劉 波，孫澤強，劉慶勇，陳 杰，王司軍，楊廣笑，王全穎

(1. 山東大學醫(yī)學院，山東濟南 250012；2. 山東大學附屬濟南市中心醫(yī)院 泌尿外科，山東濟南 250013；3. 西安華廣生物工程公司，陜西西安 710025)

腎癌是一種免疫原性很強的腫瘤，生物免疫治療對其有良好的治療效應，疫苗研究成為目前腎癌免疫治療的熱點之一[1]。G250抗原是碳酸酐酶家族成員之一，它與具有碳酸酐酶活性的細胞黏附因子：碳酸酐酶IX(MN/CA IX)的基因結構完全相同，因此也稱為CA IX(簡稱G250)[2]，其在腎癌組織中高度特異性表達，成為目前腎癌診斷、治療、預后的理想靶點[3-4]。研究證實，腎癌特異性G250抗原中氨基酸249～268形成的抗原肽(G250肽/249)，同時包含CTL表位和Th表位，可誘導CD4+及CD8+的T細胞免疫反應，可刺激機體產(chǎn)生針對該肽的抗腎癌免疫反應,故G250肽/249為腎癌肽疫苗治療的理想靶點[5-6]。目前，以G250抗原表位肽為基礎的腎癌肽疫苗研究已完成相應臨床報告。研究結果表明，單純G250抗原表位肽存在免疫原性弱、在體內(nèi)不能產(chǎn)生理想的抗腎癌治療效應等弱點，而不同免疫佐劑在治療效應方面具有重要作用，故尋找理想的免疫佐劑，增強其免疫原性成為以G250抗原表位肽為基礎的腎癌肽疫苗治療的研究熱點之一[7-8]。故本實驗使用HBcAg作為免疫佐劑，期待提高G250肽/249的免疫原性，將編碼鼠G250肽/249的基因片段插入到HBcAg的主要免疫優(yōu)勢區(qū)(MIR),最終構建出原核表達質粒pET28a(+)/C-G250肽-C,通過原核表達和純化，成功獲得融合蛋白，并進一步分析其免疫原性，為下一步研究該融合蛋白疫苗在小鼠腎癌模型治療效應方面奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料pGEM-T Easy質粒、刪除了MIR區(qū)的重組質粒pGEMEX/HBcAg、原核表達質粒pET28a(+)、大腸桿菌E.coliDH5α和E.coliBL21、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑等試劑由西安華廣生物工程公司提供；T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、羊抗小鼠IgG-HRP購自華美生物工程公司；Ni2+-NTA親和層析蛋白純化柱購自Novagen公司；G250肽/249由西安藍晶生物科技有限公司合成；BALB/c小鼠(6只，雌性，6～8周，體質量15～20 g)購自西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心；引物合成、DNA測序由北京奧科鼎盛生物技術有限公司完成。

1.2方法

1.2.1PCR擴增編碼鼠G250肽特異性抗原表位的基因片段 根據(jù)在GenBank上查詢編碼小鼠的G250肽(249～268)基因序列(GenBank：AB086322.1)，采用非對稱互補引物合成方法，設計正負兩條引物，正向引物的5＇端加入保護堿基C及XhoⅠ酶切位點(CTCGAG)，負向引物5＇端加入BamHⅠ酶切位點(GGATCC)及保護堿基C，為后續(xù)的融合基因連入載體奠定了基礎。

設計引物如下：F：5′-CCTCGAGGAGATCCACGTGGTGCACCTCAGTACTGCTTTCTCCG-AAC-3′，R：5′-CGGATCCGCGGCCCAAGGCTTC-ATGAAGTTCGGAGAAAGC-3′。反應條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性50 s，35 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，共30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。

