HUANG Lin，LIN Ya-qiu，ZHENG Yu-cai

（College of Life Science and Technology， Southwest University for Nationalities， Chengdu 610041，China）

Abstract： To study effects of three protein denaturants and eight metal ions on the activities of monomeric lactate dehydrogenase （LDH） purified from Hypoderma sinense larva， the purified LDH was incubated in vitro with urea， sodium dodecyl sulfate（SDS）， guanidine hydrochloride and eight divalent metal ions， and then subjected to activity analysis. The results showed that Hypoderma sinense LDH had relative resistance to urea， but was sensitive to sodium dodecyl sulfate （SDS）. Most metal ions had varied degrees of inhibition to LDH activity at concentrations from 1 to 20 mmol/L， while Co2+ increased LDH activity significantly at 3 mmol/L concentration， quite different from the LDH of other treats. It is indicated that Hypoderma sinense LDH had strong ability against denaturalization and its requirement for high concentration of Co2+ might be its one important property.

Key words： lactate dehydrogenase； Hypoderma sinense； metal ion； enzyme activity； protein denaturalization

乳酸脫氫酶（LDH，EC 1.1.1.27）是糖代謝中無氧酵解的關(guān)鍵酶，能催化丙酮酸和乳酸之間的轉(zhuǎn)化，在能量代謝中發(fā)揮重要作用。在臨床醫(yī)學上，LDH被認為是潛在的藥物靶點，用于治療依賴于無氧代謝提供能量的疾病[1]。Marchat等[2]從一種線蟲Molinema dessetae中純化了LDH，并發(fā)現(xiàn)了其酶學性質(zhì)與哺乳動物LDH的很多差異。最近，人們從寄生在牦牛皮下的中華皮蠅（Hypoderma sinense）幼蟲中純化了LDH并進行了酶動力學分析，發(fā)現(xiàn)中華皮蠅LDH為罕見的單體結(jié)構(gòu)，對熱、酸和HgCl2都很穩(wěn)定，與其他動物相比對底物乳酸有更小的米氏常數(shù)[3]。研究酶的穩(wěn)定性以及金屬離子對酶活力的影響是酶學研究中的基礎(chǔ)性和十分重要的工作[4，5]。為深入和全面了解中華皮蠅LDH的酶學特性，本研究分析了蛋白質(zhì)變性劑和幾種金屬離子在體外對中華皮蠅LDH活力的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集和LDH的純化

試驗用牛皮蠅二期或三期幼蟲采自牦牛皮下。在四川省青白江區(qū)某屠宰場屠宰牦牛時采集牛皮蠅幼蟲，經(jīng)生理鹽水清洗后用干冰保存帶回實驗室。這些幼蟲用Otranto等[6]、劉浩浩等[7]建立的PCR-RFLP方法鑒定為中華皮蠅（H.sinense）幼蟲。

按照Li等[3]的方法，從牦牛中華皮蠅幼蟲中純化LDH，主要過程包括：勻漿、熱處理、HiTrapTM Blue HP親和層析、Superdex 75凝膠過濾等。所獲得的LDH經(jīng)檢測為電泳純[3]。LDH對蒸餾水于4 ℃透析4 h（透析過程中多次更換蒸餾水，并連續(xù)輕輕攪拌），分裝后的酶液于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 LDH活力的測定

LDH活力測定參照Marchat等[2]的動力學方法。反應(yīng)體系1.55 mL，含0.2 mol/L Tris-HCl（pH 7.3）1.4 mL，6.6 mmol/L NADH 0.05 mL，30 mmol/L丙酮酸鈉0.05 mL和純化的LDH酶液0.05 mL。記錄25 ℃條件下2 min內(nèi)反應(yīng)液A340 nm 的變化情況。1個單位的酶活力定義為在25 ℃條件下，每分鐘催化1 μmol的輔酶（NADH）發(fā)生反應(yīng)的酶量。試驗控溫采用德國Huber恒溫水浴，比色采用具有酶動力學分析功能的DR2800型分光光度計（美國Hach公司）。

1.3 蛋白質(zhì)變性劑和金屬離子對中華皮蠅單體LDH活力的影響

分析了不同濃度的3種蛋白質(zhì)變性劑即尿素、鹽酸胍和SDS對LDH活力的影響。先將蛋白質(zhì)變性劑（尿素的終濃度為0～3.0 mol/L，鹽酸胍的終濃度為0～1.5 mol/L；SDS的終濃度為0～0.5 mol/L）與LDH酶液在25 ℃水浴中保溫15 min后取出放置于冰上，再測定其酶活力。以對照管的LDH相對活力為100%，根據(jù)測定結(jié)果計算經(jīng)不同濃度蛋白質(zhì)變性劑處理后LDH的相對活力。

