孟憲魁，張 雷

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院老年外科，陜西西安 710061)

胰腺癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，因其具有早期癥狀不典型和轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)等特點(diǎn)，確診時(shí)患者多已發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移。由于目前對(duì)胰腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究仍不清楚，尚未出現(xiàn)抑制其轉(zhuǎn)移的有效治療手段。Slug是SNAI2基因編碼的鋅指轉(zhuǎn)錄因子蛋白，具有高度保守的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域，在細(xì)胞核內(nèi)可以直接結(jié)合到靶基因編碼序列啟動(dòng)子上直接調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[1-2]。E-cadherin是上皮細(xì)胞間黏連斑的主要組成分子，也是上皮細(xì)胞最重要的標(biāo)志物之一[3-4]。前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，Slug可以通過結(jié)合E-cadherin基因啟動(dòng)子上的E-box序列，抑制其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[5]，導(dǎo)致上皮細(xì)胞間質(zhì)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)[6-7]，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。但是仍不清楚Slug對(duì)胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用以及相關(guān)機(jī)制，本研究應(yīng)用小干擾RNA技術(shù)(small interference RNA, siRNA)沉默MIAPaca-2細(xì)胞中Slug的表達(dá)，檢測(cè)其對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)試劑人胰腺癌細(xì)胞MIAPaca-2由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科馬清涌教授惠贈(zèng)。DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco modified Eagle medium)、2.5 g/L胰酶均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司。Slug siRNA序列為：5′- GCAUUUGCAGACAGGUCAATT-3′，由深圳華大基因公司合成。Slug、E-cadherin和β-actin抗體購(gòu)買于美國(guó)Santa Cruz公司，生物素標(biāo)記二抗購(gòu)買于北京中杉金橋生物技術(shù)公司。Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。總RNA提取試劑Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBGreen實(shí)時(shí)定量試劑盒購(gòu)買于日本TaKaRa生物技術(shù)公司。定量Transwell細(xì)胞侵襲試劑盒購(gòu)買于美國(guó)密理博公司(QCMTM96-well cell invasion assay kit)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MIAPaca-2細(xì)胞在含有100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、37 ℃、50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)及傳代。在6孔板中種植MIAPaca-2細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，按說明書使用Lipofectamine 2000分別將Slug siRNA和錯(cuò)義siRNA轉(zhuǎn)入不同的培養(yǎng)孔中，構(gòu)建出實(shí)驗(yàn)組(Slug siRNA)和對(duì)照組(Scr siRNA)。

1.3QuantitiveReal-timePCR方法檢測(cè)Slug的mRNA表達(dá)水平使用Trizol試劑提取細(xì)胞的總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按說明書合成cDNA。取合成好的cDNA，使用SYBGreen實(shí)時(shí)定量試劑盒和Slug引物(F：5′-AGATGCATATTCGGACCCACA-3′，R：5′-CCTCATGTTTGTGCAGGAGAG-3′)，在Life Tech(applied biosystems)7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)上實(shí)施quantitive Realtime PCR檢測(cè)。β⒗-actin被用于內(nèi)參，其引物序列為5′-CAACTGGGACGACATGGAGA-3′，5′-CAGGCAGCTCGTAGCTCTTC-3′。

1.4Westernblotting檢測(cè)蛋白表達(dá)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染72 h用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白含量。使用SDS-PAGE膠(120 g/L的分離膠和50 g/L基層膠)。每個(gè)上樣孔的上樣量為50 μg，使用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行封閉抗原、孵育一抗、洗膜、孵育二抗，洗膜以及顯影等。β-actin被用于內(nèi)參。

1.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)在6孔板中種植約5×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜。使用1 mL移液器槍頭垂直于培養(yǎng)板底面，進(jìn)行劃痕。使用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，去除漂浮細(xì)胞，再次在含有100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、37 ℃、50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)。分別在0、24、48 h時(shí)拍照，并測(cè)量細(xì)胞劃痕的愈合情況。