1.2.2構建重組質粒pGEM-T/G250肽 回收并純化PCR產(chǎn)物，將其連接入 pGEM-T Easy載體，構建重組質粒pGEM-T/G250肽，并轉化入感受態(tài)E.coliDH5α中，使用Amp+培養(yǎng)基篩選陽性菌株，挑取單菌落接種于含Amp+的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，堿性裂解法小提質粒，BamHⅠ及XhoⅠ酶切鑒定并基因序列測序。

1.2.3構建重組質粒pGEMEX-C-G250肽-C 堿性裂解法大量提取質粒pGEM-T/G250肽，XhoⅠ及BamHⅠ雙酶切pGEM-T/G250肽，回收并純化G250肽目的基因片段，將其連接入刪除了MIR區(qū)的pGEMEX/HBcAg中，構建重組質粒pGEMEX-1/C-G250肽-C，然后轉化入感受態(tài)細菌E.coliDH5α中，將陽性表達菌株接種于含Amp+的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，擴增細菌，堿性裂解法小提質粒，將鑒定正確的重組克隆進行DNA序列分析。

1.2.4PCR擴增C-G250肽-C基因片段 pGEMEX/C-G250肽-C重組質粒中C-G250肽-C融合基因兩端的酶切位點分別為EcoRⅠ和SacⅡ，為下一步構建原核表達質粒pET28 a(+)/C-G250肽-C，需將SacⅡ酶切位點更換為SalⅠ酶切位點，故以pGEMEX/C-G250肽-C為模板，設計合成兩條正負引物，PCR擴增C-G250肽-C基因片段。正向引物的5＇端加入保護堿基G且酶切位點為EcoRⅠ(GAATTC)，負向引物5＇端加入保護堿基G且設計酶切位點為SalⅠ(GTCGAC)。

F：5′-GGAATTCATGATTACGCCAAGCTTGGG；R：5′-GGTCGACTCACGGAAGTGTTGATAGGA。反應條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性50 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，共30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。

1.2.5構建重組質粒pGEM-T/C-G250肽-C 回收并純化PCR產(chǎn)物，將其連接入pGEM-T Easy 載體，構建重組質粒pGEM-T/C-G250肽-C，然后轉化入感受態(tài)細菌E.coliDH5α中，將陽性表達菌株接種于含Amp+的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，擴增細菌，堿性裂解法小提質粒，EcoRⅠ及SalⅠ酶切鑒定，將鑒定正確的重組克隆進行DNA序列分析。

1.2.6構建原核表達質粒pET28 a(+)/C-G250肽-C 堿性裂解法大量提取質粒pGEM-T/C-G250肽-C，通過EcoRⅠ、SalⅠ分別酶切pGEM-T/C-G250肽-C及pET28a(+)，制備含有相同黏性末端的目的片段，并分別回收、純化酶切產(chǎn)物，通過T4DNA酶連接，最終構建原核表達質粒pET28a(+)/C-G250肽-C，然后轉化入感受態(tài)E.coliDH5α大腸桿菌中，將陽性表達菌株接種于含Kana+的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，擴增細菌，經(jīng)EcoRⅠ、SalⅠ酶切鑒定及測序證實重組質粒構建成功。

1.2.7重組質粒pET28 a(+)/C-G250肽-C的原核誘導表達 原核表達質粒 pET28a(+)/C-G250肽-C 轉化感受態(tài)細菌E.coliBL21(DE3)，使用Kana+培養(yǎng)基篩選陽性菌株，隨機挑選單菌落接種于含Kana+的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至A600為0.4，然后將培養(yǎng)液加入到200 mL含Kana+的LB的培養(yǎng)液中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)10 h，加IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)8 h。

1.2.8原核表達蛋白的分離和純化 使用裂解緩沖液洗及超聲細胞粉碎機裂解誘導表達的細菌沉淀,將沉淀充分溶解于8 mol/L尿素中，室溫20 h，收集上清入透析袋中透析48 h。按Novagen公司操作方法，采用Ni2+-NTA親和層析法分離純化目的蛋白，采用凝血酶酶切去掉氨基端(N端)的組氨酸標記(His-TagD)等多肽，最后再次經(jīng)Ni2+-NTA柱洗脫，未結合蛋白質即為純化的融合蛋白，在經(jīng)SDS-PAGE分析、考馬斯亮藍染色,通過吸光度掃描分析融合蛋白純度。

