董 剛 張豐雷 李 冰

牙髓病治療的成功與否在很大程度上依賴于根管充填材料的生物性能。作為長期存留于口腔內(nèi)的治療材料，其生物性能的優(yōu)劣對(duì)于牙髓病的成功治療及預(yù)后、患牙保存、口腔健康具有重要意義。理想的根充材料應(yīng)具有以下性能：①良好的組織相容性；②無細(xì)胞毒性；③良好的封閉性能；④具有誘導(dǎo)牙髓再生的能力[1]。常用的治療材料主要有氫氧化鈣制劑、抗生素糊劑、羥磷灰石制劑、玻璃離子、銀汞合金等[2]。但至今為止尚未有一種材料能全部符合上述理想要求，諸多學(xué)者都致力于對(duì)口腔材料的生物性能的研究，以期研制出生物相容性更好的、更具生物活性的治療牙髓根尖周病的口腔材料。

應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)材料進(jìn)行細(xì)胞水平及分子水平生物活性的檢測已被公認(rèn)為是評(píng)價(jià)材料生物性能的一種重要手段。人牙髓細(xì)胞(human dental Pulp Cells，HDPCs)是牙髓病治療材料作用的直接效應(yīng)細(xì)胞，易于體外培養(yǎng)獲得[3]，其中含有一定數(shù)目的人牙髓干細(xì)胞，其增殖和分化能力很強(qiáng)，它們對(duì)材料的反應(yīng)在一定程度上可以說明材料的性能。

光固化氫氧化鈣、三氧化礦物聚合體(MTA)、光固化玻璃離子是三種應(yīng)用廣泛的牙髓根尖周病治療材料，本課題分別用以上三種材料浸提液體外培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞，檢測材料對(duì)細(xì)胞增殖的影響，從而研究材料的生物相容性及生物活性。

1. 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料來源 培養(yǎng)第5 代的人牙髓細(xì)胞(本實(shí)驗(yàn)室保存)用做細(xì)胞增殖試驗(yàn)，培養(yǎng)第3 代人牙髓細(xì)胞做細(xì)胞分化試驗(yàn)。

1.1.2 主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(LAB 公司，美國)、倒置相差顯微鏡(Olympus 公司，日本)、超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)公司)、離心機(jī)(安亭科學(xué)儀器公司)、塑料培養(yǎng)皿(海門市康泰實(shí)驗(yàn)器材廠)、細(xì)胞培養(yǎng)瓶(浙江所華醫(yī)用塑料有限公司)、培養(yǎng)板(Costar 公司，美國)、酶標(biāo)儀(BIO-TEK 公司，美國)。

1.1.3 主要試劑 DMEM (Gibco 公司，美國)、胎牛血清(杭州四季青生物材料有限公司)、青鏈霉素雙抗(Sigma 公司，美國)、PBS(Gibco 公司，美國)、D-Hanks(Sigma 公司，美國)、胰蛋白酶(Sigma 公司，美國)、EDTA-2 鈉、MTT(Sigma 公司，美國)等。

1.1.4 主要試劑的配制 參照文獻(xiàn)[4]制備各生物材料的浸提液。

(1) 光固化Ca(OH)2浸提液制備 光固化Ca(OH)2粉、液按比例以1∶1 調(diào)制，嚴(yán)密壓制于96 孔板小孔內(nèi)，制成厚度為1mm 的膜片，在5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置24h，固化后取出粉碎，稱取1g 加入10ml 完全培養(yǎng)液，在5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3d，取上清液，配制成標(biāo)準(zhǔn)浸提液，按體積比用含完全培養(yǎng)液稀釋成50%、10%過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)MTA 浸提液的制備 將MTA 粉、液按使用比例以體積比1∶1 調(diào)制，嚴(yán)密壓制于96 孔板小孔內(nèi)，制成厚度為lmm 的膜片，在5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置24h，固化后取出粉碎，稱取1g 加入10ml 完全培養(yǎng)液，在5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3d，取上清液，配制成標(biāo)準(zhǔn)浸提液，按體積比用含完全培養(yǎng)液稀釋成50%、10%過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)光固化玻璃離子浸提液的制備 取少許LGIC 粉末，加入碘仿，丁香油酚調(diào)制成糊劑，壓制于96 孔板小孔內(nèi)，制成厚度為lmm 小膜片，在5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置24h，取出粉碎，稱取lg 加入10ml 完全培養(yǎng)液，在5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3d，取上清液，配制成標(biāo)準(zhǔn)浸提液，按體積比用含完全培養(yǎng)液稀釋成50%、10%過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(4)MTT 測試 50mg MTT+10ml PBS，混勻后過濾除菌，分裝，4℃冰箱避光保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