參照Guzik等[8]的方法分析金屬離子對LDH活力的影響。試驗所用的8種二價金屬鹽分別為CaCl2、ZnCl2、MnSO4、CuCl2、MgCl2、NiSO4、CoCl2、FeCl2，均為國產(chǎn)分析純。取適量經(jīng)過稀釋的純化LDH酶液，加入二價金屬離子，使其終濃度分別為0（超純水對照）、1、3、5、20 mmol/L，25 ℃水浴保溫15 min，取出置于冰上，用于測定LDH活力。每個濃度3次重復(fù)。以對照管的LDH相對活力為100%，根據(jù)測定結(jié)果計算不同濃度二價金屬離子處理后LDH的相對活力。

試驗還采用金屬螯合劑EDTA代替金屬離子，觀察其對LDH活力的影響，處理方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)變性劑對LDH活力的影響

由圖1可見，兩種常用的蛋白質(zhì)變性劑（尿素和鹽酸胍）在體外處理中華皮蠅單體LDH，均可降低LDH的活力（由于SDS對酶活力影響非常大，高濃度時完全抑制了酶活力，因此未列出相應(yīng)的柱形圖）。相對尿素而言，鹽酸胍對LDH活力的影響更大。3.0 mol/L尿素處理后，LDH仍表現(xiàn)為約60%的殘留活力，而1.5 mol/L鹽酸胍處理后，LDH活力僅殘留約8%。SDS對LDH的抑制效果明顯高于尿素和鹽酸胍，在濃度為0.062 5 mol/L時，LDH活力僅殘留約2%。

2.2 二價金屬離子對LDH活力的影響

由圖2可見，8種二價金屬離子在濃度為1～20 mmol/L范圍內(nèi)均對中華皮蠅單體LDH的活力有一定影響。絕大多數(shù)二價金屬離子表現(xiàn)為對LDH活力有不同程度的抑制作用，并與濃度有一定關(guān)系，尤其是Cu2+和Fe2+在高濃度（20 mmol/L）時有較強的抑制作用，但Ni2+對LDH活力影響不大。值得注意的是，Co2+在3～20 mmol/L范圍內(nèi)對LDH活力有較強的促進作用，3 mmol/L的Co2+處理后，其LDH活力約相當于對照組的3.5倍。

另外，在純化的LDH中加入EDTA，在1 mmol/L和3 mmol/L時，LDH活力分別下降至原來的59.2%和30.6%，提示金屬離子對中華皮蠅單體LDH活力的重要性。

3 小結(jié)與討論

通過對中華皮蠅幼蟲中純化的LDH研究表明，中華皮蠅LDH為單體結(jié)構(gòu)，熱穩(wěn)定性強，對pH、HgCl2都不敏感，比一般動物來源的LDH穩(wěn)定[3]。尿素和鹽酸胍是典型的蛋白質(zhì)變性劑，本試驗結(jié)果顯示，中華皮蠅LDH對尿素有一定的耐受性。即使是強變性劑鹽酸胍，在0.5 mol/L條件下中華皮蠅LDH仍可保持約50%的活力，這進一步證實了LDH結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。有研究表明，LDH經(jīng)2 mol/L尿素處理2 min，肌肉來源的同工酶LDH5基本失去活性，但心臟來源的LDH1活力基本不受影響[9]。因此，中華皮蠅LDH在性質(zhì)上可能更接近哺乳動物中的LDH1。SDS是一種強陰離子去污劑，能導致蛋白質(zhì)變性。中華皮蠅LDH對SDS比較敏感，推測SDS能影響酶分子或活性中心的電荷分布，導致LDH構(gòu)象變化（變性）從而顯著影響其催化能力，這與已有報道相符[10]。SDS導致蛋白質(zhì)變性的機制與尿素、鹽酸胍不同。尿素和鹽酸胍可破壞蛋白質(zhì)分子中的氫鍵，也可能破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水作用；而SDS中的疏水長鏈和帶負電荷的硫酸根可分別作用于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的非極性基團和水分子，導致蛋白質(zhì)變性。結(jié)合中華皮蠅LDH對pH不敏感[3]以及對尿素、鹽酸胍較好的耐受性特征，推測疏水作用力在穩(wěn)定中華皮蠅LDH空間結(jié)構(gòu)中發(fā)揮了更重要的作用。

