張永清+吳清平

摘要：采用懸液定量殺菌和流動殺菌的方法，對銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、糞鏈球菌（Streptococcus faecium） 和大腸桿菌（Escherichia coli）的臭氧消毒效果進行了研究。結(jié)果表明，懸液定量殺菌試驗中，臭氧濃度0.36 mg/L，作用10 min后，銅綠假單胞菌存活率小于1.0 %；臭氧濃度0.31 mg/L，作用3 min后，糞鏈球菌存活率小于0.1%；臭氧濃度在0.45 mg/L及以上，作用10 min后，大腸桿菌存活率在2.0%以下。流動殺菌試驗中，臭氧濃度0.20～0.60 mg/L，作用3 min后，大腸桿菌、銅綠假單胞菌和糞鏈球菌的存活率在0.01%以下，即殺滅率在99.99%以上。

關(guān)鍵詞：臭氧；消毒；銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）；糞鏈球菌（Streptococcus faecium）；大腸桿菌（Escherichia coli）

中圖分類號：TS201.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）07-1543-03

Killing Effects of Ozone on Pathogens in Mineral Water

ZHANG Yong-qing1，2，3，4，WU Qing-ping1，ZHANG Ju-mei1，GUO Wei-peng1，PENG Fei-ting1，YANG Xiu-hua1

（1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Collection and Application， Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology，

State Key Laboratory of Applied Microbiology （Ministry-Guangdong Province Jointly Breeding Base）， South China， Guangdong Institute of Microbiology， Guangzhou 510070， China； 2. Wuhan Institute of Virology， Chinese Academy of Sciences， Wuhan 430071， China；

3. Graduate University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China；

4. College of Food Science and Engineering， Xuchang University， Xuchang 461000，Henan， China）

Abstract： Both suspension quantitative germicidal test and flow germicidal test were used to study disinfection effects of ozone on the Pseudomonas aeruginosa， Streptococcus faecium and Escherichia coli. The suspension quantitative germicidal test found that the survival rate of Pseudomonas aeruginosa treated with 0.36 mg/L of ozone for 10 min was less than 1.0%， and that of Streptococcus faecium reacted with 0.31 mg/L of ozone for 10 min was less than 0.1%. When the ozone was more than 0.45 mg/L and the time was 10 min， the survival rates of Escherichia coli was under 2.0%. The results of the flow germicidal test showed that the probability of survivability of Escherichia coli， Pseudomonas aeruginosa and Streptococcus faecium treated with 0.20-0.60 mg/L of ozone for 3 min were under 0.01%， with the killing rates of more than 99.99%.

Key words： ozone； disinfection； Pseudomonas aeruginosa； Streptococcus faecium； Escherichia coli

臭氧消毒可迅速殺滅使人和動物致病的各種病菌、病毒等微生物。世界衛(wèi)生組織對其滅菌功效曾歸納比較，臭氧與其他殺菌劑對大腸桿菌的殺滅效果依次為：臭氧（O3）>次氯酸（HClO）>二氧化氯（ClO2）>銀離子（Ag+）>次氯酸根（ClO-）>高鐵離子（Fe3+）>三氯胺（NCl3）。因此，臭氧消毒作為氯消毒的替代方法，在水廠中的應用越來越廣泛。各廠家為了使微生物指標達標不斷加大臭氧投放量，但當原水中有溴離子時，臭氧消毒可以產(chǎn)生消毒副產(chǎn)物溴酸鹽。溴酸鹽是一種2B級潛在致癌物，具有一定DNA和染色體水平的遺傳毒性[1]。因此，利用臭氧消毒時，在微生物達標的情況下還需考慮臭氧消毒副產(chǎn)物溴酸鹽的問題。

