秦 勇，馬清涌，黨曉燕，慕為民，楊 睿

(西安交通大學醫(yī)學院：1.附屬西安市中心醫(yī)院普外2科，陜西西安 710004； 2.第一附屬醫(yī)院肝膽外科，陜西西安 710061；3. 第二附屬醫(yī)院急診科，陜西西安 710004)

轉移是惡性腫瘤的重要生物學特性，腫瘤轉移與患者的生活質量、生存時間密切相關，多數(shù)腫瘤治療失敗的原因是因為發(fā)生轉移，許多癌癥患者并非死于原發(fā)癌而死于轉移灶[1]。因此治療和預防腫瘤的轉移在腫瘤治療中顯得尤為重要。胰腺癌早期并無特異的臨床表現(xiàn)，很難早期發(fā)現(xiàn)，因此很多患者于初次就診時已發(fā)現(xiàn)有轉移，是預后最差的腫瘤之一[2]。目前胰腺癌尚無特異性治療藥物。國內外多項研究表明，白藜蘆醇(resveratrol, Res)對鼻咽癌、肺癌、肝癌、腸癌、胃癌、乳腺癌、白血病、甲狀腺癌等均有拮抗作用[3-5]，是一種極有發(fā)展前途的抗癌新藥。但Res對胰腺癌細胞侵襲轉移的作用尚不十分清楚。本實驗以不同濃度Res作用于胰腺癌Miapaca-2細胞，觀察其對胰腺癌Miapaca-2細胞侵襲轉移的影響，進一步明確Res對胰腺癌的作用機制，為臨床研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料人胰腺癌細胞株PC-2購自北京協(xié)和醫(yī)學院。Res購自美國Sigma公司，純度>99.9%用二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)溶解，配成400 μmol/L貯存液，消毒后，分裝于-20 ℃凍存?zhèn)溆?，處理細胞時用≤1 g/L DMSO(實驗證實該質量濃度對細胞生長無影響)。5-Fu注射液購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司。MTT取自美國Sigma公司。DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶為Hyclone公司產(chǎn)品，胎牛血清(FBS)購自元亨金馬公司。Transwell小室(24孔)、96孔板(Costar, USA)。Matrigel基質膠購自BD Biosciences公司。逆轉錄試劑盒購自北京瑞爾欣德科技有限公司；SYBR GreenⅠ購自TaKaRa寶生物工程有限公司；熒光定量PCR儀(Roche lightcy-cler 480，瑞士)；PCR儀(Bio-Rad，USA)，MMP-7、MMP-9及β-actin引物由TaKaRa公司合成。Western blot用MMP-7及MMP-9單克隆一抗、二抗購自美國Santa Cruz公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2細胞培養(yǎng)及分組細胞培養(yǎng)：人胰腺癌miaPaCa-2細胞在50 mL/L CO2，37 ℃條件下，用含100 mL/L小牛血清、10 g/L L-谷氨酰胺、100 IU/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)至70%～80%融合時，用2.5 g/L胰酶消化傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

實驗分5組：Res高、中、低濃度組及5-Fu組、陰性對照組。Res高、中、低濃度分別為200、100、50 μmol/L)。5-Fu組(0.75 mg/mL)為陽性對照組。陰性對照組為培養(yǎng)細胞不加藥物處理，只加含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液。濃度選擇參照文獻[6]。

1.3Res對PC-2細胞的粘附實驗預先用Matrigel包被96孔板。將干預24 h后的細胞消化并調至細胞密度為1×106/mL，接種于已包被的96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，分設5組(培養(yǎng)液為空白對照調零組)，每組設5個復孔，置于37 ℃，50 mL/L CO2飽和濕度下的培養(yǎng)箱內孵育4 h后PBS溶液沖洗2遍，每孔加入MTT 20 μL，培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液。每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min。用酶聯(lián)儀于490 nm處測量各孔的吸光度(A)值。每組設5個復孔，取平均值。計算細胞黏附抑制率=(陰性對照組A值-藥物組A值)/陰性對照組A值×100%。

1.4Res對PC-2細胞的侵襲實驗將matrigel基質膠用不含血清的冷DMEM稀釋至5 mg/mL，取100 μL稀釋膠加到24孔transwell上室中，37 ℃孵育transwell 4 h，重建基底膜。對數(shù)生長期的細胞經(jīng)藥物Res干預24 h后進行實驗，分別胰酶消化，用50 mL/L FBS的DMEM調整細胞密度到5×105/mL。24孔板transwell小室上室加200 μL細胞懸液，下室中加入600 μL細胞培養(yǎng)基(含200 mL/L FBS的DMEM)。37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h，結晶紫染色并計數(shù)。取5個視野(上中下左右)，照相，計數(shù)。細胞侵襲抑制率=(陰性對照組細胞數(shù)-藥物組細胞數(shù))/陰性對照組細胞數(shù)×100%。

