吳家鑫，黃永東，齊鵬，何繼紅，李萍，張國棟，趙梅仙

1中牧實業(yè)股份有限公司，北京100095 2農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化學藥品重點實驗室，北京100095 3北京市獸用多肽疫苗設(shè)計與制備工程技術(shù)研究中心，北京100095 4中國牧工商(集團)總公司，北京100095 5中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京100190

大孔樹脂吸附與反相色譜純化恩拉霉素

吳家鑫1,2,3,4，黃永東5，齊鵬1,2,3,4，何繼紅1,2,3,4，李萍5，張國棟1,2,3,4，趙梅仙1,2,3,4

1中牧實業(yè)股份有限公司，北京100095 2農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化學藥品重點實驗室，北京100095 3北京市獸用多肽疫苗設(shè)計與制備工程技術(shù)研究中心，北京100095 4中國牧工商(集團)總公司，北京100095 5中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京100190

恩拉霉素作為多肽類抗生素，是一種新型、安全的飼料添加劑。本文建立了一條基于大孔樹脂初純和反相色譜精制的分離純化工藝。該工藝路線首先使用AB-8大孔樹脂在0.012 mol/L鹽酸溶液-甲醇(50：50，V/V)緩沖液條件下洗脫實現(xiàn)恩拉霉素初步純化，再使用制備型C18反相色譜柱在0.05 mol/L磷酸二氫鈉-乙腈(70：30，V/V)(pH 4.5)緩沖液洗脫下實現(xiàn)恩拉霉素a和b的有效分離，a、b兩個組分純度分別達到98.5%和98.0%，a和b兩種有效成分的總收率為29.2%。本研究為恩拉霉素a和b兩種純品的制備以及高純度恩拉霉素產(chǎn)品的生產(chǎn)提供了參考。

恩拉霉素，大孔吸附樹脂，反相色譜，純化

恩拉霉素(Enramycin)，又名恩來霉素、安來霉素、持久霉素，是由放線菌Streptomyces fungicidious No.B5477發(fā)酵產(chǎn)生的一種多肽類抗生素，主要成分為恩拉霉素a和b[1-4]。恩拉霉素于1966年由日本武田藥品工業(yè)株式會社開發(fā)，1993年在我國注冊。恩拉霉素對革蘭氏陽性菌具有很強的抑制作用，不易產(chǎn)生抗藥性，能夠改變腸道內(nèi)的細菌菌落分布，有利于飼料營養(yǎng)成分的消化吸收，具有很好的促生長效果，是一種專用的抗生素類飼料添加劑[5-9]。

恩拉霉素的發(fā)酵過程是一個復(fù)雜的微生物代謝過程，副產(chǎn)物眾多[10-12]，因此恩拉霉素的分離純化工藝較為復(fù)雜。現(xiàn)有的恩拉霉素分離純化方法主要包括有Amberlite XAD-2大孔樹脂[13]、高速逆流色譜[14]、AB-8大孔樹脂吸附和分子篩相結(jié)合的方法[15]等，上述方法得到的產(chǎn)品純度還有待于進一步提高，而且上述方法得到的產(chǎn)品多是恩拉霉素a和b的混合物。大孔樹脂與反相制備色譜作為常見的分離純化方法在生化分離領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛[16-20]。

本論文建立了一條大孔樹脂初純化和反相色譜精制的分離純化工藝，從甲醇-鹽酸溶液提取的恩拉霉素提取液中純化得到高純度的恩拉霉素a和b兩種有效成分，為恩拉霉素的檢測和高純度恩拉霉素產(chǎn)品的制備奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌絲體由內(nèi)蒙古中牧生物藥業(yè)有限公司提供，其他試劑均為購置的國產(chǎn)分析純試劑。

?KTA Explorer 10層析系統(tǒng)購自GE Healthcare(美國)；LC-2012A高效液相色譜儀購自島津公司；MALDI-TOF質(zhì)譜儀VOYAGERDE-STR購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)；大孔樹脂AB-8購自天津南開允公合成技術(shù)有限公司；大孔樹脂HZ-830購自上海華震科技有限公司；C18反相制備柱(20 cm×3.6 cm I.D)購自北京創(chuàng)新通恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 恩拉霉素提取

取菌絲體500 g，加入甲醇2.5 L，使用1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3，超聲振蕩2 h，3 000 r/m in離心30 m in，取上層清液。