1.2.9動物免疫 免疫方案：BALB/c小鼠6只，每周腹腔注射免疫1次，200 μL/只，第1次免疫用等體積的弗氏完全佐劑與融合蛋白的乳化混合物，第2次免疫用弗氏不完全佐劑與融合蛋白的乳化混合物，此后免疫時僅用融合蛋白而不加佐劑，共免疫6次。分別于初次免疫前和2次免疫后每周剪鼠尾采血分離血清。

1.2.10間接ELISA法檢測血清抗體 用包被緩沖液稀釋融合蛋白，包被96孔板，每孔100 μL，洗滌液洗滌后，加入1～6號小鼠免疫前血清和不同稀釋度的免疫后血清(從1∶2 000開始倍比稀釋)，37 ℃孵育1 h，再次洗滌后加入HRP標記的山羊抗鼠IgG(1∶5 000)，37 ℃孵育1 h，TMB顯色10 min后H2SO4終止反應，用酶標儀測定A450值，以免疫前血清為陰性對照，P/N>2.1者判為陽性。

1.2.11間接ELISA法檢測表達蛋白的抗原特異性 分別制備G250肽/249和HBcAg包被板，一抗為不同稀釋度的免疫后血清(從1∶1 000開始倍比稀釋)，二抗為HRP標記的山羊抗鼠IgG(1∶5 000)，TMB顯色10 min后H2SO4終止反應，用酶標儀測定A450值，P/N>2.1者判為陽性。

2 結 果

2.1G250肽PCR產(chǎn)物的凝膠電泳鑒定采用非對稱互補引物模板法PCR擴增G250肽/249目的基因，理論上為74 bp。在10 g/L瓊脂糖凝膠電泳中，可見到與理論值相符的DNA條帶(圖1)。

圖1G250肽PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定

Fig.1 Result of G250 peptide PCR

A：DNA marker；B：G250 PCR產(chǎn)物。

2.2重組質粒pGEM-T/G250肽的酶切鑒定及測序結果①酶切鑒定： 通過XhoⅠ及BamHⅠ雙酶切鑒定重組質粒pGEM-T/G250肽，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳結果顯示在66 bp處可見與G250肽/249理論值相符的一明顯條帶(圖2)。②基因測序：經(jīng)DNA-SIS軟件分析,結果顯示融合基因序列與理論序列完全相符。

圖2重組質粒pGEM-T/G250肽的雙酶切鑒定

Fig.2 Identification of plasmid pGEM-T/G250 peptide by double enzyme digestion

A：DNA marker；B：經(jīng)XhoⅠ及BamHⅠ雙酶切的pGEM-T/G250肽重組質粒；C：pGEM-T/G250肽重組質粒。

2.3重組質粒pGEMEX-C-G250肽-C的酶切鑒定及測序結果①酶切鑒定：通過EcoRⅠ及SalⅠ雙酶切鑒定，理論上應可切出3 986 bp和508 bp兩個片段。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳結果可見與理論值相符的明顯DNA條帶(圖3)。②基因測序：經(jīng)DNA-SIS軟件分析，結果顯示融合基因序列與理論序列完全相符。

圖3重組質粒pGEMEX-C-G250肽-C的雙酶切鑒定

Fig.3 Identification of plasmid pGEMEX-C-G250 peptide-C peptide-C by double enzyme digestion

A：DNA marker；B：經(jīng)EcoRⅠ及SaLⅠ雙酶切的pGEMEX-C-G250肽-C重組質粒；C：pGEMEX-C-G250肽-C重組質粒。

2.4C-G250肽-CPCR產(chǎn)物的凝膠電泳鑒定以pGEMEX/C-G250肽-C為模板，設計合成2條正負引物，PCR擴增C-G250肽-C基因片段，理論上為511 bp。在10 g/L瓊脂糖凝膠電泳圖中可見到與理論值相符的一條DNA帶(圖4)。

