劉小慧，章 濤，張 潛，劉金偉，劉祖林，湯寧寧

(1. 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563099； 2. 遵義醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，貴州遵義 563003)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)因其具有體外擴(kuò)增能力強(qiáng)和多向分化潛力而成為成體干細(xì)胞研究的主要種子細(xì)胞來源[1-4]，尤其是圍繞骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMMSCs)的研究最為廣泛和深入[5-6]。盡管BMMSCs有其固有的優(yōu)勢(shì)，并具備良好的應(yīng)用前景，然而抽取一定量的骨髓會(huì)給患者帶來痛苦并有一定的安全風(fēng)險(xiǎn)，且隨著年齡的增大，BMMSCs的數(shù)量和增殖、分化能力將明顯下降[7]。因此，尋找具有臨床應(yīng)用前景的MSCs新來源已成為干細(xì)胞研究的新的關(guān)注點(diǎn)。

外周血是否存在具有MSCs特性的干細(xì)胞(peripheral blood derived mesenchymal stem cells, PBMSCs)尚存爭(zhēng)議。相悖的研究報(bào)道可能與不同作者采用的分離、培養(yǎng)體系和方案存在差異有關(guān)[8-11]。外周血是否存在PBMSCs及其生物學(xué)特性還有待深入研究方可確定。若PBMSCs存在并具有與BMMSCs一樣的增殖和分化能力，其具有的取材方便無痛苦等優(yōu)勢(shì)，有望成為MSCs新的替代資源之一。本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)員后兔外周血，對(duì)其進(jìn)行MSCs集落形成能力分析，并對(duì)分離、培養(yǎng)的兔PBMSCs進(jìn)行神經(jīng)元誘導(dǎo)分化，以驗(yàn)證PBMSCs的存在并確定其含量，并為今后PBMSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年新西蘭大白兔，雌雄不拘，體質(zhì)量1.5～2 kg，由重慶騰鑫技術(shù)有限公司提供。本研究所采用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及操作程序經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審議批準(zhǔn)。

1.2主要試劑與儀器粒細(xì)胞集落刺激因子G-CSF(北京四環(huán)生物制藥有限公司)；α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)；胰蛋白酶、L-谷氨酰胺(Glu，美國Hyclone公司)；Ficoll分離液(天津美德太平洋科技有限公司)；全反式維甲酸(Sigma公司)；神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)單克隆抗體、山羊血清封閉液(武漢博士德生物工程有限公司)；神經(jīng)元核蛋白(NeuN)單克隆抗體(Millipore公司)；EnVision法HRP標(biāo)記二抗(DAKO公司)；DAB(Gene Tech公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)及存活率分析儀(Beckman Coulter, USA)；倒置顯微鏡(DMIRB DIC，Leica, Germany)；自動(dòng)顯微照相裝置(PM20-35, Olympus, Japan)。

1.3兔PBMSCs的分離、培養(yǎng)G-CSF按30 μg/(kg·d)劑量給予兔皮下注射，連用6 d，于第7天抽取兔抗凝外周血20 mL，按1︰1比例加入PBS液稀釋，再加入到含F(xiàn)icoll分離液的離心管中，離心后吸取白膜層細(xì)胞(富含單個(gè)核細(xì)胞層)，采用紅細(xì)胞溶解液裂解紅細(xì)胞，PBS液洗滌后，細(xì)胞存活率分析儀計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力，用含150 mL/L FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、50 mL/L CO2飽和濕度條件下進(jìn)行原代培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)80%左右時(shí)，用1.25 g/L的胰蛋白酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)同時(shí)采集未經(jīng)G-CSF動(dòng)員的兔外周血，按相同方法進(jìn)行PBMSCs的分離、培養(yǎng)。

1.4兔PBMSCs的集落形成率參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法[12]對(duì)兔外周血樣品進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞集落形成率(CFE)的檢測(cè)與計(jì)算，大致步驟為：分別將分離的未動(dòng)員及動(dòng)員后的兔外周血單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按5×105/cm2接種于6孔板中，用含150 mL/L FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基置于37 ℃、50 mL/L CO2飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，3 d后換液，14 d后100 mL/L甲醛固定，結(jié)晶紫染色5 min，置解剖鏡下觀察，對(duì)細(xì)胞數(shù)目超過50個(gè)的集落(也稱集落形成單位，CFU)進(jìn)行計(jì)數(shù)。集落形成率=集落形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)(單位用/106表示)。

