董欣鑫，姚 蘭，方 芳，許 峰

(1. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院PICU，兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部 重點實驗室，重慶 400014；2. 太鋼總醫(yī)院，山西太原 030003)

慢性肺疾病(chronic lung disease, CLD)或支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia, BPD)是新生兒持續(xù)用氧治療后的一種肺氧化性損傷疾病，嚴(yán)重影響患兒的肺發(fā)育和呼吸功能[1]。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cell type Ⅱ, AECⅡ)作為肺組織的干細(xì)胞，其增殖分化不僅可以修復(fù)肺泡的正常結(jié)構(gòu)，而且可以有效改善肺功能。因此AECⅡ是決定肺損傷上皮細(xì)胞恢復(fù)正常功能狀態(tài)的主要因素[2]。

神經(jīng)肽P物質(zhì)(substance P, SP)是一種細(xì)胞外信號分子和細(xì)胞調(diào)控因子，釋放后可與神經(jīng)激肽1受體(NK1R)結(jié)合，參與調(diào)控?fù)p傷細(xì)胞的修復(fù)、增殖、分化[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)SP可減輕高氧致AECⅡ的凋亡，促進其增殖[4]，具有一定的保護效應(yīng)。但其作用機制尚不清楚。研究表明Notch信號在肺發(fā)育中起重要作用，可能參與支氣管樹及氣血屏障的形成，且對呼吸道上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞的成熟分化有重要調(diào)節(jié)作用[5]。因此，SP可能通過參與調(diào)節(jié)Notch信號的表達(dá)起到保護高氧肺損傷的作用。

本研究以原代培養(yǎng)的早產(chǎn)大鼠AECⅡ為研究對象，觀察SP干預(yù)對高氧致AECⅡ細(xì)胞凋亡、氧化損傷、增殖及Notch1、Notch3表達(dá)的影響，擬探討SP對高氧肺損傷細(xì)胞的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑孕19 d Sprague-Dawley(SD)大鼠36只(清潔級成年孕鼠，體質(zhì)量240～260 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)；SP(美國Abcam公司)；SP拮抗劑L703.606、膠原酶、噻唑藍(lán)(MTT)溶液(美國Sigma公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(美國Hyclone公司)；超氧化物陰離子熒光探針檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；細(xì)胞AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；兔抗鼠Notch1及Notch3多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(美國CST公司)；BCA蛋白定量檢測試劑盒(北京百泰克公司)，Trizol總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)。

1.2早產(chǎn)大鼠AECⅡ的分離、培養(yǎng)及鑒定取孕19 d的大鼠，經(jīng)剖宮產(chǎn)取出胎鼠，分離、純化、培養(yǎng)AECⅡ，具體方法參考文獻[6]。經(jīng)透射電鏡觀察及改良巴氏染色法證實細(xì)胞存活率及純度均在90%以上后備用。

1.3氧化損傷性細(xì)胞模型建立及實驗分組原代AECⅡ經(jīng)培養(yǎng)24 h后，隨機分為以下4組：①空氣組：將細(xì)胞置于含50 mL/L CO2的孵箱中培養(yǎng)；②高氧組：將細(xì)胞置于50 mL/L CO2、950 mL/L O2的密閉氧倉中；③高氧+SP組：細(xì)胞培養(yǎng)液中預(yù)先加入5×10-8mol/L的SP，再行高氧處理；④高氧+SP+ L703.606組：細(xì)胞培養(yǎng)液中預(yù)先加入5×10-8mol/L SP和5×10-7mol/L L703.606，其余處理同高氧組。各組細(xì)胞干預(yù)并培養(yǎng)24 h。