圖4C-G250肽-CPCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定

Fig.4 Result of C-G250 peptide-C PCR product

A：DNA marker；B：C-G250肽-C PCR產(chǎn)物。

2.5重組質粒pGEM-T/C-G250肽-C的酶切鑒定與測序結果①酶切鑒定：通過EcoRⅠ及SaLⅠ雙酶切鑒定，理論上應可切出4 218 bp和508 bp兩個片段。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳結果可見與理論值相符的明顯DNA條帶(圖5)。②基因測序：經(jīng)DNA-SIS軟件分析，結果顯示融合基因序列與理論序列完全相符。

圖5重組質粒pGEM-T/C-G250肽-C的雙酶切鑒定

Fig.5 Identification of plasmid pGEM-T/C-G250 peptide-C by double enzyme digestion

A：DNA marker；B：經(jīng)EcoRⅠ及SaLⅠ雙酶切的pGEM-T/C-G250肽-C重組質粒；C：pGEM-T/C-G250肽-C重組質粒。

2.6原核表達質粒pET28a(+)/C-G250肽-C的構建與鑒定結果①酶切鑒定：通過EcoRⅠ及SaLⅠ雙酶切鑒定重組質粒pET28 a(+)/C-G250肽-C，理論上應切出5 434 bp和508 bp兩個片段。在10 g/L瓊脂糖凝膠電泳結果可見與理論值相符的明顯DNA條帶(圖6)。②基因測序：經(jīng)DNA-SIS軟件分析，結果顯示融合基因序列與理論序列完全相符。

圖6重組質粒pET28a(+)/C-G250肽-C的雙酶切鑒定

Fig.6 Identification of plasmid pET28a(+)/C-G250 peptide-C by double enzyme digestion

A：DNA marker；B：經(jīng)EcoRⅠ及SaLⅠ雙酶切的pET28a(+)/C-G250肽-C重組質粒；C：pET28a (+)/C-G250肽-C重組質粒。

2.7重組質粒pET28a(+)/C-G250肽-C的原核表達和純化結果使用裂解緩沖液洗及超聲細胞粉碎機裂解誘導表達的細菌沉淀，8 mol/L尿素中洗滌后收集上清并透析，Ni2+-NTA親和層析法分離純化目的蛋白，凝血酶酶切去掉氨基端(N端)的組氨酸標記(His-TagD)等多肽，最后再次經(jīng)Ni2+-NTA柱洗脫，最后獲得了純度達95%以上的融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色后，在相對分子質量約為22.35處可見1條新的蛋白條帶,與融合蛋白的理論值相符 (圖7)。

圖7融合蛋白的SDS-PAGE電泳分析

Fig.7 SDS-PAGE analysis of the recombinant protein

A：純化融合蛋白；B：蛋白marker；C：pET28a(+)誘導表達上清；D：pET28a(+)誘導表達沉淀；E：pET28a(+)/C-G250肽-C誘導表達上清；F：pET28a(+)/C-G250肽-C誘導表達沉淀(1/2稀釋)；G：pET28a(+)/C-G250肽-C誘導表達沉淀(1/4稀釋)。

2.8血清抗體的檢測結果免疫4周后，所有小鼠血清中均可檢測到中和抗體，免疫第6周其血清中抗體滴度均可達到1∶2.56×105，最高抗體滴度可達到1∶5.12×105(表1)。

表1間接ELISA法檢測血清抗體滴度

Tab.1 Serum antibody titer detected by indirect ELISA

(n=6)

2.9免疫小鼠血清中抗G250肽及HBcAg抗體滴度免疫4周后，6只小鼠中有5只血清中抗-G250肽/249抗體的滴度可達到1∶8×103, 檢測不到抗-HBc抗體，免疫6周后所有小鼠血清中抗-HBc抗體滴度不超過1∶4×103，抗-G250肽/249抗體最高達1∶6.4×104(表2)。

