劉萌萌，張根葆，魏 麗，閔志雪

(1.鄭州市第三人民醫(yī)院 病理科,河南 鄭州 450000;2.皖南醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

近幾年來(lái),我國(guó)甲狀腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最常見(jiàn)的甲狀腺癌，腫瘤生長(zhǎng)相對(duì)其他類型較緩慢，瘤細(xì)胞分化較好，預(yù)后較好，但局部淋巴結(jié)早期轉(zhuǎn)移率高。雖然頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與病死率無(wú)關(guān)，但相關(guān)報(bào)道顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對(duì)長(zhǎng)期預(yù)后有重要影響[1]。目前，對(duì)甲狀腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不清楚。近幾年發(fā)現(xiàn)，腫瘤間質(zhì)是腫瘤細(xì)胞賴以生存的“土壤”，是腫瘤-宿主相互作用的微環(huán)境，在腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到尤為重要的作用[2]。

成纖維細(xì)胞激活蛋白(fibroblast activation protein，F(xiàn)AP)屬于絲氨酸蛋白酶家族，特異性表達(dá)于胚胎間葉組織及上皮癌間質(zhì)的成纖維細(xì)胞上，存在于多種惡性上皮性腫瘤的間質(zhì)中，具有內(nèi)肽酶和膠原酶的活性，可以水解基質(zhì)中二肽酶Ⅵ底物、明膠以及Ⅰ型膠原，降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫離，具有促遷移、血管生成作用[3]，在腫瘤間質(zhì)的重塑過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，參與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。因此其特異性的抑制劑也為腫瘤治療新靶點(diǎn)提供了有前景的參考。但 FAP在 PTC間質(zhì)中是否具有上述作用，具體的病理機(jī)制如何仍不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)就 FAP 在 PTC間質(zhì)中的表達(dá)及其臨床意義進(jìn)行研究探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 收集鄭州市第三人民醫(yī)院病理科2010年1月～2013年10月診斷為甲狀腺乳頭狀癌的標(biāo)本共66例，男36例，女30例，年齡24～68歲，平均年齡(47.3±8.4)歲。TNM分期，Ⅰ期20例，Ⅱ期22例，Ⅲ期18例，Ⅳ期6例[根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)和國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)甲狀腺癌第七版分期]。區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性20例，陰性46例。10例正常甲狀腺組織作為對(duì)照。所有標(biāo)本均經(jīng)4%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片。常規(guī)行蘇木精-伊紅染色，普通鏡檢。

1.2 主要試劑 通用型SP法檢測(cè)試劑盒(福州邁新生物制劑有限公司)，兔抗人FAP多克隆抗體(Abcam公司)。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組織化學(xué)SP法，主要步驟為切片脫蠟至水，切片在室溫下經(jīng)3% H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶30 min；一抗FAP(濃度1∶100)室溫孵育1 h；標(biāo)記二抗室溫孵育20 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封固。

1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 免疫反應(yīng)性：在高倍鏡下觀察，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞記為0分，陽(yáng)性細(xì)胞少于10%記為1分，10%～50%記為2分，50%～100%記為3分。染色強(qiáng)度：無(wú)染色記為0分；400倍鏡下染色明顯記為1分；100倍鏡下染色明顯，40倍鏡下染色不明顯記為2分；40倍鏡下染色明顯記為3分。免疫反應(yīng)性和染色強(qiáng)度相加得到染色指數(shù)：0分為無(wú)表達(dá)(-)，1～2分為低表達(dá)(+)，3～4分為中表達(dá)()，5～6分為高表達(dá)()。為了避免誤差，由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理診斷醫(yī)師雙盲判定結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SSPS 16.0進(jìn)行定性資料的χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FAP在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá) FAP在正常甲狀腺間質(zhì)及PTC癌細(xì)胞中不表達(dá)；在甲狀腺乳頭狀癌周圍間質(zhì)成纖維細(xì)胞胞漿中表達(dá)，呈棕黃色(見(jiàn)圖1，A、B、C的FAP表達(dá)分別為弱陽(yáng)性、陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性)。在66例甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本中，57例表達(dá)FAP，陽(yáng)性率為86.36%。