1.5兔PBMSCs向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化取第2代細(xì)胞，用1.25 g/L胰蛋白酶消化后接種到預(yù)置蓋玻片的6孔板中，細(xì)胞接種密度調(diào)整為2.5×104/cm2，待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)50%時(shí)(通常為培養(yǎng)24 h)，棄去原培養(yǎng)基，誘導(dǎo)組細(xì)胞換成含1 μmol/L全反式維甲酸(ATRA)、200 mmol/L Glu和100 mL/L FBS的α-MEM培養(yǎng)基(2 mL/孔誘導(dǎo)培養(yǎng)液)。對(duì)照組仍用150 mL/L FBS的α-MEM培養(yǎng)基換液，兩組于37 ℃、50 mL/L CO2飽和濕度下培養(yǎng)，每48 h換液1次，倒置顯微鏡觀察形態(tài)變化，培養(yǎng)96 h 后采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的NeuN、NSE表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)：一抗為抗兔NSE或NeuN單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，再滴加HRP標(biāo)記二抗，DAB顯色，自來水沖洗(NSE需做蘇木素復(fù)染30 s)，自然干燥后倒置顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié) 果

2.1兔PBMSCs的培養(yǎng)特點(diǎn)細(xì)胞存活分析儀分析顯示，經(jīng)密度梯度離心和紅細(xì)胞裂解后的分離外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞活力均在95%以上。動(dòng)員后的外周血單個(gè)核細(xì)胞原代培養(yǎng)24 h后，鏡下可見較多短梭形及多角形貼壁細(xì)胞散在生長(zhǎng)，3 d首次換液棄去未貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)集落樣生長(zhǎng)(圖1A)，接種10 d左右細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)80%以上；傳代培養(yǎng)的PBMSCs形態(tài)均一，呈長(zhǎng)梭形漩渦狀生長(zhǎng)(圖1B)。而未動(dòng)員PBMSCs原代培養(yǎng)24 h后，較少細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)(圖1C)，培養(yǎng)10 d左右，僅有少量集落形成，且細(xì)胞易老化，傳代培養(yǎng)均告失敗(圖1D)。

圖1兔PBMSCs生長(zhǎng)形態(tài)

Fig.1 Morphology of cultured rabbit PBMSCs (×100)

A：動(dòng)員組PBMSCs原代培養(yǎng)第3天；B：動(dòng)員組PBMSCs培養(yǎng)第2代生長(zhǎng)形態(tài)；C：未動(dòng)員組PBMSCs原代培養(yǎng)第3天；D：未動(dòng)員組PBMSCs原代培養(yǎng)第10天。

2.2兔PBMSCs集落形成率本實(shí)驗(yàn)中共采集8份動(dòng)員后兔外周血標(biāo)本，均成功獲得集落形成；4份未動(dòng)員外周血標(biāo)本，僅1份形成集落，3份均未能形成集落(圖2)。以每百萬個(gè)單個(gè)核細(xì)胞中集落形成單位數(shù)計(jì)算的集落形成率，動(dòng)員組在2.8～10.8個(gè)/106之間，未動(dòng)員組為0～3個(gè)/106之間。換言之，動(dòng)員組外周血成纖維樣細(xì)胞集落形成率為每百萬單個(gè)核細(xì)胞中有(6.76±2.42)個(gè)，明顯高于未動(dòng)員組(0.75±1.29)個(gè)的水平(P<0.01)。

圖2兔PBMSCs集落形成率

Fig.2 Colony forming efficiency of rabbit PBMSCs

A：未動(dòng)員兔外周血成纖維樣細(xì)胞集落形成單位(CFU-Fs)；B：動(dòng)員兔外周血成纖維樣細(xì)胞集落形成單位(CFU-Fs)。放大倍數(shù)：左圖×7，右圖×40。

2.3兔PBMSCs神經(jīng)元誘導(dǎo)分化能力本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)的兔PBMSCs經(jīng)神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)96 h后細(xì)胞胞體回縮，細(xì)胞出現(xiàn)雙極或多極細(xì)胞突起，并向胞體周圍伸展，類似神經(jīng)元形態(tài)(圖3A)；經(jīng)鑒定，這些細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特異性分子NSE和NeuN(圖3C、3D)。而未誘導(dǎo)組細(xì)胞形態(tài)無明顯變化(3B)，也不表達(dá)上述神經(jīng)元特異性標(biāo)志。

