駱靖華，王春娥，斯依提尼沙汗·吾滿爾，瑪衣拉·阿不拉克

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，新疆烏魯木齊 830011；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市 人民醫(yī)院檢驗科，江蘇無錫 214231；3.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院藥劑科，新疆烏魯木齊 830054)

世界衛(wèi)生組織報道，在男性不育的病例中，有2.9%為免疫因素造成。在原發(fā)性不育癥和繼發(fā)性不育中，免疫性不育分別占2.7%、4%。自身免疫性睪丸炎是免疫性不育的一個重要因素。自身免疫性睪丸炎是生殖免疫學(xué)疾病中的一種，主要是由于血睪屏障的破壞從而引起精子抗原的暴露，精子對男子是種自身抗原，可引起自體抗體。臨床研究表明，男性血液中的血清抑制素B(serum inhibin B, INHB)和卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)的高低與自身免疫性睪丸炎的進展具有一定的相關(guān)性。椒蒿具有較高食用和藥用價值，其揮發(fā)油有茵香腦、燴烯和香葉烯等多種化合物，具有抗病毒、增強免疫功能的作用[1-2]，還可以清熱祛風(fēng)、利尿，治療風(fēng)寒感冒。目前，國內(nèi)外還沒有關(guān)于椒蒿揮發(fā)油對生殖免疫學(xué)方面的研究報道。本實驗應(yīng)用不同劑量椒蒿揮發(fā)油干預(yù)自身免疫性睪丸炎小鼠模型，觀察睪丸組織的形態(tài)學(xué)變化并檢測血清中INHB和FSH激素的水平，以明確椒蒿對小鼠自身免疫性睪丸炎預(yù)防和治療作用。

1 材料與方法

1.1主要藥品、試劑及儀器椒蒿采于新疆奇臺，揮發(fā)油由新疆科學(xué)院提取[3]；血清INHB檢測試劑盒(美國RD公司，批號：DZE22545573)；血清FSH檢測試劑盒(美國RD公司，批號：DZE22545419)；氯胺酮注射液(江蘇恒瑞制藥公司)；地西泮注射液(江蘇恒瑞制藥公司)；阿托品注射液(天津金耀氨基酸有限公司)；生理鹽水(NS，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供)；EPON812環(huán)氧樹脂(新疆奧寶公司)；其他試劑：蒸餾水、蘇木素、伊紅、生理鹽水、甲醛、乙醇、丙酮、苦味酸等為市售分析純。

1.2實驗動物及分組健康成年雄性BALB/c小鼠150只(10周齡)，體質(zhì)量18～25 g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心(許可證號為SCXK20022001)。

以完全隨機化設(shè)計分為生理鹽水組、模型組及椒蒿低、中、高劑量組。

1.3模型建立、處理及取材生理鹽水組和模型組用生理鹽水灌胃，椒蒿低、中、高劑量組用體積分數(shù)為0.938%、1.875%、3.375%椒蒿揮發(fā)油灌胃(查閱相似文獻，根據(jù)預(yù)實驗動物的耐受程度，確定了3種濃度)，各組劑量均為0.5 mL/只。各組小鼠均灌胃3 d后進行手術(shù)并單側(cè)睪丸注射冰醋酸，均采用腹腔麻醉(氯胺酮+地西泮+阿托品三聯(lián)藥，劑量為0.1 mL/10 g)，仰臥位，固定四肢及尾部，在無菌條件下手術(shù)。切開右側(cè)陰囊，生理鹽水組只進行右側(cè)陰囊切開，不注射冰醋酸即縫合，其余各組小鼠右側(cè)睪丸注射100 mL/L冰醋酸0.03 mL，縫合陰囊。

手術(shù)后繼續(xù)灌胃21 d并在同等條件下飼養(yǎng)至取材時間處死。即分別于術(shù)后3、6、9周取各組10只小鼠摘眼球取血約0.8～1.0 mL，抗凝取血清備用；取非手術(shù)側(cè)睪丸組織制作石蠟切片，進行HE染色，光鏡觀察。

1.4ELISA法檢測血清中INHB和FSH含量的變化將血清和試劑盒室溫平衡30 min，設(shè)標準品10孔(復(fù)孔)，稀釋，最終加樣50 μL；37 ℃溫育30 min，洗滌5次，加酶標試劑；37 ℃溫育30 min，洗滌5次，加顯色劑A液、B液混勻，37 ℃避光溫育30 min，加終止液，以空白孔調(diào)零，450 nm波長測定各孔吸光度(A)值，以標準物的濃度為橫坐標，A值為縱坐標，匯出標準曲線，根據(jù)樣品的A值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