有關(guān)金屬離子對酶活力的體外影響已經(jīng)有非常多的報道。金屬離子對有些酶是必需的，也可與酶蛋白的某些氨基酸殘基結(jié)合，從而影響酶的活力。有研究表明，在0.5～2.5 mmol/L的濃度范圍內(nèi)，F(xiàn)e3+、Cu2+、Ni2+和Co2+對LDH均有抑制作用，且抑制程度依次下降；試驗還觀察到，Co2+隨著濃度升高對LDH的抑制作用反而下降，但遺憾的是試驗沒有分析更高濃度Co2+的作用[11]；而汪勛清等[12]報道，Zn2+、Ca2+對LDH活力無影響，Mn2+有抑制作用，而Cu2+、Mg2+在低濃度時有微弱的促進作用。本試驗結(jié)果與上述報道存在一些差異，可能與LDH結(jié)構(gòu)不同有關(guān)。另外，不同研究采用的二價金屬離子濃度、LDH的純度及方法等的差異也可能會導致不同的試驗結(jié)果。

本研究中Co2+在3 mmol/L時對LDH活力有較強的促進作用。作為重金屬的Co2+對很多酶都有抑制作用[5，11]，但也有不少酶需要Co2+或者可以被Co2+激活[13-16]，其機制可能涉及Co2+與酶的氨基酸殘基結(jié)合，影響酶的構(gòu)象或活性中心；或類似堿性羧肽酶中，Co2+代替Zn2+作為酶的輔助因子[15]。D-木糖異構(gòu)酶為四聚體，每個亞基中都含有兩個必需的金屬離子（包括Co2+）結(jié)合位點（1個結(jié)構(gòu)位點和1個催化位點）[14]。由此可見，Co2+對酶活力的影響及相關(guān)的機制可能十分復(fù)雜。LDH并非金屬酶類，有關(guān)Co2+對LDH活力的促進作用的機制尚不清楚。已有報道表明，Co2+對其他來源LDH活力的影響不同于本研究結(jié)果[11，12]。因此，中華皮蠅LDH活力被高濃度Co2+顯著促進的特點，可能是該單體酶的特性之一。

參考文獻：

[1] BROWN W M， YOWELL C A， HOARD A， et al. Comparative structural analysis and kinetic properties of lactate dehydrogenases from the four species of human malarial parasites[J]. Biochemistry，2004，43（20）：6219-6229.

[2] MARCHAT L， LOISEAU P M， PETEK F， et al. Purification and characterization of lactate dehydrogenase isoenzymes 1 and 2 from Molinema dessetae （Nematoda：Filarioidea）[J]. Parasitol Res，1996，82（8）：672-680.

[3] LI P F， JIN S Y， HUANG L， et al. Purification and properties of a monomeric lactate dehydrogenase from yak Hypoderma sinense larva[J]. Exp Parasitol，2013，134（2）：190-194.

[4] MOUNAJI K， VLASSI M， ERRAISS N E， et al. In vitro effect of metal ions on the activity of two amphibian glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases： potential metal binding sites[J]. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2003，135（2）：241-254.

[5] WAI L，CHONG K， HO W S. Influence of heavy metals on Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase interactions in Chironomus riparius larvae[J]. Environ Toxicol Chem，2013，32（8）：1882-1887.

[6] OTRANTO D， COLWELL D D， TRAVERSA D， et al. Species identification of Hypoderma affecting domestic and wild ruminants by morphological and molecular characterization[J]. Med Vet Entomol，2003，17（3）：316-325.

[7] 劉浩浩，李玉萍，黃志宏，等.牦牛牛皮蠅幼蟲的快速PCR-RFLP鑒定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2012，51（7）：1477-1480.

[8] GUZIK U， HUPERT-KOCUREK K， SALEK K， et al. Influence of metal ions on bioremediation activity of protocatechuate 3，4-dioxygenase from Stenotrophomonas maltophilia KB2[J]. World J Microbiol Biotechnol，2013，29（2）：267-273.

[9] KARLSEN R L， N？覫RGAARD L， GULDBRANDSEN E B. A rapid method for the determination of urea stable lactate dehydrogenase on the 'Cobas Bio' centrifugal analyser[J]. Scand J Clin Lab Invest，1981，41（5）：513-516.

[10] SANFORD K J， MEYER D J， MATHISON M J， et al. Selective inactivation of lactate dehydrogenase isoenzymes with ionic surfactants[J]. Biochemistry，1981，20（11）：3207-3214.