3 討 論

外周血中是否存在具有MSCs特性的干細(xì)胞尚存爭(zhēng)議，其存在頻率及生物學(xué)特性仍需進(jìn)一步深入研究。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)采用G-CSF對(duì)兔進(jìn)行動(dòng)員，通過未動(dòng)員和動(dòng)員后PBMSCs原代培養(yǎng)和集落形成率實(shí)驗(yàn)，對(duì)動(dòng)員兔外周血中是否存在MSCs及其存在頻率進(jìn)行分析。PBMSCs原代培養(yǎng)結(jié)果顯示，動(dòng)員后的PBMSCs貼壁細(xì)胞較多，集落形成能力強(qiáng)，且傳代后細(xì)胞呈均一長(zhǎng)梭形漩渦狀生長(zhǎng)；而未動(dòng)員PBMSCs則貼壁細(xì)胞少，易老化，傳代培養(yǎng)失敗，說明了動(dòng)員后兔PBMSCs增殖能力強(qiáng)，細(xì)胞活性好。集落形成率結(jié)果顯示，動(dòng)員后外周血樣品均成功獲得MSCs集落形成，外周血MSCs集落形成率為(6.76±2.42)/106，

圖3兔PBMSCs神經(jīng)元誘導(dǎo)后96h鏡下觀察結(jié)果

Fig.3 Neuron differentiation of rabbit PBMSCs at 96 h of induction (×200)

A：神經(jīng)元誘導(dǎo)組；B：未誘導(dǎo)組；C：誘導(dǎo)組細(xì)胞神經(jīng)元特異性核蛋白(NeuN)染色；D：誘導(dǎo)組細(xì)胞神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)染色。

遠(yuǎn)高于未動(dòng)員的外周血樣品(0.75±1.29)/106，動(dòng)員組外周血MSCs集落形成率已接近骨髓MSCs的數(shù)量級(jí)(其報(bào)道的集落形成率為1/105)[13-14]。上述結(jié)果證明，經(jīng)G-CSF動(dòng)員后的兔外周血中存在著MSCs，其PBMSCs在每百萬個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中含量為2.8～10.8個(gè)。此外，本實(shí)驗(yàn)獲得的兔PBMSCs增殖能力強(qiáng)，細(xì)胞活性高，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，能夠穩(wěn)定從外周血中分離培養(yǎng)出PBMSCs。

本實(shí)驗(yàn)還采用ATRA體外成功誘導(dǎo)了PBMSCs向神經(jīng)元細(xì)胞分化，誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)NSE和NeuN，未經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞則不表達(dá)這些神經(jīng)元細(xì)胞特異標(biāo)志，說明了ATRA具有促進(jìn)PBMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的作用。研究表明，ATRA主要是通過細(xì)胞核膜上的維甲酸受體(RAR)介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[15]。RARs包含由不同基因編碼的α、β與γ 3個(gè)亞型，其中RARβ是一種在神經(jīng)細(xì)胞特異表達(dá)的受體，對(duì)神經(jīng)元表型的決定和維持有重要作用[16]。BI等[17]發(fā)現(xiàn)，MSCs中幾乎不表達(dá)RARβ，ATRA作用后可以增強(qiáng)其RARβ的表達(dá)，促進(jìn)其向成神經(jīng)分化，提示RARβ可能是維甲酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與MSCs成神經(jīng)分化的重要因素。隨后他們又利用針對(duì)RARβ的siRNA腺病毒，在大鼠MSCs中證實(shí)其能有效抑制ATRA誘導(dǎo)的RARβ內(nèi)源性表達(dá)增高，同時(shí)抑制MSCs的體外神經(jīng)分化，進(jìn)一步說明了RARβ在MSCs向神經(jīng)元分化過程中的重要作用[18]。本實(shí)驗(yàn)用ATRA成功誘導(dǎo)了PBMSCs向神經(jīng)元細(xì)胞分化，其作用機(jī)制可能是ATRA通過上調(diào)RARβ激活維甲酸信號(hào)途徑，并產(chǎn)生相應(yīng)效應(yīng)有關(guān)。

目前為止，干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化能力研究仍集中于對(duì)胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞的探討。比較而言，外周血來源的干細(xì)胞具有取材方便、基本無創(chuàng)傷，加之自體外周血干細(xì)胞移植也無倫理限制等優(yōu)勢(shì)，規(guī)避了干細(xì)胞治療應(yīng)用中的免疫排斥反應(yīng)和供體缺乏兩個(gè)關(guān)鍵問題與擔(dān)憂。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從動(dòng)員后的外周血中能穩(wěn)定分離培養(yǎng)出高增殖能力的PBMSCs，適宜條件下可向神經(jīng)元細(xì)胞分化，這為今后臨床應(yīng)用PBMSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了新的有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] BIANCO P, ROBEY PG, SIMMONS PJ. Mesenchymal stem cells:revisiting history, concepts, and assays[J]. Cell Stem Cell, 2008, 2(4):313-319.

