劉傳志，?，摤?，陳元安，武成，于源華

長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130022

小鼠17β-hsd10的克隆、表達(dá)及雙抗夾心ELISA方法的建立

劉傳志，?，摤摚愒?，武成，于源華

長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130022

原核表達(dá)小鼠17β-羥基類固醇脫氫酶（17β-hsd10），制備抗17β-hsd10多克隆抗體，建立17β-hsd10雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)。采用RT-PCR技術(shù)克隆得到小鼠肝臟17β-hsd 10基因，構(gòu)建原核表達(dá)體系pET15b-17β-hsd10/Escherichia coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，并優(yōu)化表達(dá)條件；目的蛋白用His融合蛋白純化柱（His-Binding-resin）純化并免疫BALB/c小鼠和新西蘭大耳白兔，免疫血清總IgG采用硫酸銨沉淀法純化，用獲得的高效價(jià)鼠源和兔源兩種多克隆抗體，建立17β-hsd10雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。表達(dá)蛋白約為29.5 kDa，純化后濃度為1.5 mg/m L，鼠源和兔源多克隆抗體效價(jià)分別為1.25×104和2.5×104，建立的檢測(cè)方法對(duì)于多種羥基類固醇脫氫酶無交叉反應(yīng)，特異性良好，可檢出含量約為0.05?0.1μg/m L的陽(yáng)性血清。建立的17β-hsd10雙抗夾心ELISA方法，簡(jiǎn)便、快速、敏感，適合實(shí)驗(yàn)室研究科研廣泛應(yīng)用。并可能為檢測(cè)阿爾茨海默病提供新思路和方法。

17β-羥基類固醇脫氫酶10，雙抗夾心酶聯(lián)免疫方法，多克隆抗體

17β-羥基類固醇脫氫酶(17β-hsd10)屬于短鏈脫氫酶超家族(SDR)[1-3]，由17β-hsd10基因編碼，參與脂肪酸β氧化，糖皮質(zhì)激素和孕酮分解代謝及膽汁酸同分異構(gòu)化作用[4-5]。最初，17β-hsd10被認(rèn)為是3-羥氨基輔酶A脫氫酶-Ⅱ(SCHAD,HADH2)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Aβ相關(guān)蛋白(ERAB)[6-8]，現(xiàn)已證實(shí)，人類的17β-hsd10與β-淀粉樣蛋白(Amyloid-β，Aβ蛋白)具有中等親和性[5]，它通過一個(gè)氨基末端緊密的靶作用信號(hào)定位于線粒體[9-10]。從人類17β-hsd10同Aβ蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)測(cè)定推斷出Aβ蛋白的結(jié)合是特異的[11]。He等研究發(fā)現(xiàn)，在阿爾茨海默病(AD)轉(zhuǎn)基因小鼠的突觸海馬體中存在17β-hsd10的富集現(xiàn)象[12]。Yang等的研究也證實(shí)，17β-hsd10參與大腦認(rèn)知活動(dòng)，在阿爾茨海默病患者和AD小鼠模型的腦中都檢測(cè)到17β-hsd10的大量表達(dá)[13]。這些研究均揭示出17β-hsd10與阿爾茨海默病的相關(guān)性。

阿爾茨海默病(A lzheimer's disease，AD)即所謂的老年癡呆癥，是一種致死性神經(jīng)退行性疾病，據(jù)中國(guó)阿爾茨海默病協(xié)會(huì)2011年公布的調(diào)查結(jié)果顯示，全球有約3 650萬人患有癡呆癥，平均生存期只有5.9年，是威脅老人健康的“四大殺手”之一。有研究認(rèn)為，開始出現(xiàn)明顯癥狀之前的幾年甚至是幾十年，阿爾茨海默病便已發(fā)病[14-17]。但是，目前為止，在患上AD的最早期(也就是出現(xiàn)明顯癥狀之前)，還沒有一種有效的方法能夠?qū)⑵浒l(fā)現(xiàn)。