1.4AnnexinV/PI雙標(biāo)記法檢測AECⅡ凋亡將原代培養(yǎng)的AECⅡ細(xì)胞接種于6孔板，調(diào)整密度為1×106個/mL，經(jīng)分組處理后，胰酶消化并收集各種貼壁細(xì)胞，PBS清洗2次，重懸于結(jié)合液[10 mmol/L N-(2-羥乙基)哌嗪-N-2-乙烷磺酸(Hepes)/NaOH，pH 7.4，140 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L CaCl2]中，吹打成單細(xì)胞懸液，加入5 μL AnnexinV-FITC及10 μL PI于常溫避光處孵育15 min，經(jīng)流式細(xì)胞儀激發(fā)波長為488 nm處檢測，F(xiàn)ITC受激發(fā)后發(fā)出綠色熒光，PI發(fā)紅色激光，凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為FITC高染而PI低染(FITC+PI-)，計算出該區(qū)域的細(xì)胞比例。

1.5超氧化物陰離子含量的測定原代培養(yǎng)的AECⅡ細(xì)胞，以1×106個/mL 密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)小室中，按上述分組處理24 h后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入1 μmol/L的Dihydroethidium(超氧化物陰離子熒光探針)溶液1 mL和細(xì)胞一起在37 ℃孵育30 min左右進行熒光探針裝載，PBS液洗滌2次，在激發(fā)波長為535 nm，發(fā)射波長610 nm條件下，用微孔板檢測系統(tǒng)(SpectraMax M5/M5e)檢測各樣本平均熒光強度(MFI)，用激光共聚焦顯微鏡觀察圖像并采集保存，統(tǒng)計學(xué)分析各熒光強度值。

1.6MTT法檢測細(xì)胞存活率將原代分離的AECⅡ接種于96孔板，調(diào)整密度為1×104/mL，24 h后換液，按上述方法處理24 h后，加入5 mg/mL MTT，20 μL/孔，放入孵箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h，棄上清，加入二甲基亞砜150 μL/孔，震蕩10 min后，酶標(biāo)儀檢測492 nm處各孔吸光度值(A值)。細(xì)胞存活率=處理孔A492/對照孔A492×100%。

1.7熒光定量PCR檢測Notch1和Notch3采用Trizol一步法提取AECⅡ的總RNA，測定吸光度A260/A280值，計算提取的總RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR引物由Primer premier 5.0自行設(shè)計。擴增Notch1基因正義鏈的引物序列：5′-TGGATGAGGAAGACAAGCATTA-3′，反義鏈序列為：5′-GAAAAGCCACCGAGATAGTCAG-3′，擴增片段為136 bp；擴增Notch3基因正義鏈的引物序列：5′-GACAAGGACCACTCCCACTACT-3′，反義鏈序列為：5′-ATCCACATCATCCTCACAACTG-3′，擴增片段為136 bp；GAPDH正義鏈的引物序列：5′-GCAAGTTCAACGGCACAGTCA-3′，反義鏈序列為：5′-TCACCCCATTTGATGTTAGCG-3′，擴增片段為106 bp。反應(yīng)體系25 μL，反應(yīng)條件：95 ℃變性30 s，Notch1、Notch3、GAPDH基因的退火溫度分別為59 ℃、60 ℃、60 ℃，退火30 s，95 ℃延伸15 s，共40個循環(huán)。根據(jù)擴增曲線和溶解曲線檢測反應(yīng)的特殊性，結(jié)果以GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化，應(yīng)用CFX Manager軟件計算目的基因的相對表達(dá)量。

1.8Westernblot檢測Notch1、Notch3蛋白水平全蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取蛋白質(zhì)30 μg上樣，經(jīng)100 g/L的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，含50 g/L的脫脂奶粉的TBST封閉后，分別加入Notch1多克隆抗體、Notch3多克隆抗體，4 ℃孵育過夜，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h，用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測，蛋白條帶用Quantity One 4.5.0軟件分析處理。

2 結(jié) 果

2.1高氧及SP干預(yù)對AECⅡ存活率和凋亡率的影響與空氣組比較，高氧組暴露后24 h，細(xì)胞凋亡率顯著升高，細(xì)胞存活率明顯受到抑制(P<0.01，表1)。高氧+SP組可明顯降低高氧暴露后細(xì)胞凋亡率，提高細(xì)胞存活率，與高氧組和高氧+SP+L703.606組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表1)。

