張心武，馬雙余，張 焱

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院普外科，陜西西安 710004)

大腸癌是常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，研究大腸癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移的相關(guān)因子，有助于了解其內(nèi)在的機(jī)制，對(duì)探索大腸癌發(fā)生發(fā)展以及對(duì)大腸癌的診斷預(yù)后具有十分重要的意義。半乳糖凝集素-3(galectin-3, Gal-3)是一種半乳糖凝集素，黏蛋白-1(mucin-1, MUC1)是黏蛋白家族的成員之一。體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究表明，MUC1是Gal-3的一種配體，重組的Gal-3能增加表達(dá)MUC1的人乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的黏附性[1]。目前，國(guó)內(nèi)外尚未見在結(jié)腸癌中聯(lián)合檢測(cè)Gal-3和MUC1的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)大腸癌組織中Gal-3和MUC1蛋白的表達(dá)，分析其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，探討Gal-3和MUC1在大腸癌組織發(fā)生、發(fā)展過程中的調(diào)控機(jī)制，以期為大腸癌的診斷、預(yù)后判斷尋找新的思路。

1 材料與方法

1.1病例選擇收集2009年12月至2010年6月在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院普通外科手術(shù)治療的大腸癌標(biāo)本45例，其中男性26例，女性19例；年齡范圍39～84歲；結(jié)腸癌24例(其中盲腸4例、升結(jié)腸8例、橫結(jié)腸3例、降結(jié)腸4例、乙狀結(jié)腸5例)，直腸癌21例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者19例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者26例；另取癌旁非腫瘤組織20例為對(duì)照組。所有患者術(shù)前均未接受放療或化療，術(shù)后病理證實(shí)為結(jié)腸癌或直腸癌，癌旁非腫瘤組織取自距腫瘤邊緣3 cm以上正常黏膜組織。

1.2主要試劑鼠抗人Gal-3單克隆抗體(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，編號(hào)MAB-0572)；鼠抗人MUC1單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，編號(hào)：ZM-0391)；UltraSensitiveTM S-P 試劑盒(A試劑生物素標(biāo)記的羊抗鼠lgG、B試劑鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，編號(hào)：KIT-9701)。

1.3免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)Gal-3和MUC1的表達(dá)所有標(biāo)本經(jīng)100 mL/L甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，分別行免疫組化染色，具體操作步驟按試劑說明書進(jìn)行?？乖迯?fù)采用EDTA加熱抗原修復(fù)，取EDTA抗原修復(fù)液10 mL，按1∶50的比例稀釋。雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉，滴加適當(dāng)稀釋濃度(MUC1為1∶100，Gal-3為即用型)的第一抗體， 滴加UltraSensitiveTM S-P試劑盒A試劑生物素標(biāo)記的羊抗鼠lgG，滴加UltraSensitiveTM S-P試劑盒B試劑鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性塑膠封固。

Gal-3以甲狀腺乳頭狀瘤作為陽(yáng)性對(duì)照，MUC1以乳腺癌作為陽(yáng)性對(duì)照。兩者均以PBS代替一抗作陰性空白對(duì)照。

1.4陽(yáng)性結(jié)果判定Gal-3主要表達(dá)于胞質(zhì)內(nèi)，也可在胞核表達(dá)；MUC1主要表達(dá)于胞質(zhì)內(nèi)，也可表達(dá)于胞膜，染色呈淡黃色、棕黃色及棕褐色；在400倍視野下每張切片隨機(jī)觀察4個(gè)視野，對(duì)著色細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比。以定位明確、染色明顯者為陽(yáng)性，而染色弱或完全不染色者為陰性，陽(yáng)性細(xì)胞≤25%為(-)，26%～50%為(+)，51%～75%為()，>75%為()，將(-)記為陰性標(biāo)本，(+)、()及()定為陽(yáng)性標(biāo)本。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)于計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)、連續(xù)校正的χ2檢驗(yàn)、確切概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Gal-3在各組的表達(dá)結(jié)果Gal-3在癌旁組織、大腸癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率分別為15.0%(3/20)和73.3%(33/45)。大腸癌組明顯高于癌旁組織組，表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1、表1)。

圖1Gal-3在癌旁非腫瘤組織(A)及大腸癌(B)中的表達(dá)

Fig.1 Expression of Gal-3 in normal tissue adjacent carcinoma (A) and colorectal cancer (B) (×400)

表1Gal-3在大腸癌及癌旁組織的表達(dá)結(jié)果比較

Tab.1 Expression of Gal-3 in colorectal cancer and normal tissue adjacent carcinoma

組 別Gal-3陽(yáng)性陰性陽(yáng)性率(%)χ2P大腸癌癌旁組織333121773.315.019.07<0.01

2.2MUC1在各組的表達(dá)結(jié)果MUC1在癌旁組織和大腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為0.0%(0/20)、55.6%(25/45)，大腸癌中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005，圖2、表2)

圖2MUC1在癌旁非腫瘤組織(A，×200)及大腸癌中(B，×400)的表達(dá)