[2] ALLICKSON JG, SANCHEZ A, YEFIMENKO N, et al. Recent studies assessing the proliferative capability of a novel adult stem cell identified in menstrual blood[J]. Open Stem Cell J, 2011, 3(2011):4-10.

[3] HE Q, WAN C, LI G. Concise review:multipotent mesenchymal stromal cells in blood[J]. Stem Cells, 2007, 25(1):69-77.

[4] FAAST R, HARRISON SJ, BEEBE LF, et al. Use of adult mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and blood for somatic cell nuclear transfer in pigs[J]. Cloning Stem Cells, 2006, 8(3):166-173.

[5] LUONG-VAN E, GR?NDAHL L, SONG S, et al. Theinvivoassessment of a novel scaffold containing heparan sulfate for tissue engineering with human mesenchymal stem cells[J]. J Mol Histol, 2007, 38(5):459-468.

[6] GOLDBERG ED, DYGAI AM, ZYUZ'KOV GN, et al. Mechanisms of mobilization of mesenchymal precursor cell under the effect of granulocytic colony-stimulating factor and hyaluronidase[J]. Bull Exp Biol Med, 2007, 144(6):802-805.

[7] PEKOVIC V, HUTCHISON CJ. Adult stem cell maintenance and tissue regeneration in the ageing context:the role for A-type lamins as intrinsic modulators of ageing in adult stem cells and their niches[J]. J Anat, 2008, 213(1):5-25.

[8] ZVAIFLER NJ, MARINOVA-MUTAFCHIEVA L, ADAMS G, et al. Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals[J]. Arthritis Res, 2000, 2(6):477-488.

[9] TONDREAU T, MEULEMAN N, DELFORGE A, et al. Mesenchymal stem cells derived from CD133-positive cells in mobilized peripheral blood and cord blood:proliferation, Oct4 expression, and plasticity[J]. Stem Cells, 2005, 23(8):1105-1112.

[10] WEXLER SA, DONALDSON C, DENNING-KENDALL P, et al. Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal stem cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not[J]. Br J Haematol, 2003, 121(2):368-374.

[11] OJEDA-URIBE M, BRUNOT A, LENAT A, et al. Failure to detect spindle-shaped fibroblastoid cell progenitors in PBPC collections[J]. Acta Haematol, 1993, 90(3):139-143.

[12] KUZNETSOV SA, MANKANI MH, ROBEY PG. Effect of serum on human bone marrow stromal cells:exvivoexpansion andinvivobone formation[J]. Transplantation, 2000, 70(12):1780-1787.

[13] GNECCHI M, MELO LG. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells:isolation, expansion, characterization, viral transduction, and production of conditioned medium[J]. Methods Mol Biol, 2009, 482(2):281-294.

[14] MARTINS AA, PAIVA A, MORGADO JM, et al. Quantification and immunophenotypic characterization of bone marrow and umbilical cord blood mesenchymal stem cells by multicolor flow cytometry[J]. Transplant Proc, 2009, 41(3):943-946.

[15] NEZZAR H, CHIAMBARETTA F, MARCEAU G, et al. Molecular and metabolic retinoid pathways in the human ocular surface[J]. Mol Vis, 2007, 13:1641-1650.

[16] MARK M, GHYSELINCK NB, CHAMBON P. Function of retinoid nuclear receptors:lessons from genetic and pharmacological dissections of the retinoic acid signaling pathway during mouse embryogenesis[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2006, 46(1):451-480.

[17] BI Y, GONG M, ZHANG X, et al. Pre-activation of retinoid signaling facilitates neuronal differentiation of mesenchymal stem cells[J]. Dev Growth Differ, 2010, 52(5):419-431.

[18] 畢楊，龔敏，何昀，等. 腺病毒介導(dǎo)siRNA抑制全反式維甲酸誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞RARβ表達(dá)[J]. 生物工程學(xué)報(bào)，2012, 28(5):632-642.