宋 濤，楊 雪，郭 成，姚英民，楊 威，丁飛虎，劉青光

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，陜西西安 710061)

信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)是研究干擾素調(diào)節(jié)基因時(shí)發(fā)現(xiàn)的，隨后不斷發(fā)現(xiàn)眾多酪氨酸激酶作用于不同種類的STAT蛋白。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，STAT家族發(fā)現(xiàn)7個(gè)亞型，分別是：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6。其中STAT3被認(rèn)為是一種癌基因，是多個(gè)致癌性酪氨酸激酶信號(hào)通道匯聚點(diǎn)，在多種腫瘤中呈現(xiàn)異常表達(dá)活化[1]，STAT3及其活化產(chǎn)物表達(dá)同腫瘤分級(jí)和患者預(yù)后存在關(guān)聯(lián)，在肝癌中是否也存在類似現(xiàn)象尚不完全確定。

1 材料與方法

1.1組織標(biāo)本組織標(biāo)本均來(lái)自2008～2010年西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院手術(shù)患者，均合并有乙型病毒性肝炎肝硬化，經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為肝細(xì)胞肝癌，共計(jì)73例，其中男性61例，女性12例，年齡28～72歲，中位年齡50.5歲，取非壞死區(qū)肝癌組織(肝癌組織)及距腫瘤邊緣2 cm肝硬化組織(癌旁組織)約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm。所有組織均為手術(shù)切除后獲取的新鮮標(biāo)本，組織標(biāo)本獲取后立即轉(zhuǎn)移至液氮及40 g/L多聚甲醛固定，經(jīng)HE染色證實(shí)剔除標(biāo)本內(nèi)包含壞死組織樣本。

1.2主要試劑PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，鼠抗人STAT3單克隆抗體和鼠抗人p-STAT3單克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz Inc(sc-81385, sc-8059)，Elivision二步法二抗試劑盒購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3RT-PCR檢測(cè)肝癌組織及癌旁組織STAT3的轉(zhuǎn)錄參照FASTAGEN-RNAfast200試劑盒提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取5 μL，20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參照。STAT3上游引物：5′-GTCAGATGCCAAATGC-3′，下游引物：5′-TGATGTACCCTTCGTTC-3′。β-actin上游引物：5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′，下游引物：5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′。以senesiAnsys凝膠定量分析軟件進(jìn)行凝膠擴(kuò)增產(chǎn)物灰度定量分析。

1.4免疫組化檢測(cè)肝癌組織及癌旁組織STAT3、p-STAT3表達(dá)采用免疫組織化學(xué)Elivision二步法，按照試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行操作：60 ℃烘烤切片2 h，石蠟切片脫蠟水化，90 ℃微波抗原熱修復(fù)2 min，依次滴加30 mL/L H2O2室溫下滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min；STAT3和p-STAT3鼠抗人一抗(分別1∶100；1∶150稀釋)，4 ℃保存16 h；聚合物增強(qiáng)劑室溫孵育20 min；酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物室溫孵育25 min；DAB顯色。陰性對(duì)照組中，以PBS液代替一抗。

1.5免疫組織化學(xué)法陽(yáng)性結(jié)果判定密封組織片號(hào)，由我院病理科2位病理醫(yī)師在顯微鏡下觀察組織切片陽(yáng)性染色情況并進(jìn)行評(píng)分。鏡下選取每一組織點(diǎn)的中心部，染色結(jié)果判定參照Mattern方法進(jìn)行判定。陽(yáng)性染色深度：未見(jiàn)染色為0，輕度染色(淺黃色)為1，中度染色(棕黃色)為2，深度染色(棕褐色)為3；陽(yáng)性細(xì)胞百分比：未見(jiàn)染色為0，染色細(xì)胞<25%為1，25%～50%為2，>50%為3。兩方面得分相加，0～2分判為陰性表達(dá)，>2分判為陽(yáng)性表達(dá)，隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野，記數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞。記錄肝癌組織和癌旁組織p-STAT3陽(yáng)性表達(dá)率及各樣本臨床資料，病理學(xué)特征(年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤計(jì)數(shù)、病理分級(jí)、TNM分期、是否存在包膜、門靜脈系統(tǒng)侵犯、血清AFP濃度、HBsAg陽(yáng)性率)。