《飲用天然礦泉水》（GB8537-2008）國標規(guī)定，除臭氧外，礦泉水在水處理中不允許添任何物質(zhì)進行化學消毒和處理，且消毒副產(chǎn)物溴酸鹽的限量為10 μg/L。因此，隨著中國瓶（桶）裝飲用水尤其是礦泉水的迅猛發(fā)展，原水含有溴化物的企業(yè)必須解決礦泉水中致病菌污染和臭氧消毒副產(chǎn)物溴酸鹽問題。調(diào)查結(jié)果顯示，在一些國家和地區(qū)飲用水均存在溴酸鹽超標問題[2-5]。張永清等[6]對2008年1月至2010年9月《飲用天然礦泉水》國標實施前后礦泉水中銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）及溴酸鹽污染情況進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2008年1月至2009年9月國標實施前，35份（來自13家企業(yè)）水源水和48份（來自20家企業(yè)）成品水中銅綠假單胞菌超標率分別為11.43%和35.42%，520份（來自59家企業(yè)）礦泉水成品水中溴酸鹽超標率為42.12%；2009年10月至2010年9月國標實施后，33份（來自20家企業(yè)）水源水和34份（來自27家企業(yè)）成品水銅綠假單胞菌超標率分別為30.30%和17.65%，105份（來自46家企業(yè)）礦泉水成品水中溴酸鹽超標率為18.10%。國標的實施使礦泉水成品水中銅綠假單胞菌和溴酸鹽超標現(xiàn)象有所好轉(zhuǎn)，但仍然存在。因此，優(yōu)化飲用水臭氧工藝，使之達到既能有效殺滅致病菌又能控制消毒副產(chǎn)物溴酸鹽超標產(chǎn)生的目的，對于飲用水生產(chǎn)具有重要意義。

本研究針對天然礦泉水中的2種致病菌指標銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和糞鏈球菌（Streptococcus faecium），采用懸液定量殺菌試驗和流動殺菌試驗研究了臭氧對二者的殺滅效果，為飲用水生產(chǎn)中致病菌和溴酸鹽的有效控制、進行臭氧消毒工藝的優(yōu)化提供理論基礎(chǔ)。同時對大腸桿菌（Escherichia coli）臭氧殺滅效果也進行了一定的研究，為臭氧消毒技術(shù)的應用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗菌株為大腸桿菌ATCC8099、銅綠假單胞菌ATCC27853和糞鏈球菌ATCC29212，由廣東省微生物研究所微生物檢測新技術(shù)研究發(fā)展中心提供。蠕動泵（蘭格YZ1515x型）購自保定蘭格恒流泵有限公司；臭氧發(fā)生器（OZ-3G型）購自廣州市康利科技有限公司；便攜式臭氧檢測儀（HKM型）購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備 將標準菌株接種新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，用磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋制成菌懸液。

1.2.2 臭氧水的制備 將OZ-3G型臭氧發(fā)生器利用空氣源氧氣產(chǎn)生臭氧，由氣體分散器通入超純水，制備不同濃度的臭氧水。

1.2.3 臭氧濃度的測定 采用國標N，N-二乙基-1，4-苯二胺（DPD）方法（GB11898-89），臭氧與DPD試劑反應，樣品溶液呈紅色，利用便攜式臭氧檢測儀進行檢測。

1.2.4 中和劑鑒定試驗 以大腸桿菌ATCC8099為代表，按《消毒技術(shù)規(guī)范2002》要求，試驗設(shè)計6組，以懸液定量殺菌試驗程序進行中和劑鑒定。試驗結(jié)果，第1組無菌落生長或僅有極少數(shù)菌落生長；第 2組較第1組多，但較第3、4、5組為較少的菌落生長；第3、4、5組有相似量試驗菌落生長，菌懸液濃度在1×107～5×107 CFU/mL，其組間菌落數(shù)誤差率應不超過15%；第6組無菌落生長，表明所用中和劑及其濃度適宜。

1.2.5 懸液定量殺菌試驗 吸取一定濃度的臭氧水4.5 mL于含有0.5 mL菌懸液的無菌試管內(nèi)，用漩渦混合器混合10 s；靜止放置，作用至預定時間；吸取0.5 mL至4.5 mL中和劑試管中混勻，中和作用10 min后取樣液0.5 mL進行10倍稀釋，選擇合適稀釋度取0.5 mL接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)，計算平均存活率。每管接兩個平皿。對照組以4.5 mL無菌水代替臭氧水。試驗重復3次。