2 結(jié) 果

2.1一般性狀的觀察生理鹽水組小鼠活動自如，進食正常。其余組小鼠術(shù)后前期活動減少，進食量少，隨著術(shù)后時間的延長，活動、進食情況有所恢復(fù)。多次稱量體質(zhì)量，各組小鼠在實驗期間體質(zhì)量均有增長(P<0.05)，而各組與生理鹽水組體質(zhì)量相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1各組小鼠體質(zhì)量的變化

Tab.1 The weight of the mice in each group

組 別造模前術(shù)后3周術(shù)后6周術(shù)后9周生理鹽水組22.86±0.9227.87±0.63*27.87±0.63*32.52±0.59*模型組23.02±0.4727.22±2.73*30.13±1.33*32.73±0.88*椒蒿低劑量組22.68±0.5726.65±0.71*30.43±0.93*32.41±0.85*椒蒿中劑量組23.24±0.6227.23±1.85*30.73±0.85*32.79±0.77*椒蒿高劑量組23.09±0.8826.82±0.80*30.84±0.89*32.84±0.25*

同組中與造模前比較，*P<0.05。

2.2睪丸病理學(xué)觀察結(jié)果生理鹽水組雙側(cè)睪丸體積正常，質(zhì)地飽滿。其余各組術(shù)側(cè)睪丸嚴重萎縮，與周圍組織粘連。模型組及椒蒿低、中劑量組非術(shù)側(cè)睪丸色灰白，質(zhì)軟與生理鹽水組有差別。椒蒿高劑量組的非術(shù)側(cè)睪丸術(shù)后9周顏色紅潤，質(zhì)地飽滿，與生理鹽水組無明顯差別。

光鏡下非手術(shù)側(cè)睪丸組織形態(tài)學(xué)各組結(jié)果為：生理鹽水組睪丸生精小管分布均勻，各級生精細胞排列整齊，結(jié)構(gòu)正常，管腔中有大量精子。模型組術(shù)后3周睪丸生精小管發(fā)生退行性變，由睪丸周圍向中心逐漸加重，術(shù)后6周、9周略有好轉(zhuǎn)。椒蒿低、中劑量組生精小管之間間隙增寬，管內(nèi)生精細胞層減少，排列疏松，有空泡狀結(jié)構(gòu)，病變與模型組相比稍好，椒蒿高劑量組睪丸病變較輕，術(shù)后9周基本恢復(fù)(圖1)。

圖1 術(shù)后9周各組小鼠生精小管的病理變化Fig.1 Pathological changes of semi-niferous tubules 9 weeks after the surgery (HE, ×200)A:生理鹽水組;B:模型組;C:椒蒿低劑量組;D:椒蒿中劑量組;E:椒蒿高劑量組。

2.3血清中INHB和FSH含量的變化術(shù)后3、6、9周，模型組及椒蒿低、中劑量組外周血INHB的含量均低于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，F(xiàn)SH的含量均高于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，椒蒿低、中劑量組INHB的含量均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，F(xiàn)SH的含量均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后6、9周椒蒿高劑量組外周血INHB含量與生理鹽水組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，術(shù)后9周椒蒿高劑量組外周血FSH含量與生理鹽水組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表2、表3)。

表2各組小鼠外周血INHB含量的變化

組別術(shù)后3周術(shù)后6周術(shù)后9周生理鹽水組12.11±1.2711.68±1.5211.41±1.53模型組3.88±0.97*5.76±1.29*6.54±1.37*椒蒿低劑量組7.02±1.22*◇8.10±1.84*◇8.30±1.51*◇椒蒿中劑量組6.84±1.05*◇8.54±1.18*◇8.73±1.53*◇椒蒿高劑量組9.49±0.89*10.14±1.7610.68±1.93