2 結(jié) 果

2.1STAT3在肝癌組織和癌旁組織中的mRNA水平STAT3逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增產(chǎn)物為368 bp，內(nèi)參β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物大小為197 bp，在肝癌組織和癌旁組織中均發(fā)現(xiàn)存在STAT3轉(zhuǎn)錄(圖1)，但是肝癌組織的STAT3mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶灰度明顯高于對(duì)應(yīng)癌旁組織，STAT3基因的PCR產(chǎn)物量/β-actin的比值經(jīng)t檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1肝癌組織(Ca)及對(duì)應(yīng)癌旁組織(N)中STAT3mRNA的表達(dá)

Fig.1 STAT3 mRNA expression in hepatic carcinoma tissues (Ca) and paracancerous tissues (N)

2.2免疫組化檢測(cè)結(jié)果73例肝細(xì)胞肝癌組織和癌旁組織中未出現(xiàn)組織自溶現(xiàn)象，標(biāo)本保存良好。STAT3蛋白陽(yáng)性染色定位于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)及核周，呈棕黃色或棕褐色顆粒狀，彌漫或局灶性分布，而腫瘤間質(zhì)組織中未見(jiàn)STAT3蛋白陽(yáng)性染色；癌旁組織中STAT3陽(yáng)性表達(dá)率26.0%(19/73)，而肝細(xì)胞肝癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率75.3%(65/73)，癌旁組織中STAT3表達(dá)弱于肝癌組織(圖2)，陽(yáng)性表達(dá)率組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。p-STAT3蛋白陽(yáng)性染色定位于腫瘤細(xì)胞胞核內(nèi)，呈棕褐色顆粒狀。癌旁組織中p-STAT3表達(dá)同樣弱于肝癌組織，陽(yáng)性表達(dá)率組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

圖2STAT3和p-STAT3在肝癌組織和癌旁組織的表達(dá)

Fig.2 Expression of STAT3 and p-STAT3 in hepatic carcinoma tissues and paracancerous tissues (×400)

A：STAT3在肝癌組織中呈陽(yáng)性表達(dá)；B：STAT3在癌旁肝組織中呈陰性表達(dá)；C：p-STAT3在肝癌組織中呈陽(yáng)性表達(dá)；D：p-STAT3在癌旁肝組織中呈陰性表達(dá)。

表1STAT3和p-STAT3在肝癌組織及癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá)

Tab.1 Positive expression of STAT3 and p-STAT3 in hepatic carcinoma tissues and paracancerous tissues

[n(%)]

與癌旁組織比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3p-STAT3表達(dá)同肝癌病理特征關(guān)系73例肝癌組織中p-STAT3表達(dá)陰性和陽(yáng)性組間腫瘤大小、組織病理分化、TNM分期、門靜脈系統(tǒng)侵犯比率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而患者年齡、性別、腫瘤個(gè)數(shù)、是否存在假胞膜、血清AFP濃度和HBsAg陽(yáng)性率組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

3 討 論

STAT3是IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控基因，參與調(diào)節(jié)眾多基因轉(zhuǎn)錄，影響細(xì)胞增殖侵襲活性[1]，研究證實(shí)幾乎在人類主要腫瘤中均存在STAT3異常表達(dá)，在多種腫瘤中STAT3陽(yáng)性表達(dá)同腫瘤病理分級(jí)及不良預(yù)后相關(guān)[2-5]。部分肝癌細(xì)胞株內(nèi)STAT3轉(zhuǎn)錄水平異常[6]；建立肝癌大鼠模型中也發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞內(nèi)存在STAT3表達(dá)和激活[7]。但是對(duì)于人肝癌組織中STAT3表達(dá)狀況以及STAT3表達(dá)同肝癌病理特征是否相關(guān)存在不同意見(jiàn)[8]，其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不完全明確。