2.2 與臨床病理特征的關(guān)系 如表1所示，TNM分期為Ⅰ期病人FAP表達(dá)多為弱表達(dá)，陽(yáng)性率為50%；Ⅱ期病人FAP表達(dá)多為弱表達(dá)和中表達(dá)，陽(yáng)性率為91%；Ⅲ期病人 FAP 表達(dá)多為中表達(dá)，陽(yáng)性率為94%；Ⅳ期病人FAP表達(dá)多為強(qiáng)表達(dá)，陽(yáng)性率為100%。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的 PTC 間質(zhì)中 FAP 表達(dá)陽(yáng)性率分別為95%和57%，其中前者多為中～強(qiáng)表達(dá)，而后者多為弱～中表達(dá)(表2)。由此可見(jiàn)，隨著甲狀腺惡性程度的增強(qiáng)，F(xiàn)AP 表達(dá)逐漸增強(qiáng)，同時(shí)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示 FAP 表達(dá)與TNM分期(χ2=20.823，P<0．01，見(jiàn)表1)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=11.853，P<0．01，見(jiàn)表2)有關(guān)。提示 FAP 的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

A：弱陽(yáng)性 B:陽(yáng)性 C:強(qiáng)陽(yáng)性

圖1 FAP在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)

Fig 1 Expression of FAP in stromal fibroblasts of PTC

表1 甲狀腺乳頭狀癌中FAP表達(dá)與TNM分期的關(guān)系

Tab l Relationship between FAP protein expression and TNM in PTC

TNM分期例數(shù)FAP表達(dá)-+ χ2值P值Ⅰ期206104020．823<0．001Ⅱ期222884Ⅲ期181278Ⅳ期60114

表2 甲狀腺乳頭狀癌中FAP表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

Tab 2 Relationship between FAP protein expression and lymph node metastasis in PTC

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)FAP表達(dá)-+ χ2值P值陽(yáng)性20128911．853<0．001陰性46819127

3 討論

近幾年發(fā)現(xiàn)，腫瘤間質(zhì)是腫瘤細(xì)胞賴以生存的“土壤”，是腫瘤-宿主相互作用的微環(huán)境，在腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到尤為重要的作用[2]。隨著腫瘤的進(jìn)展，F(xiàn)AP表達(dá)增多、降解ECM的能力增強(qiáng)，導(dǎo)致ECM重塑以至基底膜被破壞，為腫瘤細(xì)胞的遷移打開通道，最終腫瘤細(xì)胞沿著ECM間隙和基底膜缺損向遠(yuǎn)處侵襲生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移[4-5]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用免疫組織化學(xué) SP 法檢測(cè)了FAP在PTC和正常甲狀腺組織間質(zhì)中的表達(dá)，并探討其可能機(jī)制。研究結(jié)果顯示 FAP在甲狀腺乳頭狀癌間質(zhì)中成纖維細(xì)胞中表達(dá)，陽(yáng)性率為 86.36%；而在正常甲狀腺間質(zhì)中不表達(dá)。甲狀腺乳頭狀癌間質(zhì)中 FAP 表達(dá)與腫瘤 TNM 分期 (χ2=20.823，P<0.01 ) 及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 (χ2=11.853，P<0.01) 有關(guān)。隨著甲狀腺惡性程度和侵襲能力的增強(qiáng)，PTC間質(zhì)中FAP表達(dá)增強(qiáng)，提示了FAP的表達(dá)參與促纖維增生性間質(zhì)反應(yīng)[6]，與甲狀腺乳頭狀癌的演進(jìn)有一定關(guān)系，提示PTC間質(zhì)中FAP的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。