[11] 蔣本國，劉長建，張 樂，等.金屬離子對LDH的抑制作用與底物對其保護作用研究[J].高師理科學刊，2010，30（4）：80-83.

[12] 汪勛清，高小霞.二價金屬離子影響乳酸脫氫酶活性的單掃伏安研究[J].高等學?；瘜W學報，1998，19（4）：543-546.

[13] BRAUN T. The effect of divalent cations on bovine spermatozoal adenylate cyclase activity[J]. J Cyclic Nucleotide Res， 1975，1（6）：271-281.

[14] VAN BASTELAERE P B， CALLENS M， VANGRYSPERRE W A， et al. Binding characteristics of Mn2+， Co2+ and Mg2+ ions with several D-xylose isomerases[J]. Biochem J，1992，286（Pt3）：729-735.

[15] DEDDISH P A， SKIDGEL R A， ERDO S E G. Enhanced Co2+ activation and inhibitor binding of carboxypeptidase M at low pH. Similarity to carboxypeptidase H （enkephalin convertase）[J].Biochem J，1989，261（1）：289-291.

[16] OHSHIMA N，YAMASHITA S，TAKAHASHI N，et al.Escherichia coli cytosolic glycerophosphodiester phosphodiesterase （UgpQ） requires Mg2+，Co2+，or Mn2+ for its enzyme activity[J]. J Bacteriol，2008，190（4）：1219-1223.

參考文獻：

[1] BROWN W M， YOWELL C A， HOARD A， et al. Comparative structural analysis and kinetic properties of lactate dehydrogenases from the four species of human malarial parasites[J]. Biochemistry，2004，43（20）：6219-6229.

[2] MARCHAT L， LOISEAU P M， PETEK F， et al. Purification and characterization of lactate dehydrogenase isoenzymes 1 and 2 from Molinema dessetae （Nematoda：Filarioidea）[J]. Parasitol Res，1996，82（8）：672-680.

[3] LI P F， JIN S Y， HUANG L， et al. Purification and properties of a monomeric lactate dehydrogenase from yak Hypoderma sinense larva[J]. Exp Parasitol，2013，134（2）：190-194.

[4] MOUNAJI K， VLASSI M， ERRAISS N E， et al. In vitro effect of metal ions on the activity of two amphibian glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases： potential metal binding sites[J]. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2003，135（2）：241-254.

[5] WAI L，CHONG K， HO W S. Influence of heavy metals on Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase interactions in Chironomus riparius larvae[J]. Environ Toxicol Chem，2013，32（8）：1882-1887.

[6] OTRANTO D， COLWELL D D， TRAVERSA D， et al. Species identification of Hypoderma affecting domestic and wild ruminants by morphological and molecular characterization[J]. Med Vet Entomol，2003，17（3）：316-325.

[7] 劉浩浩，李玉萍，黃志宏，等.牦牛牛皮蠅幼蟲的快速PCR-RFLP鑒定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2012，51（7）：1477-1480.

[8] GUZIK U， HUPERT-KOCUREK K， SALEK K， et al. Influence of metal ions on bioremediation activity of protocatechuate 3，4-dioxygenase from Stenotrophomonas maltophilia KB2[J]. World J Microbiol Biotechnol，2013，29（2）：267-273.

[9] KARLSEN R L， N？覫RGAARD L， GULDBRANDSEN E B. A rapid method for the determination of urea stable lactate dehydrogenase on the 'Cobas Bio' centrifugal analyser[J]. Scand J Clin Lab Invest，1981，41（5）：513-516.

[10] SANFORD K J， MEYER D J， MATHISON M J， et al. Selective inactivation of lactate dehydrogenase isoenzymes with ionic surfactants[J]. Biochemistry，1981，20（11）：3207-3214.

[11] 蔣本國，劉長建，張 樂，等.金屬離子對LDH的抑制作用與底物對其保護作用研究[J].高師理科學刊，2010，30（4）：80-83.

[12] 汪勛清，高小霞.二價金屬離子影響乳酸脫氫酶活性的單掃伏安研究[J].高等學?；瘜W學報，1998，19（4）：543-546.

[13] BRAUN T. The effect of divalent cations on bovine spermatozoal adenylate cyclase activity[J]. J Cyclic Nucleotide Res， 1975，1（6）：271-281.