平均存活率=M1/M0×100%

式中，M0為對照組平均活菌量，CFU/mL；M1為試驗組平均活菌量，CFU/mL。

1.2.6 流動殺菌試驗 用容量大于3 000 mL的燒杯，盛裝3 000 mL無菌水樣，用移液管滴入制備好的菌懸液，制成含菌量為1×104～2×105 CFU/mL的原溶液進行殺菌試驗，并取樣作為對照，進行活菌計數(shù)。

試驗裝置如圖1所示。含有不同試驗菌的原溶液在蠕動泵的作用下流動經(jīng)過玻璃柱；開啟臭氧發(fā)生器，開始消毒處理，通過調(diào)節(jié)蠕動泵流速控制臭氧接觸時間。待系統(tǒng)穩(wěn)定工作10 min后，在取樣口取樣測定臭氧濃度。另取5 mL溶液作為樣品立刻進行微生物測定：吸取0.5 mL樣品至4.5 mL中和劑試管中混勻，中和作用10 min；中和后取樣液0.5 mL進行10倍稀釋，選擇合適濃度取0.5 mL接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)，計算平均存活率。試驗重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 中和劑鑒定試驗結(jié)果

試驗證明（表1），含硫代硫酸鈉5 g/L的PBS 溶液組間菌落總數(shù)誤差為8.58%，小于15%的要求，符合濃度為0.56 mg/L的臭氧中和劑的要求。

2.2 懸液定量殺菌試驗結(jié)果

對照組平均菌數(shù)，大腸桿菌為1.31×106 CFU/mL，銅綠假單胞菌為2.3×105 CFU/mL，糞鏈球菌為8.5×105 CFU/mL。懸液定量殺菌試驗結(jié)果（圖2-圖4）表明，隨臭氧濃度的增加和接觸時間的延長微生物的存活率降低。當臭氧濃度低于0.30 mg/L，接觸時間10 min時，臭氧的殺滅效果從強到弱依次為大腸桿菌、銅綠假單胞菌、糞鏈球菌，其存活率糞鏈球菌最大（75.55%）。說明臭氧濃度低于0.30 mg/L時，作用10 min對這3種微生物殺滅效果不好。

接觸時間10 min時，臭氧濃度為0.55 mg/L，大腸桿菌存活率在2.00%以下；而臭氧濃度為0.50 mg/L，銅綠假單胞菌和糞鏈球菌存活率均小于0.10%。對于銅綠假單胞菌，臭氧濃度在0.36 mg/L，接觸10 min存活率即小于1.00 %。對于糞鏈球菌，臭氧濃度在0.31 mg/L，臭氧作用3 min即可使其存活率小于0.10%。

2.3 流動殺菌試驗結(jié)果

用去離子水作為無菌水樣配制的原溶液中，大腸桿菌ATCC8099、銅綠假單胞菌ATCC27853和糞鏈球菌ATCC29212的對照組平均菌數(shù)分別為1.21×104、1.12×104和1.71×105（CFU/mL）。流動殺菌試驗結(jié)果表明，接觸時間為3、5或10 min，去離子水配制原溶液中臭氧濃度在0.20～0.60 mg/L時，臭氧對大腸桿菌、銅綠假單胞菌和糞鏈球菌的存活率在0.01%以下，即殺滅率均在99.99%以上。

3 小結(jié)與討論

銅綠假單胞菌又稱為綠膿桿菌，單生鞭毛，運動活潑，無芽胞，專性需氧的革蘭氏陰性桿菌，為條件致病菌。在自然界分布廣泛，存在于水、土壤、空氣以及人和動物皮膚及腸道中，為食品的主要污染源之一[7]。近年來，飲用天然礦泉水銅綠假單胞菌污染情況日漸受到重視，2009年10月1日開始實施的飲用天然礦泉水新國標中，該菌已被列入新增加的3種致病菌之一（GB8537-2008）。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，礦泉水水源水和成品水均存在銅綠假單胞菌污染現(xiàn)象[6，8]，國標實施后水源水污染為造成成品水污染的主要原因[6]。因此，應加強銅綠假單胞菌的污染控制。銅綠假單胞菌的懸液定量殺菌試驗結(jié)果顯示， 0.50 mg/L濃度臭氧殺滅3 min時，其存活率為0.02%，與糞鏈球菌效果相似；0.36 mg/L濃度的臭氧殺滅10 min時，銅綠假單胞菌存活率小于1.00%。糞鏈球菌的懸液定量殺菌試驗結(jié)果表明，0.31 mg/L濃度的臭氧殺滅3 min即可使其存活率小于0.10%。流動殺菌試驗表明，0.20～0.60 mg/L臭氧作用3 min時銅綠假單胞菌的存活率即小于0.01%。結(jié)合礦泉水臭氧消毒中溴酸鹽的形成研究結(jié)果[9]，對于礦泉水中的致病菌銅綠假單胞菌和糞鏈球菌，消毒過程中控制致病菌和溴酸鹽的最佳臭氧濃度為0.3～0.4 mg/L，臭氧接觸時間小于5 min。

