石文波，盛慧萍，楊 巖，張小亞，王國寧

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院感染疾病科，寧夏銀川 750004； 3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)醫(yī)學(xué)科，寧夏銀川 750004)

乙肝患者病情轉(zhuǎn)歸主要取決于乙肝病毒及機(jī)體自身免疫力兩個(gè)方面的影響，慢性乙型肝炎(CHB)治療原則中抗病毒治療是關(guān)鍵。有研究表明，核苷(酸)類似物抗病毒的同時(shí)，也能影響慢性乙肝患者的免疫功能[1]。目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為這種作用與抗病毒治療引起的病毒載量下降，從而機(jī)體相應(yīng)免疫系統(tǒng)得到恢復(fù)有關(guān)。阿德福韋酯為腺嘌呤核苷類似物，對乙肝病毒復(fù)制有明顯的抑制作用，在體內(nèi)細(xì)胞激酶作用下磷酸化為活性代謝產(chǎn)物二磷酸鹽，與酶的自然底物三磷酸脫氧腺苷競爭抑制乙型肝炎病毒DNA聚合酶，或通過整合到病毒DNA鏈后使其復(fù)制終止，但對慢乙肝患者免疫水平特別是細(xì)胞因子的影響機(jī)制還不十分清楚。本研究通過觀察阿德福韋酯(adefovir dipivoxil, ADV)對慢性乙肝患者外周血細(xì)胞因子IFN-γ、IL-10、乙型肝炎病毒DNA(hepatitis B virus DNA, HBV DNA)水平及肝組織病理的影響，探討ADV對慢性乙肝患者免疫水平及肝組織病理的影響。

1 資料與方法

1.1臨床資料選取寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院感染性疾病科門診和住院部2007～2009年收治的18例慢性乙肝患者，均符合2005年《慢性乙型肝炎防治指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，同時(shí)達(dá)到抗病毒治療條件，并排除甲、丙、丁、戊型肝炎和其他原因所致肝損害及心、腦、肺等疾病患者。18例中男16例，女2例，年齡19～52(30.45±7.50)歲，所有患者治療前未使用過抗病毒藥物和免疫調(diào)節(jié)劑。18例患者均接受天津藥物研究所有限公司生產(chǎn)的ADV(代丁)，每天10 mg，口服48周，患者依從性好。20名健康體檢者作對照，其肝功指標(biāo)均在正常范圍，甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒標(biāo)志物均為陰性。

1.2檢測方法所有患者均為清晨空服抽取肘靜脈血10 mL，在6 h內(nèi)離心取上層血清，一部分放入2 mL EP管中，存放于零下70 ℃冰箱待檢細(xì)胞因子IFN-γ及IL-10；一部分用于肝功及HBV DNA檢測。細(xì)胞因子檢測用ELISA方法，試劑盒購自美國ADL公司天津分公司，嚴(yán)格按產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。HBV DNA檢測采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，PCR檢測試劑盒購自中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因診斷中心。肝組織用G16快速穿刺針抽取，每條肝組織長度均在1.5 cm以上，肝組織采用HE染色、Masson染色、網(wǎng)染、VG染色，參照《慢性乙型肝炎防治指南》中分期標(biāo)準(zhǔn)[2]，由病理科專家作出肝組織炎癥分級及纖維化分期。

2 結(jié) 果

2.1慢性乙肝患者丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、血清HBVDNA指標(biāo)治療前后的比較慢性乙肝患者治療后丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine amino transferase, ALT)、血清HBV DNA指標(biāo)均較治療前明顯好轉(zhuǎn)，各自比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.2慢性乙肝患者治療前后肝組織學(xué)的改變治療后肝組織炎癥活動度較治療前明顯降低，其中有12例較前明顯減輕，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肝組織纖維化程度較治療前有所改善，其中有6例改善明顯，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。另附1例患者經(jīng)治療后其肝組織炎癥及纖維化明顯改善圖片(圖1)。

表1慢性乙肝患者治療前后ALT、HBVDNA水平的比較

Tab.1 Comparison of ALT and HBV DNA levels before and after ADV treatment in CHB patients