我國(guó)肝癌患者多數(shù)伴有乙型肝炎病毒感染及肝硬化，其血清IL-6水平高于正常人群[9]，存在使受損肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞內(nèi)IL-6/JAK2/STAT3通路持續(xù)激活的始動(dòng)因素，而且在肝臟細(xì)胞和肝臟腫瘤細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)IL-6受體gp130存在[10]，存在激活I(lǐng)L-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路的物質(zhì)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)肝癌組織和癌旁肝硬化組織內(nèi)STAT3 mRNA對(duì)比，發(fā)現(xiàn)癌旁肝硬化組織雖然存在STAT3基因轉(zhuǎn)錄，但是明顯低于肝癌組織，說(shuō)明在肝硬化組織受損細(xì)胞向肝細(xì)胞肝癌轉(zhuǎn)化中，存在STAT3轉(zhuǎn)錄異常升高。通過(guò)免疫組織化學(xué)證實(shí)STAT3蛋白在肝癌組織內(nèi)表達(dá)強(qiáng)度以及陽(yáng)性表達(dá)率均高于癌旁肝硬化組織，而且p-STAT3蛋白也有類似改變，說(shuō)明在同樣存在炎性因子高表達(dá)的微環(huán)境下，癌旁肝硬化組織STAT3蛋白不同于肝癌組織中的表達(dá)升高，STAT3的異常轉(zhuǎn)錄表達(dá)及活化可能是受損細(xì)胞向肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的中間事件，STAT3在肝硬化組織癌變過(guò)程中可能扮演了重要角色。

表2p-STAT3表達(dá)與肝癌臨床病理特征關(guān)系

Tab.2 Correlation between p-STAT3 expression and clinicopathological characteristics in hepatic carcinoma

病理特征例數(shù)(n)表達(dá)水平陽(yáng)性表達(dá)(n=38)陰性表達(dá)(n=35)P值年齡7349.92±9.3951.34 ±7.550.714性別0.633 男613130 女1275腫瘤直徑0.029* <5cm321220 ≥5cm412615腫瘤個(gè)數(shù)0.135 單個(gè)572839 多個(gè)16106組織病理分化0.009 良(I)808 中(Ⅱ,Ⅲ)512724 差(Ⅳ)14113TNM分期0.028 Ⅰ～Ⅱ301119 Ⅲ～Ⅳ432716包膜形成0.153 無(wú)462125 有271710門靜脈侵犯0.001 無(wú)421527 有31238AFP(ng/mL)0.453 <400472621 ≥400261214HBsAg0.294 陽(yáng)性583226 陰性1569

IL-6/JAK2/STAT3通路持續(xù)激活的最終結(jié)果是提高細(xì)胞內(nèi)p-STAT3蛋白表達(dá)量，具有生物學(xué)活性的p-STAT3蛋白表達(dá)異常才可能影響諸如VEGF，survivin等影響細(xì)胞增殖侵襲的功能基因轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而表現(xiàn)為p-STAT3表達(dá)同患者臨床病理特征相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)肝癌組織中p-STAT3表達(dá)水平明顯高于癌旁肝硬化組織，通過(guò)對(duì)比肝癌組織中p-STAT3陽(yáng)性表達(dá)組和陰性表達(dá)組患者的臨床特征，發(fā)現(xiàn)兩組患者在腫瘤大小、組織病理分化、TNM分期、門靜脈系統(tǒng)侵犯存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p-STAT3陽(yáng)性表達(dá)組患者腫瘤直徑大于5 cm者更多，組織病理更趨向低分化，TNM分期更晚，門靜脈系統(tǒng)侵犯率高，以上現(xiàn)象反映出p-STAT3陽(yáng)性表達(dá)肝癌細(xì)胞更具增殖侵襲能力，惡性程度更高，雖然未進(jìn)一步對(duì)2組肝癌患者進(jìn)行生存分析，但是既往眾多文獻(xiàn)證明腫瘤直徑大于5 cm，組織病理分化差，TNM分期晚，門靜脈系統(tǒng)侵犯均是患者預(yù)后不佳的標(biāo)志性事件[11-12]，而p-STAT3蛋白表達(dá)均與以上因素正相關(guān)，因此推斷p-STAT3有可能成為提示肝癌患者預(yù)后的指標(biāo)之一。

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