1.2.2 MTT 法 試驗(yàn)分組如下：hDPCs 實(shí)驗(yàn)組(1)10%Ca(OH)2浸提液組；(2)50%Ca(OH)2浸提液組；(3)100%Ca(OH)2浸提液組； (4)10%MTA 浸提液組；(5)50%MTA 浸提液組；(6)100%MTA 浸提液組；(7)10%LGIC 浸提液組；(8)50%LGIC 浸提液組；(9)100%LGIC 浸提液組、空白對(duì)照組為完全培養(yǎng)液組。

測定不同濃度的各種材料浸提液對(duì)hDPCs 增殖的影響，步驟如下：(1)取第5 代生長良好的hDPCs，等量接種于4 塊96 孔板中，接種細(xì)胞密度為2×104個(gè)／ml，每塊板分為10 組，每組5孔，每孔100μl，在5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)培養(yǎng)24h 后換液：吸凈原培養(yǎng)液及懸浮的未貼壁細(xì)胞，每孔分別加入對(duì)應(yīng)的各組溶液200μl，在5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每3d 換液1 次。(3)在培養(yǎng)的第2d、4d、6d、8d 測量細(xì)胞增殖活性。(4)取出培養(yǎng)板，每孔加入MTT 20μl，在5%CO2、37℃濃度的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h。(5)棄去孔內(nèi)液體，每孔加入150μl DMSO，振蕩5min。(6)酶標(biāo)儀測定各孔的OD 值，波長490 nm，每塊板測3 次，取平均值做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS l3.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各數(shù)據(jù)間的差異顯著性用t檢測，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2. 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞與不同材料浸提液接觸培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)的變化，參照文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[5]對(duì)細(xì)胞毒性等級(jí)按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類(見表1)。

表1 細(xì)胞形態(tài)觀察分析毒性等級(jí)細(xì)胞形態(tài)

以完全培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照，發(fā)現(xiàn)各濃度Ca(OH)2浸提液均屬于中度毒性，100%MTA、50%MTA 浸提液、100%LGIC、50%LGIC 屬于輕度毒性，10%MTA 組與10%LGIC 浸提液組均屬于無毒性。

2.2 細(xì)胞增殖分析 三種材料浸提液對(duì)細(xì)胞增殖作用(MTT 法)人hDPCs 在不同材料浸提液培養(yǎng)下增殖變化(見表2)。

2.2.1 比較浸提液濃度相同的三種根充材料對(duì)細(xì)胞增殖的影響 統(tǒng)計(jì)分析表明，與完全培養(yǎng)液組(對(duì)照)相比，當(dāng)材料浸提液濃度同為10%和50%時(shí)，在復(fù)合培養(yǎng)的第2d，各個(gè)組之間OD 值無明顯差別，第4d，第6d 和第8d，Ca(OH)2組細(xì)胞OD 值均低于完全培養(yǎng)組(對(duì)照組)(P＜0.05)；各時(shí)間點(diǎn)MTA 組、LGIC 組與空白對(duì)照組之間OD 值的差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；當(dāng)材料浸提液濃度均為100%時(shí)，第2、4、6、8d，Ca(OH)2組細(xì)胞OD 值均低于完全培養(yǎng)組(對(duì)照組)，而MTA 組、LGIC 組與空白對(duì)照組之間OD 值比較無統(tǒng)計(jì)意義(P＞0.05)。