目前，診斷AD的最佳生物標(biāo)志物包括核磁共振成像(MRI)、正電子發(fā)射斷層掃描(PET)和腦脊液蛋白檢測(cè)[18-19]。但是，這些診斷方法要么價(jià)格昂貴，要么會(huì)對(duì)患者帶來極大的痛苦，一種更加快速、簡(jiǎn)便的AD診斷方法仍然是該領(lǐng)域研究人員不斷追求的目標(biāo)。

本文從小鼠肝臟中克隆得到17β-hsd10基因，原核表達(dá)小鼠17β-hsd10，制備抗17β-hsd10多克隆抗體，建立17β-hsd10雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法(ELISA)[20-21]?？蓹z出含量約為0.1?0.05μg/m L的陽(yáng)性血清，有望成為AD的快速診斷新方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料

IPTG(Merck公司)，弗氏完全和不完全佐劑、咪唑等(Sigma公司)，His-Binding-resin純化柱(上海悅克生物技術(shù)有限公司)，BALB/c小鼠、新西蘭白兔由吉林大學(xué)動(dòng)物室提供，96孔酶標(biāo)板(Costar)，HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，DNM-9602酶標(biāo)分析儀購(gòu)自北京普朗有限公司。3α-hsd、11β-hsd、17β-hsd4、6的標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)置于Sigma公司，組氨酸標(biāo)簽蛋白蛋氨酸-γ裂解酶(MGL)、pET-15b質(zhì)粒及E.coli BL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上已登記的小鼠17β-hsd10基因序列以及表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，分別引入NdeⅠ和Bam HⅠ酶切位點(diǎn)(斜體帶下劃線)。引物序列如表1，引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2.2 17β-hsd10基因的克隆及表達(dá)

采用天根動(dòng)物組織RNA提取試劑盒提取小鼠肝臟總RNA，隨后采用RT-PCR試劑盒合成小鼠17β-hsd10基因cDNA第一鏈，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94℃，5 m in(94℃，2 m in；54℃，30 s，72℃，1 m in)循環(huán)30次；72℃，5 m in。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后回收，與pUCm-T連接后(pUCm-T-M 10)測(cè)序。

表1 小鼠17β-hsd10基因引物序列Tab le 1 Prim er sequence of 17β-hsd10 gene in m ouse

表2 17β-hsd10多克隆抗體免疫程序Tab le 2 Imm une Procedures of anti-17β-hsd10 polyclonal antibody

將pUCm-T-M 10與pET-15b分別用NdeⅠ和Bam HⅠ雙酶切并回收，產(chǎn)物于22℃連接過夜后轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，小量提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和PCR鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pET-5b-M 10，由上海生工測(cè)序。獲得重組工程菌株在37℃，培養(yǎng)液pH值為8.0，誘導(dǎo)劑IPTG的濃度為0.5 mmol/L的條件下，振蕩培養(yǎng)48 h，12%SDS-PAGE鑒定，親和層析(Ni)柱純化17β-hsd10蛋白。

1.2.3 抗17β-hsd10多克隆抗體的制備及純化

用純化后的17β-hsd10蛋白分3次免疫新西蘭大耳白兔和BALB/c小鼠，每次間隔2周，第二、三次免疫1周后取血清，免疫程序如表2。

用ELISA法測(cè)定效價(jià)，以免疫前的血清作為陰性對(duì)照，陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：P/N＞2.1記為陽(yáng)性，抗體效價(jià)：陽(yáng)性孔最大稀釋倍數(shù)記為抗體效價(jià)。抗血清在13 000 r/m in，離心5 m in，收集上清。等體積生理鹽水混勻滴加硫酸銨(體積分?jǐn)?shù)50%)，用濃氨水調(diào)至pH值8.0，充分沉淀抗體。室溫平衡后，離心，棄上清。重復(fù)此沉淀步驟2–3次。最后一次離心后所得沉淀物即為粗提IgG抗體。將此沉淀物溶于4–5 m L生理鹽水中，裝入透析袋4℃透析過夜。于–20℃保存。

1.2.4 雙抗夾心ELISA方法的建立

以pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋鼠源抗17β-hsd10多抗，包被酶標(biāo)板，100μL/孔，4℃過夜；用洗滌液(含0.05%

1.2.5 特異性實(shí)驗(yàn)