表1高氧暴露及SP干預(yù)對AECⅡ細(xì)胞存活及凋亡的影響

Tab.1 Effect of hyperoxia exposure and SP intervention on survival rate and apoptosis rate of AECⅡ

n=6)

與空氣組比較，*P<0.01；與高氧+SP組比較，#P<0.01。

2.2高氧及SP干預(yù)對AECⅡ超氧化物陰離子水平的影響與空氣組比較，高氧組暴露后24 h，細(xì)胞超氧化物陰離子水平顯著升高(P<0.01)。高氧+SP組可明顯降低高氧暴露后細(xì)胞的超氧化物陰離子水平，與高氧組及高氧+SP+L703.606組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖1)。

圖1 高氧及SP干預(yù)對AECⅡ超氧化物陰離子熒光水平的影響Fig.1 Effect of hyperoxia exposure and SP intervention on the level of intracellular superoxide anion A:超氧化物陰離子熒光強度表達(dá)(×400);B:定量分析。1:空氣組;2:高氧組;3:高氧+SP組;4:高氧+SP+L703.606組。與空氣組比較,*P<0.01;與高氧組比較,#P<0.01;與高氧+SP組比較,&P<0.01。

2.3SP及高氧暴露對AECⅡ內(nèi)Notch1、Notch3基因水平的影響與空氣組比較，高氧組Notch1基因水平表達(dá)明顯降低(P<0.01)，Notch3基因水平表達(dá)顯著升高(P<0.01)，高氧+SP組與單純高氧組比較，Notch1基因水平表達(dá)升高，Notch3基因水平表達(dá)降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖2)。

圖2SP及高氧暴露對AECⅡ內(nèi)Notch1、Notch3基因水平的影響

Fig.2 Effect of hyperoxia exposure and SP intervention on the mRNA expression of Notch1 and Notch3 in AECⅡ

1：空氣組；2：高氧組；3：高氧+SP組；4：高氧+SP+L703.606。與空氣組比較，*P<0.01；與高氧組比較，#P<0.01；與高氧+SP組比較，&P<0.01。

2.4SP及高氧暴露對AECⅡ內(nèi)Notch1、Notch3蛋白質(zhì)水平的影響與空氣組相比，高氧組Notch1蛋白水平表達(dá)明顯降低(P<0.01)，Notch3蛋白水平表達(dá)顯著升高(P<0.01)，高氧+SP組與單純高氧組比較，Notch1蛋白水平表達(dá)升高，Notch3蛋白水平表達(dá)降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3)。

圖3SP及高氧暴露對AECⅡ內(nèi)Notch1、Notch3蛋白質(zhì)水平的影響

Fig.3 Effect of hyperoxia exposure and SP intervention on the protein expression of Notch1 and Notch3 in AECⅡ

A：Western blot檢測結(jié)果；B：半定量分析結(jié)果。1：空氣組；2：高氧組；3：高氧+SP組；4：高氧+SP+L703.606組。與空氣組比較，*P<0.01；與高氧組比較，#P<0.01；與高氧+SP組比較，&P<0.01。

3 討 論

BPD是新生兒接受高濃度氧治療的嚴(yán)重并發(fā)癥之一[1]。主要原因是高濃度氧導(dǎo)致肺組織細(xì)胞的ROS產(chǎn)生增多，包括羥自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O2-)等，過量的ROS可通過氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡甚至壞死[7]。肺損傷的修復(fù)主要依賴于AECⅡ的增殖分化，而高氧刺激可抑制AECⅡ的增殖，促進其凋亡。因此尋找保護AECⅡ氧化損傷的因素，可為高氧肺損傷的防治提供理論基礎(chǔ)。