組 別例數(shù)ALT(IU/L)HBV DNA(lgIU/mL)治療前18180.08±175.396.13±1.20治療后1833.95±16.37*2.64±0.71*

與治療前比較，*P<0.05；ALT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；HBV DNA：乙型肝炎病毒DNA。

圖1病例巴某ADV治療前后肝臟病理學(xué)的改變

Fig.1 Changes of liver pathology before and after ADV treatment (HE, ×100)

A：巴某治療前病理診斷為G3S2；B：巴某治療后病理診斷為G1S0。

表2ADV治療前后肝臟組織炎癥及纖維化程度的變化

Tab.2 Changes of liver tissue inflammation and fibrosis before and after ADV treatment

組別例數(shù)炎癥活動度(G)G0G1G2G3G4纖維化程度(S)S0S1S2S3S4治療前1803654001413治療后1826730033210

治療前后炎癥活動度(G)通過秩和檢驗(yàn)，得到統(tǒng)計(jì)量P<0.05，故認(rèn)為治療前后肝組織炎癥活動度變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療前后纖維化程度(S)通過秩和檢驗(yàn)，得到統(tǒng)計(jì)量P>0.05，故認(rèn)為治療前后肝組織纖維化分級差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3慢性乙肝患者治療前后血清IFN-γ、IL-10水平的變化治療前血清細(xì)胞因子IFN-γ、IL-10水平均較正常對照組低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療48周后血清細(xì)胞因子IFN-γ、IL-10水平較治療前均有升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05))。治療后與正常對照組比較，IFN-γ水平仍低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療后IL-10水平與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表3慢性乙肝患者在治療前后IL-10、IFN-γ水平的比較

Tab.3 Expressions of cytokines IL-10 and IFN-γ in the control group and pre-treatment and post-treatment groups

組 別例數(shù)IL-10(pg/mL)IFN-γ(pg/mL)對照組2023.06±7.2089.90±10.20治療前189.50±2.40△32.60±8.20△治療后1819.46±6.07*54.70±8.25*△

與對照組比較，△P<0.05；與治療前比較，*P<0.05。

2.4治療前肝組織炎癥活動度高組(G≥3級)與炎癥活動度低組(G≤2級)治療后療效觀察治療前慢性乙肝患者肝組織炎癥活動度高組(G≥3級)與炎癥活動度低組(G≤2級)經(jīng)治療48周后，觀察IFN-γ及血清HBV DNA等指標(biāo)，兩組治療前IFN-γ水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05 )，治療后前組IFN-γ水平升高較后組明顯，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。前組血清HBV DNA只有1例未轉(zhuǎn)陰，該例血清HBV DNA下降幅度>2 lgIU/mL,而后組有4例血清HBV DNA未轉(zhuǎn)陰，HBV DNA下降幅度<2 lgIU/mL，該4例中有2例血清HBV DNA較治療前更高。前組血清HBV DNA轉(zhuǎn)陰率明顯高于后組，但兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，考慮可能與樣本例數(shù)太少有關(guān)(表4)。

表4慢性乙肝患者肝組織炎癥活動度高組(G≥3級)與炎癥活動度低組(G≤2級)治療前后IFN-γ及治療后血清HBVDNA轉(zhuǎn)陰例數(shù)、轉(zhuǎn)陰率的比較

Tab.4 Expression of cytokine IFN-γ and changes of HBV DNA before and after treatment in the two groups with different degree of liver tissue inflammation

組 別例數(shù)IFN-γ(pg/mL)治療前治療后HBV DNA轉(zhuǎn)陰例數(shù)轉(zhuǎn)陰率(%)炎癥高組933.55±11.2560.12±10.05△888.89炎癥低組931.06±10.0342.69±7.80555.56