與同時間生理鹽水組比較，*P<0.05；與同時間模型組比較，◇P<0.05。

3 討 論

本實驗觀察結(jié)果顯示椒蒿揮發(fā)油所使用的劑量范圍與血清中的INHB和FSH的含量有密切聯(lián)系。眾所周知，男性生殖系統(tǒng)功能的正常發(fā)揮除了依賴于生殖器官的結(jié)構(gòu)和功能正常外，還與體內(nèi)的內(nèi)分泌系統(tǒng)和一系列細胞因子精細調(diào)節(jié)、共同維持生殖內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)有密切關(guān)系。睪丸的生精功能是男性生殖功能的重要標志，睪丸生精功能主要受下丘腦-垂體-睪丸軸調(diào)控。下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素(gonadotroph-releasing hormone, GnRH)作用于腦垂體使其合成和分泌FSH、LH等，在FSH的作用下，支持細胞等細胞合成并分泌抑制素。INH是Sertoli細胞所分泌的一種激素類蛋白質(zhì)，越來越多的研究表明睪丸中的INH參與了垂體功能的調(diào)節(jié)。INH能夠抑制腺垂體合成和分泌FSH，還可阻斷下丘腦刺激引起的垂體FSH釋放，對FSH的分泌發(fā)揮著極強的負反饋作用。它可以通過抑制FSH終止精子發(fā)生，但不影響睪丸間質(zhì)細胞(leydig cell)分泌睪酮(testosterone, T)[4-6]。

表3各組小鼠外周血FSH含量的變化

組別術(shù)后3周術(shù)后6周術(shù)后9周生理鹽水組20.57±1.4820.61±1.7420.89±2.26模型組46.46±7.02*44.67±6.02*39.15±5.70*椒蒿低劑量組38.95±5.69*◇36.34±7.38*◇32.10±5.60*◇椒蒿中劑量組39.69±3.89*◇36.39±5.11*◇28.18±5.74*◇椒蒿高劑量組33.71±3.89*29.90±4.59*22.34±2.32

與同時間生理鹽水組比較，*P<0.05；與同時間模型組比較，◇P<0.05。

本實驗在不同的椒蒿使用劑量組和時間點上，INHB與FSH的含量不同，劑量越高、時間點越長，其含量越趨向于正常值。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，使用椒蒿揮發(fā)油組的小鼠睪丸生精小管炎癥進展緩慢，較沒有椒蒿揮發(fā)油組明顯減輕，劑量越高、時間點越長組的生精小管的結(jié)構(gòu)越接近正常組織。說明椒蒿揮發(fā)油對小鼠自身免疫性睪丸炎具有一定的保護作用。以上結(jié)果可能與椒蒿揮發(fā)油具有改善微循環(huán)、抗炎、抗氧化等作用有關(guān)。通過我們實驗過程中所測激素的變化，推測椒蒿揮發(fā)油具有促性腺激素樣作用，促進垂體分泌促性腺激素，對下丘腦-垂體-性腺軸產(chǎn)生多層次的調(diào)節(jié)作用，從而糾正了自身免疫性炎癥狀態(tài)下所引起的下丘腦-垂體-性腺軸功能紊亂，保證機體激素水平平衡，促進睪丸組織的正常轉(zhuǎn)化；椒蒿揮發(fā)油的有效成分對支持細胞有一種保護作用，使其免受炎癥時的應(yīng)激損傷，進而能在一定程度上促進和保護支持細胞中與生精相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，有利于維護支持細胞的正常功能，對抑制素與FSH也有調(diào)節(jié)作用；椒蒿揮發(fā)油富含胡蘿卜素等多種抗氧化物質(zhì)[7]，是體內(nèi)重要的抗氧化物和膜穩(wěn)定劑[8-11]，在維持組織正常結(jié)構(gòu)和代謝，特別是能量的供給及鈣離子攝取、釋放過程中發(fā)揮著重要作用。因此，補充胡蘿卜素、維生素可以明顯降低氧化應(yīng)激[12-15]，能有效減少自由基對細胞膜、蛋白質(zhì)、油脂、RNA和DNA的攻擊和損傷，尤其是對DNA線粒體的誘發(fā)性攻擊，對生精小管內(nèi)環(huán)境起調(diào)節(jié)作用；椒蒿揮發(fā)油的有效成分可能對自身免疫性睪丸炎通路中的酶有抑制作用，這自然對睪丸炎的發(fā)生也具有一定的拮抗作用；椒蒿揮發(fā)油使用組小鼠在吸收揮發(fā)油后毛細血管擴張，改善微循環(huán)血流，使睪丸血流供應(yīng)充足，再與抗炎等一系列作用結(jié)合，可能也是降低睪丸炎產(chǎn)生的重要機制；使用椒蒿揮發(fā)油后的小鼠免疫活性得到改善，改善體液免疫和細胞免疫活性，抑制炎癥介質(zhì)，促進新陳代謝，以此對睪丸的生精功能產(chǎn)生一個保護作用。

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