1.5Res對PC-2細胞的遷移實驗除不鋪膠外，其余步驟與侵襲實驗相同。細胞遷移抑制率=(陰性對照組細胞數(shù)-藥物組細胞數(shù))/陰性對照組細胞數(shù)×100%。

1.6Westernblot檢測MMP-7和MMP-9蛋白的表達將藥物干預24 h的5組細胞用細胞裂解液裂解，分別提取各組細胞總蛋白，在120 g/L聚丙稀酰胺凝膠中電泳，將蛋白電轉移至硝酸纖維膜上，用含100 g/L脫脂奶粉的TBS封閉2 h后分別與抗β-actin、MMP-7、MMP-9單克隆抗體雜交，再與相應的二抗反應，陽性條帶用化學發(fā)光法檢測。

1.7實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測MMP-7和MMP-9mRNA的表達藥物干預PC-2細胞24 h后采用Fastgen200試劑盒按照操作說明書進行總RNA提取。按Fermentas逆轉錄試劑盒合成cDNA。以NCBI GenBank中提供的人類基因序列行MMP-7和MMP-9、內參基因β-actin的引物設計，由TaKaRa生物工程有限公司合成，引物序列分別是：β-actin：Forward 5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′，Reverse 5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′；MMP-7：Forward 5′-GTGCTGAAGGACACACTAAAGAAGA-3′，Reverse 5′-TTGCCATCCTTCTCAAAGTTGTAGG-3′；MMP-9：Forward 5′-CGCAGACATCGTCATCCAGT-3′，Reverse 5′-GGATTGGCCTTGGAAGATGA-3′。β-actin作為內參基因評估MMP-7和MMP-9的相對表達。PCR反應體系(10 μL)：SYBR Premix ExTaqTMⅡ 5 μL，cDNA 4 μL，上游引物0.3 μL，下游引物0.3 μL，水0.4 μL。反應條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s；60 ℃延伸30 s；共35個循環(huán)。在PCR反應過程中，同時用去離子水代替反轉錄產(chǎn)物作為PCR反應體系的陰性對照，以排除操作中DNA污染。獲取融解曲線以確認PCR反應的特異性。2-ΔΔCt計算MMP-7、MMP-9的相對表達水平。

2 結 果

2.1Res對Miapaca-2細胞粘附、侵襲、遷移的實驗結果Res干預Miapaca-2細胞24 h后，對胰腺癌PC-2細胞的粘附、侵襲、遷移能力具有明顯抑制作用，接種于含matrigel的96孔板貼壁細胞減少(圖1)，酶聯(lián)儀檢測的吸光度A值明顯減小，分解基質膠穿過基底膜的穿膜細胞數(shù)量減少(圖2、圖3)，與陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，且不同濃度Res組結果進行分析顯示該抑制作用呈濃度效應關系，隨濃度增大抑制作用明顯增強(P<0.01，圖4)。

圖1Res對Miapaca-2細胞粘附能力的影響

Fig.1 Effects of Res on the adhesion ability of pancreatic cancer Miapaca-2 cells (×200)

A：Res高濃度組；B：陰性對照組。

2.2Res對Miapaca-2細胞MMP-7和MMP-9蛋白表達的影響Res干預Miapaca-2細胞24 h后，采用Western blot檢測Miapaca-2細胞內MMP-7及MMP-9蛋白的表達，結果顯示Res組及5-FU組較陰性對照組的蛋白表達水平均降低(P<0.01)，Res 3個濃度組間隨濃度增加表達水平逐漸降低，分析顯示呈濃度效應關系(圖5)。

圖2Res對人胰腺癌Miapaca-2細胞侵襲能力的影響

Fig.2 Effects of Res on the invasive ability of pancreatic cancer Miapaca-2 cells (×200)

A：Res高濃度組；B：陰性對照組。

圖3Res對Miapaca-2細胞遷移能力的影響

Fig.3 Effects of Res on the migration ability of pancreatic cancer Miapaca-2 cells (×200)

A：Res高濃度組；B：陰性對照組。

圖4不同濃度Res對Miapaca-2細胞粘附、侵襲及遷移抑制率的變化

Fig.4 Inhibition rate of different-concentration Res on adhesion, invasion and migration of pancreatic cancer Miapaca-2 cells