用建立的ELISA方法檢測(cè)含有3α-hsd、11β-hsd、17β-hsd4、7的標(biāo)準(zhǔn)品，并用實(shí)驗(yàn)室表達(dá)的His-標(biāo)簽蛋白蛋氨酸-γ裂解酶(MGL)做標(biāo)簽鑒定。同時(shí)設(shè)陽(yáng)性、陰性和空白對(duì)照，進(jìn)行交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，以評(píng)價(jià)該方法的特異性。

1.2.6 敏感性實(shí)驗(yàn)

將已確定濃度的17β-hsd10梯度稀釋(1：800、1：1 600、1：3 200、1：6 400、1：12 800、1：25 600、1：51 200、1：102 400、1：204 800)后，取100μL進(jìn)行ELISA檢測(cè)，確定所建立方法的最低檢出濃度。

2 結(jié)果

2.1 17β-hsd10基因的克隆

應(yīng)用設(shè)計(jì)的引物及RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增了小鼠17β-hsd10的全長(zhǎng)cDNA，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCm-T-M 10，經(jīng)NdeⅠ和Bam HⅠ雙酶切，獲得789 bp的條帶，如圖1，測(cè)序證實(shí)為目的基因。

2.2 17β-hsd10表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

構(gòu)建的重組質(zhì)粒雙酶切及PCR鑒定結(jié)果分別如圖2所示，質(zhì)粒構(gòu)建成功，對(duì)重組質(zhì)粒pET-15b-M 10進(jìn)行PCR鑒定得到1條帶證實(shí)，大小正確。

圖1 重組質(zhì)粒pUCm-T-M 10雙酶切鑒定電泳圖譜Fig.1 Electrophoretogram is double enzyme digestion of pUCm-T-M 10.1:samples;2:pUCm-T;M:DL5 000 DNA marker.

圖2 重組質(zhì)粒pET-15b-M 10雙酶切鑒定及PCR鑒定電泳圖譜電泳圖譜Fig.2 Electrophoretogram is double enzyme digestion and PCR of pET-15b-M 10.1:PCR of pET-15b-M 10;2: sample;3:pET-15b;M:DL5 000 DNA marker.

2.3 17β-hsd10的表達(dá)及純化

重組工程菌株采用IPTG誘導(dǎo)，使其表達(dá)17β-hsd10蛋白，對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)過程中的主要影響因素進(jìn)行優(yōu)化分析，純化產(chǎn)物SDS-PAGE鑒定如圖3，在約29.5 kDa處有一條明顯表達(dá)帶，與預(yù)期蛋白分子量相符。

2.4 雙抗夾心ELISA方法的建立

本研究最終獲得的兔源和鼠源抗17β-hsd10多克隆抗體效價(jià)分別為1.25×104和2.5×104。其中鼠源多克隆抗體的最佳包被濃度為2.5μg/m L，兔源多克隆抗體的最佳工作濃度為1.0μg/m L，酶標(biāo)抗體的稀釋倍數(shù)為1：5 000。方陣試驗(yàn)數(shù)據(jù)為對(duì)應(yīng)反應(yīng)條件下的S/N值(表3)。 17β-hsd10;3:E.coli BL21(pET-15b);4:E.coli BL21 (pET-15b-M 10).

圖3 17β-hsd10蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant 17β-hsd10 protein expression and purified protein.M:marker;1,2:

2.5 特異性實(shí)驗(yàn)

用本研究建立的方法對(duì)3α-hsd、11β-hsd、17β-hsd4、7的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，蛋氨酸-γ裂解酶(MGL)，M 10(+)為含有17β-hsd10和M 10(–)為不含有17β-hsd10。結(jié)果顯示除重組蛋白顯示陽(yáng)性外，其他受試蛋白并未測(cè)出陽(yáng)性，說明本方法的特異性較好(表4)。

2.6 敏感性實(shí)驗(yàn)

檢測(cè)17β-hsd10(M 10+)陽(yáng)性血清，OD450值隨著稀釋倍數(shù)的增加而減小(圖4)，當(dāng)血清12 800倍稀釋時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，當(dāng)血清25 600倍稀釋時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為陰性，即所能檢測(cè)的最小范圍在0.1?0.05 μg/m L，所建立的方法具有較好的敏感性。