懸液定量殺菌試驗發(fā)現(xiàn)，當臭氧濃度在0.30 mg/L以上時，3種菌對臭氧的抗性從大到小依次為大腸桿菌、銅綠假單胞菌和糞鏈球菌。作用10 min，0.55 mg/L濃度臭氧時，大腸桿菌存活率在2.00%以下，而銅綠假單胞菌和糞鏈球菌在臭氧濃度0.50 mg/L時存活率均小于0.10%。因此，臭氧應用于大腸桿菌的消毒殺菌時，為了取得較好的殺菌效果，其濃度要高于0.40 mg/L，作用時間要大于5 min。

參考文獻：

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[9] 張永清. 包裝飲用水臭氧滅菌機理及其消毒副產(chǎn)物溴酸鹽控制技術(shù)研究[D]. 武漢：中國科學院武漢病毒研究所，2011.

2.3 流動殺菌試驗結(jié)果

用去離子水作為無菌水樣配制的原溶液中，大腸桿菌ATCC8099、銅綠假單胞菌ATCC27853和糞鏈球菌ATCC29212的對照組平均菌數(shù)分別為1.21×104、1.12×104和1.71×105（CFU/mL）。流動殺菌試驗結(jié)果表明，接觸時間為3、5或10 min，去離子水配制原溶液中臭氧濃度在0.20～0.60 mg/L時，臭氧對大腸桿菌、銅綠假單胞菌和糞鏈球菌的存活率在0.01%以下，即殺滅率均在99.99%以上。

3 小結(jié)與討論

銅綠假單胞菌又稱為綠膿桿菌，單生鞭毛，運動活潑，無芽胞，專性需氧的革蘭氏陰性桿菌，為條件致病菌。在自然界分布廣泛，存在于水、土壤、空氣以及人和動物皮膚及腸道中，為食品的主要污染源之一[7]。近年來，飲用天然礦泉水銅綠假單胞菌污染情況日漸受到重視，2009年10月1日開始實施的飲用天然礦泉水新國標中，該菌已被列入新增加的3種致病菌之一（GB8537-2008）。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，礦泉水水源水和成品水均存在銅綠假單胞菌污染現(xiàn)象[6，8]，國標實施后水源水污染為造成成品水污染的主要原因[6]。因此，應加強銅綠假單胞菌的污染控制。銅綠假單胞菌的懸液定量殺菌試驗結(jié)果顯示， 0.50 mg/L濃度臭氧殺滅3 min時，其存活率為0.02%，與糞鏈球菌效果相似；0.36 mg/L濃度的臭氧殺滅10 min時，銅綠假單胞菌存活率小于1.00%。糞鏈球菌的懸液定量殺菌試驗結(jié)果表明，0.31 mg/L濃度的臭氧殺滅3 min即可使其存活率小于0.10%。流動殺菌試驗表明，0.20～0.60 mg/L臭氧作用3 min時銅綠假單胞菌的存活率即小于0.01%。結(jié)合礦泉水臭氧消毒中溴酸鹽的形成研究結(jié)果[9]，對于礦泉水中的致病菌銅綠假單胞菌和糞鏈球菌，消毒過程中控制致病菌和溴酸鹽的最佳臭氧濃度為0.3～0.4 mg/L，臭氧接觸時間小于5 min。