與炎癥活動度低組比較，△P<0.05；HBV DNA：乙型肝炎病毒DNA。

3 討 論

目前，普遍認(rèn)為Th1/Th2細(xì)胞失衡是慢性感染發(fā)生和持續(xù)的原因之一[3]，Th1/Th2細(xì)胞失衡從而有相應(yīng)細(xì)胞因子失衡。阿德福韋酯可明顯抑制HBV DNA的復(fù)制，促進(jìn)乙肝患者血清轉(zhuǎn)氨酶正?；龠M(jìn)肝臟組織學(xué)改善等功能。本研究結(jié)果也表現(xiàn)出阿德福韋酯具有上述功能。這里值得特別指出的是本研究中治療前后肝組織纖維化改善程度上無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也許與樣本中病例治療前纖維化程度已經(jīng)明顯偏高，且治療時(shí)間不夠長有關(guān)，還有待更長時(shí)間觀察。早在1994年，CALI等[4]發(fā)現(xiàn)阿德福韋酯能顯著增加C57BL/6大鼠的NK細(xì)胞活性和IFN-γ的分泌，抑制IL-1、IL-2的產(chǎn)生，從而推測阿德福韋酯可能還有免疫調(diào)理作用。后來STOOP等[5]發(fā)現(xiàn)阿德福韋酯降低乙肝病毒載量的同時(shí)，HBV核心抗原特異的IFN-γ有產(chǎn)生和增殖，而IL-10在治療中沒有降低。因此，有較多學(xué)者認(rèn)為阿德福韋酯治療后患者血清細(xì)胞因子變化是體內(nèi)大量HBV被抑制后免疫系統(tǒng)恢復(fù)或增強(qiáng)的表現(xiàn)。近來范文博等[1]認(rèn)為可能的機(jī)制為：①樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)作為目前已知機(jī)體內(nèi)最大的抗原提呈細(xì)胞，在固有免疫與特異性免疫中發(fā)揮非常重要的作用。慢性乙肝患者DC功能損傷是造成免疫反應(yīng)低下、HBV持續(xù)感染的重要原因之一[6]。抗病毒治療可能同時(shí)抑制受感染DC中HBV，使DC的功能得以恢復(fù)，激活誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞。②程序性死亡受體-1(PD-1)為存在T淋巴細(xì)胞膜上的一段跨膜蛋白，PD-1與其配體PD-Ligand1(PD-L1)通路能抑制HBV感染中抗原特異性T淋巴細(xì)胞的表達(dá)，抗病毒治療可通過有效抑制病毒使PD-1的表達(dá)水平下降，并能阻斷PD-1/PD-L1通路，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞功能的恢復(fù)[7]。③調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell, Treg細(xì)胞)是近來發(fā)現(xiàn)的具有強(qiáng)有力免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用的T淋巴細(xì)胞的重要類型之一，可通過不同的途徑抑制細(xì)胞免疫；STOOP等[8]發(fā)現(xiàn)外周血病毒載量高的慢性乙肝患者，其Treg細(xì)胞水平也相應(yīng)的增高，抗病毒治療可以降低Treg水平，并且增強(qiáng)機(jī)體抗病毒免疫應(yīng)答。本研究發(fā)現(xiàn)慢性乙肝患者服用ADV治療48周，其IFN-γ，IL-10水平較治療前均升高，免疫水平有恢復(fù)，有利于機(jī)體清除病毒，但治療后細(xì)胞因子水平仍不能恢復(fù)到對照組水平。在研究中還觀察到治療前肝組織炎癥活動度高組(G≥3級)治療效果較低組(G≤2級)更好，體現(xiàn)在治療后患者IFN-γ升高幅度更大，且前者血清HBV-DNA轉(zhuǎn)陰率高，病毒下降幅度大，這一點(diǎn)可以說明在免疫清除期及再激活期抗病毒治療效果更好，而在免疫耐受期及非活動期治療效果差，所以抗病毒的時(shí)機(jī)很重要?？共《臼侵委熉訦BV感染的關(guān)鍵手段，機(jī)體清除HBV的關(guān)鍵是健全的特異性細(xì)胞免疫功能，抗病毒治療可強(qiáng)化機(jī)體的清除病毒能力。阿德福韋酯是如何具體通過上述途徑來增強(qiáng)或恢復(fù)機(jī)體抗HBV的免疫力還有待進(jìn)一步的研究。

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