Fig.2 Expression of MUC1 innormal tissue adjacent carcinoma (A, ×200) and colorectal cancer (B, ×400)

表2MUC1在各組中的表達(dá)結(jié)果比較

Tab.2 Expression ofMUC1 in colorectal cancer and normal tissue adjacent carcinoma

組 別MUC1陽(yáng)性陰性陽(yáng)性率(%)χ2P大腸癌癌旁組織250202055.60.018.06<0.01

2.3Gal-3、MUC1與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系Gal-3的陽(yáng)性表達(dá)率在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組為61.5%(16/26)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組為89.5%(17/19)，表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0363)。MUC1的陽(yáng)性表達(dá)率在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組為34.6%(9/26)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組為84.2%(16/19)，表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0009，表3)。

表3Gal-3，MUC1與大腸癌淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系

Tab.3 Relationship of Gal-3 and MUC1 expressions with lymphatic metastasis in colorectal cancer

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移Gal-3陽(yáng)性陰性陽(yáng)性率(%)χ2P值MUC1陽(yáng)性陰性陽(yáng)性率(%)χ2P值有無171621089.561.54.38080.036316931784.234.610.940.009

3 討 論

研究表明，Gal-3參與了細(xì)胞惡變、新生血管形成、免疫逃避、腫瘤栓塞等多種病理過程，其在甲狀腺癌、膀胱癌、喉鱗癌、腎癌等腫瘤中均過表達(dá)[2-6]。其參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制可能有以下方面： Gal-3的糖親和性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的有絲分裂，參與腫瘤形成過程中的血管生成[7]；Gal-3是MMP-2/-9的裂解底物，目前已經(jīng)明確MMP-2/-9的高表達(dá)與腫瘤的演進(jìn)相關(guān)，故Gal-3可能也在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用[8]；Gal-3與Bcl-2有相似的抗凋亡功能的結(jié)構(gòu)序列，即羧基端包含一個(gè)NWGR四級(jí)結(jié)構(gòu)，因此Gal-3抗凋亡機(jī)制可能與Bcl-2有關(guān)[9]。Gal-3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的聚集導(dǎo)致腫瘤栓塞機(jī)體微血管，有利于腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，從而使腫瘤細(xì)胞溢出而增加轉(zhuǎn)移潛能[10]。

MUC1具有調(diào)節(jié)細(xì)胞間相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等功能。近年來MUC1在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的作用較受重視。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞上MUC1的糖基化不全，可作為半抗原而誘發(fā)抗腫瘤CTL免疫應(yīng)答；同時(shí)還能抑制免疫活性細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，MUC1高表達(dá)的腫瘤患者預(yù)后差，表明MUC1參與了機(jī)體免疫調(diào)節(jié)[11]。MUC1有黏附及抗黏附的雙重作用，其可下調(diào)E-鈣黏蛋白的表達(dá)[12]，而E-鈣黏蛋白是一種鈣離子依賴的細(xì)胞黏附分子，介導(dǎo)細(xì)胞間的粘附，故認(rèn)為MUC1可參與抗黏附作用。還有研究認(rèn)為，MUC1在癌細(xì)胞表面形成高密度的絲狀分子，且MUC1糖鏈中含有唾液酸而使細(xì)胞帶有負(fù)電荷，使癌細(xì)胞從原發(fā)灶脫落，從而利于瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[13]。還有研究表明，MUC1激活TNF受體相關(guān)因子等抗凋亡基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡；還可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等的生成，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和血管形成[14]。

RAMASAMY等[15]研究認(rèn)為，MUC1是Gal-3的配體，Gal-3為MUC1和表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)之間形成一個(gè)橋梁，并且Gal-3在EGF介導(dǎo)的MUC1和EGFR之間相互作用中是不可或缺的，認(rèn)為MUC1-C-Gal-3作為依賴MiR-322的調(diào)控環(huán)的一部分而發(fā)揮作用，而EGFR在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、修復(fù)和生存、新生血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要作用，故認(rèn)為Gal-3與MUC1在腫瘤的進(jìn)展過程中起作用。

目前，國(guó)內(nèi)外尚未見在大腸癌中聯(lián)合檢測(cè)Gal-3與MUC1的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)45例大腸癌中Gal-3與MUC1表達(dá)，結(jié)果表明大腸癌中Gal-3的表達(dá)明顯高于癌旁非腫瘤組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Gal-3的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。MUC1在癌旁組織及大腸癌中的表達(dá)分別為0.0%(0/20)和55.6%(25/45)，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者M(jìn)UC1的陽(yáng)性表達(dá)率為84.2%(16/19)，高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的34.6%(9/26)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果表明，Gal-3和MUC1在大腸癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移中均具有重要作用。

因此，Gal-3和MUC1與大腸癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移均有著密切的關(guān)系，共同檢測(cè)這兩個(gè)指標(biāo)有望用于大腸癌的診斷及作為大腸癌預(yù)后的判斷指標(biāo)。此外，Gal-3與MUC1在免疫及基因治療方面已有研究，這為大腸癌的基因和免疫治療也提供了一個(gè)新的思路。

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