2.2.2 比較三種根充材料浸提液濃度變化對(duì)細(xì)胞增殖的影響 材料浸提液在低濃度時(shí)就能影響細(xì)胞的增殖說明該材料毒性較強(qiáng)，而高濃度的材料浸提液對(duì)細(xì)胞的增殖影響甚小說明該材料無毒性或毒性很小，本研究以低濃度浸提液(10%)為對(duì)照，在相同時(shí)間點(diǎn)與另外兩種高濃度浸提液(50%與100%)統(tǒng)計(jì)分析表明，三種材料不同濃度浸提液第2、4、6、8d 細(xì)胞的OD 值無明顯差異(P＞0.05)，說明三種材料浸提液濃度的變化對(duì)細(xì)胞的增殖的無明顯影響。

2.2.3 細(xì)胞對(duì)材料增殖敏感性的比較 分別比較三種材料各濃度浸提液培養(yǎng)下，第2、4、6、8d 細(xì)胞OD 值的大小。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明hDPCs 分別與三種材料浸提液接觸培養(yǎng)后，各時(shí)間點(diǎn)OD 值大小差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說明三種材料在實(shí)際應(yīng)用中或?qū)嶒?yàn)中在與細(xì)胞接觸時(shí)，對(duì)hDPCs 的增殖敏感性影響無明顯差別。

3. 討論

在牙髓病的治療中，通常需要治療材料與周圍的組織直接接觸，因此治療材料的性能對(duì)于牙髓病的成功及預(yù)后、患牙保存、口腔健康具有重要意義。

隨著對(duì)牙髓根尖周病的深入研究以及口腔材料學(xué)的發(fā)展，各種生物材料不斷涌現(xiàn)。生物材料不僅要符合生物安全性的要求，同時(shí)還應(yīng)該具有良好的生物相容性和生物活性。Ca(OH)2、MTA、LGIC可應(yīng)用于直接蓋髓、活髓切斷、髓室底穿孔修補(bǔ)、根管側(cè)穿修補(bǔ)、根尖誘導(dǎo)形成、根尖倒充填等多個(gè)治療領(lǐng)域[6-10]。體外研究Ca(OH)2、MTA、LGIC三種牙髓病治療材料對(duì)牙髓細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及它們的生物活性，探討它們作用的機(jī)制，為進(jìn)一步全面深入地認(rèn)識(shí)這三種材料的生物性能提供理論依據(jù)，也為開發(fā)更具生物活性的牙髓治療材料奠定理論基礎(chǔ)。

表2 不同濃度的各種材料浸提液對(duì)hDPCs 增殖的影響(MTTOD值)(n=5，±s)

表2 不同濃度的各種材料浸提液對(duì)hDPCs 增殖的影響(MTTOD值)(n=5，±s)

*代表在同等時(shí)間段，該組數(shù)據(jù)與完全培養(yǎng)組(對(duì)照組)相比差異顯著

分組 2d 4d 6d 8d 10%Ca(OH)2 0.325±0.042 0.038±0.032* 0.366±0.045* 0.510±0.034*50%Ca(OH)2 0.302±0.033 0.036±0.030* 0.423±0.064* 0.510±0.031*100%Ca(OH)2 0.257±0.025* 0.295±0.047* 0.302±0.031* 0.385±0.024*10%MTA 0.320±0.034 0.492±0.047 0.774±0.042 0.997±0.054 50%MTA 0.353±0.022 0.459±0.045 0.720±0.070 0.935±0.047 100%MTA 0.331±0.047 0.447±0.051 0.709±0.041 0.924±0.039 10%LGIC 0.354±0.027 0.497±0.031 0.761±0.042 0.904±0.050 50%LGIC 0.330±0.044 0.448±0.055 0.735±0.064 0.903±0.028 100%LGIC 0.337±0.053 0.421±0.060 0.622±0.033 0.852±0.021完全培養(yǎng)液組 0.342±0.041 0.511±0.062 0.786±0.042 1.003±0.036

hDPCs 是牙髓組織中的功能細(xì)胞，在牙髓的治療中通常與直接對(duì)材料的生物作用作出反應(yīng)，因此常作為牙髓生物學(xué)、藥理學(xué)和毒理學(xué)等研究領(lǐng)域中的研究對(duì)象[11]。