SP作為一種感覺神經(jīng)肽，具有修復(fù)細(xì)胞增殖、遷移、分化等多種生物學(xué)效應(yīng)[3]。OSLUND等[8]發(fā)現(xiàn)通過活化NK1R有助于肺損傷后上皮細(xì)胞增殖，是參與損傷修復(fù)的重要因素。DIB等[9]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肽遞質(zhì)能通過激活NK1R起到保護急性高氧肺損傷的作用。本實驗室黃波等[4]發(fā)現(xiàn)SP對高氧狀態(tài)下AECⅡ的損傷有明顯保護作用，但其作用機制尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，SP干預(yù)后可減輕氧化損傷，降低細(xì)胞凋亡率，增加細(xì)胞增殖活性，此結(jié)果同前期結(jié)果[4]一致。SP的拮抗劑L703.606干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)超氧化物陰離子水平、細(xì)胞凋亡率較SP干預(yù)后明顯增加，細(xì)胞增殖率明顯降低，進一步支持SP可以減輕AECⅡ的氧化損傷，促進細(xì)胞增殖。

為研究SP作用所涉及的分子機制，本研究對高氧及SP干預(yù)下Notch信號通路的活化情況做了進一步的觀察。Notch信號途徑廣泛存在于脊椎動物和無脊椎動物并且高度保守，是胚胎發(fā)育所必需的細(xì)胞間調(diào)節(jié)信號，由Notch1～4、配體(Delta、Jagged)及目的基因Su(H)、Hes組成，通過Notch受體和配體相互作用，發(fā)生2次裂解后形成活化的胞內(nèi)區(qū)，進而與胞質(zhì)和胞核內(nèi)的相關(guān)蛋白結(jié)合來調(diào)控Su(H)、Hes基因的轉(zhuǎn)錄，最終影響多種細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育[10]。近年來研究表明Notch信號可能在調(diào)控肺泡上皮細(xì)胞的分化發(fā)育中起重要作用[11]。TAICHMA等[12]發(fā)現(xiàn)Notch 1及Jagged 1在肺泡微血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面定位表達(dá)。XING等[13]發(fā)現(xiàn)Notch1在氣道損傷修復(fù)中起關(guān)鍵作用。DANG等[14]在活化 Notch3轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)大量的I型上皮細(xì)胞，可見Notch3的持續(xù)異位表達(dá)影響了上皮細(xì)胞的正常分化，最終造成肺形態(tài)學(xué)改變及發(fā)育延遲。

本研究以高氧暴露損傷AECⅡ模型作為研究對象，對Notch1和Notch3的表達(dá)進行了研究。結(jié)果顯示，高氧暴露下AECⅡ內(nèi)Notch1信號分子表達(dá)明顯減弱，Notch3信號分子表達(dá)明顯增加，與空氣組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而高氧暴露前給予SP干預(yù)后，Notch1表達(dá)有所增加，Notch3表達(dá)有所降低，表明SP可逆轉(zhuǎn)高氧對Notch信號分子的作用。研究表明，Notch1的活性增加后，與相關(guān)配體結(jié)合，進而引起目的基因Su(H)、Hes的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，細(xì)胞進入增殖分化程序，發(fā)育成功能細(xì)胞[10]。因此，推測高氧暴露前給予SP干預(yù)后，Notchl表達(dá)的上調(diào)是促進AECⅡ分化增殖的主要機制之一，有助于高氧損傷上皮細(xì)胞的修復(fù)。Notch3活性上調(diào)可能通過抑制Notch1信號分子的表達(dá)，阻止 AECⅡ分化，兩者間存在一個制約關(guān)系。因此，Notch3的活化是高氧阻滯AECⅡ分化增殖的重要因素，對高氧引起的AECⅡ損傷修復(fù)起負(fù)面作用，而給予SP干預(yù)后可解除這一作用，從而促進高氧損傷AECⅡ的存活。

綜上所述，SP可能通過Notch通路的介導(dǎo)，減輕了高氧對AECⅡ的氧化損傷，降低了AECⅡ的凋亡，促進AECⅡ的增殖，利于肺損傷的修復(fù)，為BPD的防治提供了新的方向。

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