表2間接ELISA法檢測血清抗G250肽/249抗體滴度

Tab.2 Serum antibody titer of anti-G250 peptide/249 detected by indirect ELISA (n=6)

3 討 論

研究證實，腎癌對免疫治療有較好的反應性，開展有效的腎癌疫苗免疫治療顯得尤為重要。G250抗原及其表位肽良好的腎癌腫瘤特異性成為腎癌疫苗主動免疫及靶向治療的理想靶點。目前，在各種疫苗研究中，肽疫苗具有能誘發(fā)特異的免疫應答，且分子結構簡單，生產(chǎn)、純化、保存方便及安全等優(yōu)點成為研究熱點之一。然而，由于抗原肽分子量小、免疫原性弱，在臨床上獲得的治療效果有限[9]。目前，G250抗原表位肽在腎癌肽疫苗治療研究中，多采用不同的方式增強其免疫原性，產(chǎn)生更強的腎癌免疫治療效應。KIM等[10]制備G250肽-鮑氏不動桿菌外膜蛋白A融合蛋白，并沖擊樹突狀細胞去治療RENCA小鼠腎癌腫瘤模型，獲得了理想的針對G250抗原肽的特異性抗腎癌免疫反應。另外，包括G250抗原肽聯(lián)合IFN-r、完全弗氏佐劑等腎癌免疫治療及G250抗原肽沖擊樹突狀細胞促進CD4+的活化、增殖，提高免疫反應等已完成相應的實驗研究[11-12]。

HBcAg顆粒能激發(fā)機體較強的體液免疫及細胞免疫應答，在HBcAg的刺突尖部78～83 氨基酸是HBcAg的MIR區(qū)，是插入外源基因的理想部位，在此部位融合，即可顯著增強外源基因的免疫原性，同時并可以廢除或降低HBcAg本身的免疫原性[13]，在實驗及臨床應用研究中證實了其可作為理想的載體[14-15]。本研究室曾將β淀粉樣肽基因及表皮生長因子受體Ⅲ型突變體的pep-3抗原表位(EGFRvⅢ/ pep-3)基因成功插入HBcAg的MIR區(qū)，通過原核表達獲得的融合蛋白具有良好的免疫原性，可誘導產(chǎn)生高效價抗體[16-17]?；谝陨侠碚摶A，本實驗通過基因工程技術將編碼鼠G250肽的基因片段插入HBcAg的MIR區(qū)，構建原核表達質粒pET28a(+)/C-G250肽-C，通過原核表達成功獲得融合蛋白。該融合蛋白其N端的His純化標簽和凝血酶蛋白酶切位點，利于后續(xù)的分離純化及在純化完成后切除上述融合標簽, 最終獲得純度達95%以上的融合蛋白。間接ELISA法檢測顯示，該融合蛋白能誘導小鼠產(chǎn)生高滴度和高特異性的中和抗體，且血清抗體中抗-G250肽/249抗體，最高達1∶6.4×104。由于G250肽/249抗原表位代替了HBcAg的MIR區(qū)，使HBcAg的抗原性顯著下降，抗-HBc抗體滴度不超過1∶4×103。在本研究設計中使用鼠源性G250肽/249的目的主要為便于下一步可直接使用小鼠RENCA腎癌模型進行治療效應研究，首先證實該融合蛋白是否可以在小鼠體內(nèi)誘導產(chǎn)生理想的抗腫瘤治療效應，為進一步研究人源性G250肽/249與HBcAg融合基因奠定基礎。

綜上所述，我們成功制備了鼠G250肽/249與HBcAg重組基因的純化融合蛋白，該融合蛋白具有較強的免疫原性，能誘導小鼠產(chǎn)生高滴度和高特異性的抗體，為進一步研究該融合蛋白疫苗在小鼠RENCA腎癌模型中治療效應奠定了基礎。

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