用MTT 法對(duì)細(xì)胞的增殖進(jìn)行檢測。MTT 法檢測結(jié)果顯示，各濃度的Ca(OH)2對(duì)hDPCs 的增殖有明顯的抑制，而MTA 與LGIC 對(duì)hDPCs 的增殖抑制輕微，浸提液濃度增大時(shí)未出現(xiàn)抑制增強(qiáng)。從材料浸提液對(duì)細(xì)胞增殖的抑制程度來看，Ca(OH)2對(duì)細(xì)胞增殖抑制較明顯，而MTA 與LGIC 對(duì)細(xì)胞的增殖無明顯抑制，材料的生物相容性較好。

本研究通過將三種臨床常用的牙髓治療材料浸提液與體外培養(yǎng)的人hDPCs 接觸培養(yǎng)，從細(xì)胞水平比較其生物相容性和生物活性。結(jié)果表明，Ca(OH)2浸提液對(duì)細(xì)胞的生長抑制較明顯。光固化玻璃離子是一種生物相容性良好的牙髓根尖周病治療材料，但本研究未發(fā)現(xiàn)它有顯著抑制hDPCs 活性的現(xiàn)象。MTA 是一種較有發(fā)展前景的治療材料，不但具有良好的細(xì)胞生物相容性，而且本實(shí)驗(yàn)中也未表現(xiàn)出明顯的抑制hDPCs 細(xì)胞活性的特征，但MTA 的價(jià)格較高，且臨床遠(yuǎn)期療效尚缺乏大量追蹤病例來證明，更重要的是MTA 的作用機(jī)制尚不明確，因此仍需要更多深入的研究。

[1] Atari M，Barajas M，Hernandez-Alfaro F. Isolation of pluripotent stem cells from humanthirdmolar dentalpulp[J].Histology and Histopathology ，2011，26(8):1057-1070

[2] Couble ML，F(xiàn)arges JC，Bleicher F，et a1.Odontoblast differentiation of humandental pulp cells in explant cultures[J].CalcifTissue Int，2000，66(2):129-138

[3] 李曉娜，凌均棨.人牙齦上皮細(xì)胞上清液對(duì)牙髓細(xì)胞增殖及分化影響的研究[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志，2007，5(1): 8-11

[4] 蘇 勤，葉 玲，周學(xué)東.納米羥磷灰石/ 聚酰胺66 對(duì)牙髓細(xì)胞生物學(xué)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2005，23(1):79-83

[5] 奚延裴. 組織工程醫(yī)療產(chǎn)品的安全性評(píng)價(jià)[J]. 現(xiàn)代康復(fù)，2001，5(6):3-15

[6] Peters LB，Van Winkeloff AJ，Buys J F. Effects of instrumentation，irrigation，and dressing with calcium hydroxide on infection in pulpless teeth with periapical bone lesions[J].Int Endod J，2002，35(1):13-21

[7] Gomes JA，Geraldes Monteiro B，Melo GB. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of human immature dental pulp stem cells[J]. Investigative Ophthalmology &Visual Science，2010，51(3):1408-1414

[8] 劉 琨，潘 濤，楊 鵬，等.三種水門汀粘接縱裂磨牙封閉效果的體外研究[J]. 口腔頜面修復(fù)學(xué)雜 志，2013，14(2)：98-102

[9] Eidelman E， Holan G， Fuks AB， et al. Mineral trioxide aggregates VS. formoc-resol in pulpotomized primary molars：a preliminary report [J].Pediatr Dent，2001，23(1):15-18

[10] Arens DE， Torabinejad M. Repair offurcal perforations with miner altrioxideaggregate：two case reports[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral radiol Endod，1996，82(1):84-88

[11] Shiba H，F(xiàn)ujita T，Doi N，et al. Differential effects ofvarious growth factors andcytokines on the syntheses ofDNA，type I collagen，laminin，fibronectin，osteonectin secreted protein，acidic and rich in cysteine(SPARC)， and alkalinephosphatase by human pulp cells in culture[J].Cell Physiol，1998，174(2):194-205