FAP可選擇性地表達(dá)于90%以上的惡性上皮腫瘤(肺癌、乳腺癌、大腸癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌等)和某些肉瘤的間質(zhì)中激活的成纖維細(xì)胞，而在良性腫瘤和大部分正常成熟組織不表達(dá)，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移涉及細(xì)胞的粘附、遷移和EMC的降解，而FAP具有溶解明膠變性的Ⅰ型和Ⅲ型膠原的活性，因此FAP可能在降解EMC蛋白、細(xì)胞的粘附、遷移中起著顯著的作用。FAP還是黑色素瘤形成的不同階段的間質(zhì)細(xì)胞增生的標(biāo)記，臨床研究也表明，腫瘤間質(zhì)高表達(dá)FAP的結(jié)腸癌病人更容易出現(xiàn)病灶轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的可能性[3]。FAP可能通過(guò)不同的途徑在甲狀腺乳頭狀癌的ECM重塑過(guò)程中起“tilling the soil”作用。FAP可以直接溶解與其臨近的細(xì)胞外基質(zhì)或激活另一種蛋白酶原間接溶解EMC;解離與基質(zhì)蛋白結(jié)合的生長(zhǎng)因子，使之發(fā)揮促生長(zhǎng)作用；FAP可以與CD26、整合蛋白α3β1及尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑(uPAR)形成膜復(fù)合物[7]，參與黑色素細(xì)胞瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移，因此推測(cè)甲狀腺乳頭狀癌中FAP可能通過(guò)形成膜復(fù)合物增加成纖維細(xì)胞的粘附性、遷移性和侵襲性，使成纖維細(xì)胞募集到腫瘤區(qū)域，參與ECM重建。Aimes等報(bào)道TGF-β1和FAP共同參與肺腺癌、宮頸癌及子宮內(nèi)膜癌腫瘤間質(zhì)的重建[8]，Cai F等報(bào)道FAP可能通過(guò)促血管生成參與胃癌、宮頸癌、乳腺癌的生長(zhǎng)和組織的重建，因此FAP也可能通過(guò)促進(jìn)血管生成參與甲狀腺乳頭狀癌生長(zhǎng)、侵襲及局部轉(zhuǎn)移[9]。林靜報(bào)道[10]腫瘤間質(zhì)的侵襲特性可隨著上皮癌變而同步激活，口腔癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)能特異性地促進(jìn)FAP及MMP-2蛋白表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的重建并促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。由此可見(jiàn)，F(xiàn)AP可能通過(guò)多種途徑參與了甲狀腺乳頭狀癌的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、侵襲及間質(zhì)的重塑。總之，F(xiàn)AP的表達(dá)以某些通路促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。

綜上所述，F(xiàn)AP特異性表達(dá)在甲狀腺乳頭狀癌間質(zhì)成纖維細(xì)胞中，且與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，PTC間質(zhì)中FAP的表達(dá)對(duì) PTC 的侵襲、轉(zhuǎn)移具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值。FAP也有望成為治療甲狀腺乳頭狀癌的新靶點(diǎn)，但有關(guān)FAP基因在甲狀腺癌中的具體作用機(jī)制，仍需進(jìn)行進(jìn)一步地深入研究。

【參考文獻(xiàn)】

[1] 陳孝平.外科學(xué)[M].2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2010:384-385.

[2] RENU K V,ALISON L D,ALEXANDER F，etal.BRAFV600E mutation in papillary thyroid microcarcinoma:a genotype-phenotype correlation[J].Modern Pathology,2013,26 (1):62-70.

[3] 魏麗，董麗，靳占峰，等，成纖維細(xì)胞激活蛋白在小鼠肺纖維化模型中的表達(dá) [J].中國(guó)呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志，2010，9(3)：301-305.

[4] OSKAR K,EROL A,REZA A,etal.Expression of hypoxia-inducible factor 1 alpha in papillary thyroid carcinoma is associated with desmoplastic stromal reaction and lymph node metastasis[J].Virchows Archiv,2013,463(6):795-802.

[5] YUN JC,JAE SL,SO YP,etal.Histomorphological factors in the risk prediction of lymph node metastasis in papillary thyroid carcinoma [J].Histopathology,2013,62(4)：578-588.

[6] KOPEREK O,ASARI R,NIEDERLE B，etal.Desmoplastic stromal reaction in papillary thyroid microcarcinoma[J].Histopathology,2011,58:919-924.

[7] ARTYM VV，KINDZELSKII AL，CHEN WT，etal.Molecular proximity of seprase and the urokinase-type plasminogen activator receptor on malignant melanoma cell membranes:dependence on beta1 integrins and the cytoskeleton[J].Carcinogenesis，2002，23(10):1593-1601.

[8] AIMES RT，ZIJLSTRA A，HOOPER JD，etal.Endothelial cell serine proteases expressed during vascular morphogenesis and angiogenesis [J].Thromb.Haemost,2003，89:561-572.

[9] CAI Fai,LI Zhiyong,WANG Chunting,etal.Short hairpin RNA targeting of fibroblast activation protein inhibits tumor growth and improves the tumor micro environment in a mouse model[J].BMB Rep,2013,46(5):252-257.

[10] 林靜,邢樹忠.口腔癌相關(guān)成纖維細(xì)胞侵襲特性研究 [J].中華全科醫(yī)學(xué),2010，8(10):1213-1214.