1.6定量Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞在無血清的DMEM培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)24 h。然后在定量Transwell細(xì)胞侵襲試劑盒提供的小室的上層，種植1×105個(gè)腫瘤細(xì)胞，加入無血清的DMEM培養(yǎng)基。小室的下層加入含有100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。于常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h后，按照試劑盒說明，將穿過Matrigel膠和小室濾孔層的細(xì)胞消化至下層小室。加入細(xì)胞裂解液和染料工作液后，在熒光光度儀(480/520 nm)下讀取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組數(shù)據(jù)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism 4.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪制示意圖。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1靶向siRNA顯著降低MIAPaca-2細(xì)胞中Slug的表達(dá)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染所合成的Slug靶向siRNA后，MIAPaca-2細(xì)胞中Slug的mRNA含量顯著減少(圖1A)。而Western blotting實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，轉(zhuǎn)染Slug siRNA的MIAPaca-2細(xì)胞中Slug蛋白的含量要明顯低于轉(zhuǎn)染有Scr siRNA的MIAPaca-2細(xì)胞(圖1B)。通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染靶向siRNA可有效沉默MIAPaca-2細(xì)胞中Slug基因的表達(dá)。

圖1靶向siRNA有效沉默MIAPaca-2細(xì)胞中SlugmRNA(A)和蛋白(B)表達(dá)

Fig.1 Target siRNAs silenced Slug expression in MIAPaca-2 cells at both the mRNA (A) and protein (B) levels

2.2敲除Slug明顯降低MIAPaca-2細(xì)胞的遷移能力MIAPaca-2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染Slug siRNA和Scr siRNA 24 h，細(xì)胞劃痕平均愈合分別為20%左右和40%，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009)。在48 h時(shí)，轉(zhuǎn)染Slug siRNA的MIAPaca-2細(xì)胞劃痕平均減少了60%，而轉(zhuǎn)染Scr siRNA的MIAPaca-2細(xì)胞劃痕基本消失，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009，圖2)。

2.3沉默Slug明顯抑制MIAPaca-2細(xì)胞的侵襲能力定量Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染Slug siRNA的MIAPaca-2細(xì)胞穿過包被有Matrigel膠的Transwell小室濾層的細(xì)胞明顯少于轉(zhuǎn)染Scr siRNA的對(duì)照組MIApaca-2細(xì)胞(圖3)。這表明沉默Slug基因的表達(dá)明顯抑制了胰腺癌MIAPaca-2細(xì)胞的侵襲能力。

圖2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲除Slug可有效抑制MIAPaca-2細(xì)胞的遷移能力Fig.2 Wound healing assay confirmed that knock-down of Slug repressed the migration capacity of MIAPaca-2 cells

圖3Transwells小室侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)沉默Slug可有效的抑制MIAPaca-2細(xì)胞的侵襲能力

Fig.3 Quantitative Transwell chamber assays showed that silencing Slug inhibited the invasion capacity of MIAPaca-2 cells

2.4沉默Slug上調(diào)MIAPaca-2細(xì)胞的E-cadherin表達(dá)Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Slug基因敲除時(shí)，MIAPaca-2細(xì)胞的E-cadherin蛋白表達(dá)明顯增高(圖4)。

3 討 論

胰腺癌是全球第5大致死腫瘤。由于其早期缺乏典型的臨床癥狀，同時(shí)尚無有效的臨床治療手段，其5年生存率小于5%[8]。80%胰腺癌患者在確診時(shí)，由于已經(jīng)發(fā)展為晚期腫瘤或出現(xiàn)遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移，無法接受根治性切除治療。針對(duì)胰腺癌的傳統(tǒng)放化療方法療效并不理想，這些因素嚴(yán)重影響了胰腺癌的預(yù)后。因此，探明胰腺癌轉(zhuǎn)移分子機(jī)制對(duì)研發(fā)相關(guān)靶向藥物和腫瘤特意標(biāo)志物具有重要意義。

圖4Westernblotting實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲除Slug明顯增加了MIAPaca-2細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)

Fig.4 E-cadherin protein expression was increased significantly by knockdown of Slug in MIAPaca-2 cells

Slug蛋白，也被稱為SNAI2蛋白，是一種鋅指核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，研究證實(shí)其具有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的功能。本研究使用小干擾RNA技術(shù)成功敲除胰腺癌細(xì)胞MIAPaca-2中Slug基因，并通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和定量Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)證實(shí)，下調(diào)Slug表達(dá)水平可以明顯抑制MIAPaca-2細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