2.3Res對Miapaca-2細胞MMP-7和MMP-9mRNA表達的影響Res干預Miapaca-2細胞24 h后，實時定量PCR結果顯示Res及5-Fu組的MMP-7及MMP-9 mRNA的表達明顯低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，MMP-7及MMP-9表達在Res 3個濃度組間隨濃度增加，表達水平逐漸降低，并顯示呈濃度效應關系(圖6)。

圖5Res對Miapaca-2細胞MMP-7和MMP-9蛋白表達的影響

Fig.5 Effects of Res on the protein expression of MMP-7 and MMP-9 in pancreatic cancer Miapaca-2 cells

與陰性對照組比較，*P<0.01；與Res 50 μmol/L組(低濃度組)比較，△P<0.01；與Res 100 μmol/L組(中濃度組)比較，□P<0.01；與5-Fu組比較，○P<0.05。

圖6Res對Miapaca-2細胞MMP-7和MMP-9mRNA表達的影響

Fig.6 Effects of Res on the mRNA expression of MMP-7 and MMP-9 in pancreatic cancer Miapaca-2 cells

與陰性對照組比較，*P<0.01；與Res 50 μmol/L組(低濃度組)比較，△P<0.01；與Res 100 μmol/L組(中濃度組)比較，□P<0.01；與5-FU組比較，○P<0.01。

3 討 論

Res化學名為3，5，4-三羥基-1，2-二苯乙烯, 是含有芪類結構的非黃酮類多酚化合物，分子式為C14H12O3，已發(fā)現(xiàn)存在于虎杖、葡萄等72種植物(隸屬12個科，32個屬)，我國中藥植物虎杖鮮根中有較高的含量[7]。近來研究表明Res可通過降低癌細胞的遷移能力來抑制轉移[8-11]，但在胰腺癌方面研究甚少。胰腺癌是預后最差的腫瘤之一[12]，其預后差、死亡率高的一項重要原因是發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)發(fā)生轉移, 診斷后中位生存期不到6個月。因此，深入了解胰腺癌侵襲和轉移的分子生物學機制，對于提高胰腺癌的療效起到重要作用。本文主要從腫瘤轉移過程中的黏附、侵襲、遷移等方面，研究Res對胰腺癌Miapaca-2細胞侵襲、轉移能力的影響。

腫瘤轉移的基本過程大致為原發(fā)瘤的增殖、腫瘤新生血管的生成、瘤細胞侵襲基底膜及細胞外基質、侵入血管或淋巴管、瘤細胞遷移到遠隔器官、滯留于靶器官微小血管中、穿出血管形成微小轉移灶、腫瘤血管形成、轉移癌灶增殖，增殖到一定大小后繼續(xù)向其他部位轉移[13]。簡而言之，腫瘤轉移的形成必須具備以下的能力：腫瘤細胞增殖、黏附、侵襲、遷移、腫瘤血管生成等。本研究發(fā)現(xiàn)Res干預Miapaca-2細胞24 h后，明顯抑制胰腺癌細胞對細胞外基質的黏附能力、遷移能力，這種抑制作用隨著Res濃度的增加而增強。

腫瘤轉移機制的研究經(jīng)歷了50～60年代的形態(tài)學理論及70年代末的現(xiàn)代免疫學理論，伴隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展，形成了基因調控下的腫瘤轉移理論，這種觀點認為，腫瘤轉移與相關基因有密切關系。其中腫瘤相關基因MMPs是鋅離子依賴的內分泌蛋白酶，主要參與細胞外基質的降解、細胞間黏附調節(jié)、新血管的形成，目前發(fā)現(xiàn)MMPs家族成員己達20多種。研究發(fā)現(xiàn)MMP-2、MMP-7、MMP-9在腫瘤組織中都呈現(xiàn)高表達[14-16]，其中MMP-7和MMP-9與腫瘤細胞的浸潤轉移及預后密切相關。因此，以MMP為靶點的靶向治療成為腫瘤治療的研究熱點[17]，而很多抗腫瘤藥物都可通過抑制MMP的表達及分泌來發(fā)揮抗轉移作用。

本研究通過Western blot及Real-time PCR方法分別研究了Res對Miapaca-2細胞MMP-7和MMP-9蛋白及mRNA表達的影響，發(fā)現(xiàn)Res可明顯抑制MMP-7和MMP-9蛋白及mRNA的表達，并呈現(xiàn)明顯的濃度效應依賴關系，這也解釋了Res可能通過下調MMP-7和MMP-9的表達來抑制胰腺癌Miapaca-2細胞黏附、侵襲、遷移，從而抑制胰腺癌轉移。

因此，本研究結果為Res作為抗胰腺癌新藥進入臨床研究及以后的臨床應用奠定了良好的實驗基礎。

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