1.2.2 大孔樹脂初分離

條件探索實驗1：HZ-830大孔樹脂用緩沖液A(甲醇-水溶液(50：50，V/V)，pH 8.0)浸泡1 d后，轉(zhuǎn)移到玻璃層析柱(20.0 cm×1.0 cm I.D.)上，裝成10 cm床層高度的大孔樹脂層析柱(10.0 cm×1.0 cm I.D.)。用平衡緩沖液A平衡5個柱體積后進料8 m L(原料預(yù)處理后所得的上清液，上樣量約為10 mg/m L樹脂)，繼續(xù)用緩沖液A淋洗至基線，再利用緩沖液A與緩沖液B(甲醇-水溶液(70：30，V/V)，pH 2.5)的混合溶劑進行洗脫，分別采用30%、60%和100%緩沖液B梯度洗脫，收集穿透峰和各個洗脫峰。流速為0.5 m L/m in，檢測波長為267 nm。

條件探索實驗2：AB-8大孔樹脂用緩沖液C(1.0%NaCl水溶液-甲醇(50：50，V/V))浸泡1 d后，轉(zhuǎn)移到玻璃層析柱(20.0 cm×1.0 cm I.D.)上，裝成10 cm床層高度的大孔樹脂層析柱(10.0 cm×1.0 cm I.D.)。用平衡緩沖液C平衡5個柱體積后進料8 m L(原料預(yù)處理后所得的上清液，上樣量約為10 mg/m L樹脂)，繼續(xù)用緩沖液C淋洗至基線，再利用緩沖液C與緩沖液D(0.012 mol/L HCl溶液-甲醇(50∶50，V/V))的混合溶劑進行洗脫，分別采用20%、30%、40%和100%緩沖液D梯度洗脫，收集穿透峰和各個洗脫峰。流速為0.5 m L/m in，檢測波長為267 nm。

AB-8樹脂分離純化實驗：AB-8大孔樹脂用緩沖液C浸泡1 d后，轉(zhuǎn)移到玻璃層析柱(40.0 cm× 3.6 cm I.D.)上，裝成30 cm床層高度的大孔樹脂層析柱(30.0 cm×3.6 cm I.D.)。用平衡緩沖液C平衡5個柱體積后進料500 m L(原料預(yù)處理后所得的上清液，上樣量約為10 mg/m L樹脂)，繼續(xù)用緩沖液C淋洗至基線，然后采用緩沖液D洗脫，收集穿透峰和洗脫峰。流速為10 m L/m in，檢測波長為267 nm。

1.2.3 反相色譜精制

大孔樹脂初分離得到的目標組分進一步用制備型C18反相色譜柱(20.0 cm×3.6 cm I.D.，5 μm粒徑)進行精制提純。反相色譜柱用緩沖液E (0.05 mol/L磷酸二氫鈉-乙腈，70：30，V/V，pH 4.5)平衡后上樣50 m L，繼續(xù)洗脫至出峰完全(總共約洗脫1 200 m L)。流速為10.0 m L/m in，檢測波長為267 nm。

1.2.4 恩拉霉素檢測分析

利用高效液相方法檢測恩拉霉素[21]。

1.2.5 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-M S)檢測分析

脈沖氮激光(337 nm)作為離子解吸電離源。分析模型使用延遲引出和線性模型，激光強度恒定為3 558，加速電壓控制在20 000 V，延遲時間為700 ns。每個樣品點的激光脈沖次數(shù)為50次。

2 結(jié)果與討論

2.1 恩拉霉素的提取

按照“1.2.1”所描述的方法提取恩拉霉素。甲醇提取的恩拉霉素提取液用C18反相色譜柱分析，分析結(jié)果如圖1所示。提取液中恩拉霉素a的出峰時間約為9 min；恩拉霉素b的出峰時間約為14 min。利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)對提取液進行檢測，譜圖如圖2所示，主要成分的分子量分別為2 357.08 Da與2 370.51 Da，與文獻中恩拉霉素a、b的分子量2 358 Da、2 370 Da基本一致[14]，這表明提取液含有大量的恩拉霉素a和b兩種目標物。

2.2 大孔樹脂初分離條件摸索

2.2.1 不同大孔樹脂對恩拉霉素分離效果的影響

按照“1.2.2”所示的條件探索實驗1操作條件，采用HZ-830大孔樹脂對恩拉霉素提取液進行初分離，分離純化的譜圖如圖3所示。從圖3可以看出，采用30%、60%和100%緩沖液B洗脫得到3個洗脫峰，分別標記為P1、P2和P3。對3個洗脫峰(P1、P2和P3)進行C18反相色譜柱分析，上述洗脫峰均沒有目標產(chǎn)物恩拉霉素a和b，這表明HZ-830大孔樹脂未能實現(xiàn)恩拉霉素提取液的有效吸附和對目標產(chǎn)物的有效純化。

圖1 恩拉霉素提取液反相色譜分析譜圖Fig.1 Chromatography profile of enramycin extract.