[14] VAN BASTELAERE P B， CALLENS M， VANGRYSPERRE W A， et al. Binding characteristics of Mn2+， Co2+ and Mg2+ ions with several D-xylose isomerases[J]. Biochem J，1992，286（Pt3）：729-735.

[15] DEDDISH P A， SKIDGEL R A， ERDO S E G. Enhanced Co2+ activation and inhibitor binding of carboxypeptidase M at low pH. Similarity to carboxypeptidase H （enkephalin convertase）[J].Biochem J，1989，261（1）：289-291.

[16] OHSHIMA N，YAMASHITA S，TAKAHASHI N，et al.Escherichia coli cytosolic glycerophosphodiester phosphodiesterase （UgpQ） requires Mg2+，Co2+，or Mn2+ for its enzyme activity[J]. J Bacteriol，2008，190（4）：1219-1223.

參考文獻：

[1] BROWN W M， YOWELL C A， HOARD A， et al. Comparative structural analysis and kinetic properties of lactate dehydrogenases from the four species of human malarial parasites[J]. Biochemistry，2004，43（20）：6219-6229.

[2] MARCHAT L， LOISEAU P M， PETEK F， et al. Purification and characterization of lactate dehydrogenase isoenzymes 1 and 2 from Molinema dessetae （Nematoda：Filarioidea）[J]. Parasitol Res，1996，82（8）：672-680.

[3] LI P F， JIN S Y， HUANG L， et al. Purification and properties of a monomeric lactate dehydrogenase from yak Hypoderma sinense larva[J]. Exp Parasitol，2013，134（2）：190-194.

[4] MOUNAJI K， VLASSI M， ERRAISS N E， et al. In vitro effect of metal ions on the activity of two amphibian glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases： potential metal binding sites[J]. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2003，135（2）：241-254.

[5] WAI L，CHONG K， HO W S. Influence of heavy metals on Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase interactions in Chironomus riparius larvae[J]. Environ Toxicol Chem，2013，32（8）：1882-1887.

[6] OTRANTO D， COLWELL D D， TRAVERSA D， et al. Species identification of Hypoderma affecting domestic and wild ruminants by morphological and molecular characterization[J]. Med Vet Entomol，2003，17（3）：316-325.

[7] 劉浩浩，李玉萍，黃志宏，等.牦牛牛皮蠅幼蟲的快速PCR-RFLP鑒定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2012，51（7）：1477-1480.

[8] GUZIK U， HUPERT-KOCUREK K， SALEK K， et al. Influence of metal ions on bioremediation activity of protocatechuate 3，4-dioxygenase from Stenotrophomonas maltophilia KB2[J]. World J Microbiol Biotechnol，2013，29（2）：267-273.

[9] KARLSEN R L， N？覫RGAARD L， GULDBRANDSEN E B. A rapid method for the determination of urea stable lactate dehydrogenase on the 'Cobas Bio' centrifugal analyser[J]. Scand J Clin Lab Invest，1981，41（5）：513-516.

[10] SANFORD K J， MEYER D J， MATHISON M J， et al. Selective inactivation of lactate dehydrogenase isoenzymes with ionic surfactants[J]. Biochemistry，1981，20（11）：3207-3214.

[11] 蔣本國，劉長建，張 樂，等.金屬離子對LDH的抑制作用與底物對其保護作用研究[J].高師理科學刊，2010，30（4）：80-83.

[12] 汪勛清，高小霞.二價金屬離子影響乳酸脫氫酶活性的單掃伏安研究[J].高等學?；瘜W學報，1998，19（4）：543-546.

[13] BRAUN T. The effect of divalent cations on bovine spermatozoal adenylate cyclase activity[J]. J Cyclic Nucleotide Res， 1975，1（6）：271-281.

[14] VAN BASTELAERE P B， CALLENS M， VANGRYSPERRE W A， et al. Binding characteristics of Mn2+， Co2+ and Mg2+ ions with several D-xylose isomerases[J]. Biochem J，1992，286（Pt3）：729-735.

[15] DEDDISH P A， SKIDGEL R A， ERDO S E G. Enhanced Co2+ activation and inhibitor binding of carboxypeptidase M at low pH. Similarity to carboxypeptidase H （enkephalin convertase）[J].Biochem J，1989，261（1）：289-291.

[16] OHSHIMA N，YAMASHITA S，TAKAHASHI N，et al.Escherichia coli cytosolic glycerophosphodiester phosphodiesterase （UgpQ） requires Mg2+，Co2+，or Mn2+ for its enzyme activity[J]. J Bacteriol，2008，190（4）：1219-1223.