懸液定量殺菌試驗發(fā)現(xiàn)，當臭氧濃度在0.30 mg/L以上時，3種菌對臭氧的抗性從大到小依次為大腸桿菌、銅綠假單胞菌和糞鏈球菌。作用10 min，0.55 mg/L濃度臭氧時，大腸桿菌存活率在2.00%以下，而銅綠假單胞菌和糞鏈球菌在臭氧濃度0.50 mg/L時存活率均小于0.10%。因此，臭氧應用于大腸桿菌的消毒殺菌時，為了取得較好的殺菌效果，其濃度要高于0.40 mg/L，作用時間要大于5 min。

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[9] 張永清. 包裝飲用水臭氧滅菌機理及其消毒副產(chǎn)物溴酸鹽控制技術(shù)研究[D]. 武漢：中國科學院武漢病毒研究所，2011.

2.3 流動殺菌試驗結(jié)果

用去離子水作為無菌水樣配制的原溶液中，大腸桿菌ATCC8099、銅綠假單胞菌ATCC27853和糞鏈球菌ATCC29212的對照組平均菌數(shù)分別為1.21×104、1.12×104和1.71×105（CFU/mL）。流動殺菌試驗結(jié)果表明，接觸時間為3、5或10 min，去離子水配制原溶液中臭氧濃度在0.20～0.60 mg/L時，臭氧對大腸桿菌、銅綠假單胞菌和糞鏈球菌的存活率在0.01%以下，即殺滅率均在99.99%以上。

3 小結(jié)與討論

銅綠假單胞菌又稱為綠膿桿菌，單生鞭毛，運動活潑，無芽胞，專性需氧的革蘭氏陰性桿菌，為條件致病菌。在自然界分布廣泛，存在于水、土壤、空氣以及人和動物皮膚及腸道中，為食品的主要污染源之一[7]。近年來，飲用天然礦泉水銅綠假單胞菌污染情況日漸受到重視，2009年10月1日開始實施的飲用天然礦泉水新國標中，該菌已被列入新增加的3種致病菌之一（GB8537-2008）。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，礦泉水水源水和成品水均存在銅綠假單胞菌污染現(xiàn)象[6，8]，國標實施后水源水污染為造成成品水污染的主要原因[6]。因此，應加強銅綠假單胞菌的污染控制。銅綠假單胞菌的懸液定量殺菌試驗結(jié)果顯示， 0.50 mg/L濃度臭氧殺滅3 min時，其存活率為0.02%，與糞鏈球菌效果相似；0.36 mg/L濃度的臭氧殺滅10 min時，銅綠假單胞菌存活率小于1.00%。糞鏈球菌的懸液定量殺菌試驗結(jié)果表明，0.31 mg/L濃度的臭氧殺滅3 min即可使其存活率小于0.10%。流動殺菌試驗表明，0.20～0.60 mg/L臭氧作用3 min時銅綠假單胞菌的存活率即小于0.01%。結(jié)合礦泉水臭氧消毒中溴酸鹽的形成研究結(jié)果[9]，對于礦泉水中的致病菌銅綠假單胞菌和糞鏈球菌，消毒過程中控制致病菌和溴酸鹽的最佳臭氧濃度為0.3～0.4 mg/L，臭氧接觸時間小于5 min。

懸液定量殺菌試驗發(fā)現(xiàn)，當臭氧濃度在0.30 mg/L以上時，3種菌對臭氧的抗性從大到小依次為大腸桿菌、銅綠假單胞菌和糞鏈球菌。作用10 min，0.55 mg/L濃度臭氧時，大腸桿菌存活率在2.00%以下，而銅綠假單胞菌和糞鏈球菌在臭氧濃度0.50 mg/L時存活率均小于0.10%。因此，臭氧應用于大腸桿菌的消毒殺菌時，為了取得較好的殺菌效果，其濃度要高于0.40 mg/L，作用時間要大于5 min。

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[9] 張永清. 包裝飲用水臭氧滅菌機理及其消毒副產(chǎn)物溴酸鹽控制技術(shù)研究[D]. 武漢：中國科學院武漢病毒研究所，2011.