表3 鼠源抗17β-hsd10多抗及兔源抗17β-hsd10多抗的最佳工作濃度確定Tab le 3 Determ ination of the op timal concentration of coating antibody and rabbit-anti-17β-hsd10-IgG

表4 交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)Tab le 4 The ELISA specific test

圖4 ELISA檢測(cè)M 10陽(yáng)性血清的最大稀釋倍數(shù)和P/N值Fig.4 The dilution ratio of the positive serum sample by ELISA.Carry 3 groups,two parallel samples of each group,the above OD450data are average for each group.

3 討論

本文克隆了與AD相關(guān)的17β-hsd10的基因，與已登記的小鼠17β-hsd10比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)堿基突變；經(jīng)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與人類的17β-hsd10的基因同源性為99%。SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果顯示，17β-hsd10在E.coli中獲得了高純度表達(dá)。采用該純化蛋白作為抗原免疫動(dòng)物，獲得了高效價(jià)多克隆抗體，3α-hsd、11β-hsd、17β-hsd等其他類型的羥基類固醇脫氫酶呈陰性反應(yīng)，說明該方法對(duì)于17β-hsd10具有良好的特異性；同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)血清中存在0.05μg/m L以上的17β-hsd10時(shí)，該方法仍然可以準(zhǔn)確檢出，說明本文建立的方法具有高度的敏感性。本文建立的17β-hsd10雙抗夾心ELISA方法，通過進(jìn)一步地改進(jìn)提高與驗(yàn)證，為研制檢測(cè)阿爾茨海黙病新方法奠定了基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

M olecular cloning,prokaryotic expression and double-antibody sandw ich ELISA developm ent of 17β-hsd10 in mouse

Chuanzhi Liu,Yingying Niu,Yuan’an Chen,Cheng W u,and Yuanhua Yu

School of Life Science and Technology,Changchun University of Science&Technology,Changchun 130022,Jilin,China

We expressed 17β-hydroxysteroid dehydrogenase10(17β-hsd10)recombinant protein,prepared anti-17βhsd10 polyclonal antibodies and established sandw ich enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)test for detection of 17β-hsd10.RT-PCR was used to get the gene of 17β-hsd10 of mouse liver,and a prokaryotic protein expression system pET15b-17β-hsd10/Escherichia coli BL21(DE3)which induced w ith isopropyl-1-thio-β-galactopyranoside(IPTG)for recombinant protein expression was constructed subsequently.The target protein purified using His-Binding-resin column was used to immunize BALB/c m ice and rabbits,serum total IgGs from immunized animals were purified by ammonium sulfate precipitation method.We established a Double-antibody Sandw ich enzyme linked immunosorbent assay about 17β-hsd10 using the two antibodies we prepared.We got the concentration of 1.5 mg/m L of 17β-hsd10 protein w ith molecular weight of 29.5 kDa,and polyclonal antibodies from mouse and rabbit w ith the tite 1.25×104and 2.5×104respectively.The concentration of 0.1μg/m L of 17β-hsd10 can be detected by the Double-antibody Sandw ich ELISA we established,and the assay was sensitive and specific.It can be w idely used in clinical and experimental study.

17β-hydroxysteroid dehydrogenase10,double-antibody Sandw ich ELISA,polyclonal antibodies

January 26,2014;Accep ted:July 25,2014

Yuanhua Yu.Tel/Fax:+86-431-85583099;E-mail:yuyuanhua8888@126.com

劉傳志,?，摤?陳元安,等.小鼠17β-hsd10的克隆、表達(dá)及雙抗夾心ELISA方法的建立.生物工程學(xué)報(bào)，2014,30(11): 1774–1780.

Liu CZ,Niu YY,Chen YA,et al.Molecular cloning,prokaryotic expression and double-antibody sandw ich ELISA development of 17β-hsd10 in mouse.Chin J Biotech,2014,30(11):1774–1780.

Suppo rted by:Key Project in the Science and Technology Development Program of Jilin(No.20120963).

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（No.20120963）資助。