癌癥轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，包括了癌細(xì)胞從周圍細(xì)胞和基質(zhì)黏連中解離、細(xì)胞外基質(zhì)分解、腫瘤細(xì)胞通過基質(zhì)缺損進(jìn)入血液循環(huán)、淋巴循環(huán)和臨近組織等。而其中腫瘤細(xì)胞粘附能力減弱和運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)在癌癥轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[9-10]。EMT是指上皮來源的細(xì)胞在某些因素刺激下，喪失其上皮細(xì)胞的特性如柱狀細(xì)胞外形、緊密的細(xì)胞間黏連以及較弱的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力，出現(xiàn)了部分間質(zhì)細(xì)胞的特征。胚胎時(shí)期，EMT具有調(diào)控組織分化以及臟器形成等重要作用。而當(dāng)機(jī)體發(fā)育成熟后，EMT在信號(hào)通路調(diào)控下自動(dòng)消失。研究發(fā)現(xiàn)，EMT表型在胰腺細(xì)胞中再次出現(xiàn)，并促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移以及化療耐藥能力[11-12]。但是其具體異常激活機(jī)制尚不清楚。

E-cadherin是上皮細(xì)胞間重要的粘附分子，在上皮細(xì)胞間的粘附反應(yīng)起重要作用，具有維護(hù)上皮細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性及極性的功能[13-14]。前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)Slug蛋白在細(xì)胞核內(nèi)通過結(jié)合在E-cadherin編碼基因啟動(dòng)子的E-box片段，直接抑制E-cadherin轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)為探討沉默Slug明顯抑制MIAPaca-2細(xì)胞遷移和侵襲能力的具體分子機(jī)制，通過Western blotting方法檢測(cè)了E-cadherin蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)Slug表達(dá)明顯增加了E-cadherin蛋白在MIAPaca-2細(xì)胞中的表達(dá)。因此，推測(cè)Slug在胰腺癌細(xì)胞中可以通過抑制E-cadherin表達(dá)，誘導(dǎo)EMT表型，使得腫瘤細(xì)胞的粘附能力減弱以及運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，最終促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。由于EMT在腫瘤化療耐藥性產(chǎn)生過程中起重要作用，本研究為防治胰腺癌轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，針對(duì)Slug的靶向藥物有望成為有效的胰腺癌防治藥物。

參考文獻(xiàn)：

[1] ALVES CC, CARNEIRO F, HOEFLER H, et al. Role of the epithelial-mesenchymal transition regulator Slug in primary human cancers[J]. Front Biosci, 2009, 14(1):3035-3050.

[2] COBALEDA C, PEREZ-CARO M, VICENTE-DUENAS C, et al. Function of the zinc-finger transcription factor SNAI2 in cancer and development[J]. Annu Rev Genet, 2007, 41(6):41-61.

[3] SCHMALHOFER O, BRABLETZ S, BRABLETZ T. E-cadherin, beta-catenin, and ZEB1 in malignant progression of cancer[J]. Cancer Metastasis Rev, 2009, 28(1-2):151-166.

[4] VAN ROY F, BERX G. The cell-cell adhesion molecule E-cadherin[J]. Life Sci, 2008, 65(23):3756-3788.

[6] HOTZ B, ARNDT M, DULLAT S, et al. Epithelial to mesenchymal transition: expression of the regulators snail, slug, and twist in pancreatic cancer[J]. Clin Cancer Res, 2007, 13(16):4769-4776.

[7] LEMMA S, KARIHTALA P, HAAPASAARI KM, et al. Biological roles and prognostic values of the epithelial-mesenchymal transition-mediating transcription factors Twist, ZEB1 and Slug in diffuse large B-cell lymphoma[J]. Histopathology, 2013, 62(2):326-333.

[8] SIEGEL R, NAISHADHAM D, JEMAL A. Cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2012, 62(1):10-29.

[9] SPANO D, HECK C, DE ANTONELLIS P, et al. Molecular networks that regulate cancer metastasis[J]. Semin Cancer Biol, 2012, 22(3):234-249.

[10] JIANG WG, ABLIN RJ. Cancer metastasis, challenges, progress and the opportunities [J]. Front Biosci (Elite Ed), 2011, 3(1):391-394.

[11] NAGATHIHALLI NS, MERCHANT NB. Src-mediated regulation of E-cadherin and EMT in pancreatic cancer [J].Front Biosci, 2012, 17(6):2059-2069.

[12] TIWARI N, GHELDOF A, TATARI M, et al. EMT as the ultimate survival mechanism of cancer cells[J]. Semin Cancer Biol, 2012, 22(3):194-207.

[13] HELDIN CH, VANLANDEWIJCK M, MOUSTAKAS A. Regulation of EMT by TGF beta in cancer[J]. FEBS Lett, 2012, 586(7):1959-1970.

[14] QAZI AM, GRUZDYN O, SEMAAN A, et al. Restoration of E-cadherin expression in pancreatic ductal adenocarcinoma treated with microRNA-101[J]. Surgery, 2012, 152(4):704-711.