圖2 恩拉霉素提取液基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜譜圖Fig.2 M atrix-assisted laser desorption/ionization time of flight(MALDI-TOF)mass spectrum of enramycin extract.

圖3 恩拉霉素提取液的HZ-830大孔樹脂分離條件優(yōu)化譜圖Fig.3 Optim ization of enramycin extract using HZ-830 macroporous adsorption resin.

按照“1.2.2”所示的條件探索實驗2操作條件，采用AB-8大孔樹脂對恩拉霉素提取液進行初分離，分離純化的譜圖如圖4所示。從圖4可以看出，除穿透峰P0外，采用20%、30%、40%和100%緩沖液D洗脫得到4個洗脫峰，標記為P1、P2、P3、P4。分別采用C18反相色譜柱對穿透峰P0和洗脫峰P1、P3、P4(P2峰太小，未進一步檢測))進行分析，只有洗脫峰P4含有目標產(chǎn)物恩拉霉素a和b。表明AB-8大孔樹脂在含0.006 mol/L HCl 50%甲醇-水溶液洗脫條件下可以實現(xiàn)恩拉霉素提取液的有效純化。

2.2.2 AB-8大孔樹脂吸附分離純化

在確認了選用AB-8大孔樹脂和合適的分離純化條件后，進行了大孔樹脂吸附的分離純化，具體操作條件如“1.2.2”AB-8樹脂分離純化實驗所示。分離純化譜圖如圖5所示，P0屬于穿透峰，P1為100%緩沖液D的洗脫峰，P1洗脫峰制備的樣品純度與條件摸索實驗基本一致。利用AB-8大孔樹脂去除掉恩拉霉素提取液中的大部分雜質(zhì)，為制備型C18反相色譜的繼續(xù)純化進行準備。

2.3 恩拉霉素的精制

在大孔樹脂初分離的基礎(chǔ)上，只得到了恩拉霉素a和b的混合物，并且產(chǎn)品中還含有少量雜質(zhì)。為了進一步提高產(chǎn)品純度，并將恩拉霉素a和b組分分開，實現(xiàn)恩拉霉素a和恩拉霉素b純品的制備，進一步采用制備型C18反相色譜柱對初分離的恩拉霉素樣品進行精制。制備型反相色譜的具體操作條件如“1.2.3”所示，分離純化譜圖如圖6所示。采用分段接樣的方式(10 m L/管)收集緩沖液E洗脫峰P1、P2和P3，并采用反相色譜對其純度進行分析，結(jié)果表明從658?806 m L收集的P2峰含有純度高達98.5%的恩拉霉素a，從906?952 m L收集的P3含有純度高達98.0%的恩拉霉素b(圖7)，恩拉霉素a與b兩種有效成分的總收率為29.2%。前人使用大孔樹脂分離純化恩拉霉素不能將恩拉霉素a和b兩種有效成分分開，且分離純度也僅為95%左右[15]；使用高速逆流色譜對恩拉霉素進行分離雖然可以將恩拉霉素a和b兩種有效成分進行分離，但是純度也僅為95%以上[14]。本文利用大孔樹脂(AB-8大孔樹脂)和反相色譜(C18反相填料)相結(jié)合的分離純化工藝有效解決了前人研究中存在的缺陷。

圖4 恩拉霉素提取液的AB-8大孔樹脂分離條件優(yōu)化譜圖Fig.4 Optim ization of enramycin extract using AB-8 macroporous adsorption resin.

圖5恩拉霉素提取液的AB-8大孔樹脂分離譜圖Fig.5 Chromatography profile of enramycin extract using AB-8 macroporous adsorption resin.

圖7 制備型反相色譜洗脫組分的反相色譜分析譜圖Fig.7 Reverse phase chromatography profiles of enramycin eluted from preparative C18 reverse phase chromatography.(A)Enramycin a.(B)Enramycin b.

3 結(jié)論

恩拉霉素是一種重要的多肽抗生素，廣泛用作動物飼料添加劑，恩拉霉素的主要成分為恩拉霉素a和恩拉霉素b。針對恩拉霉素產(chǎn)品純度低、恩拉霉素a和恩拉霉素b無法得到有效分離的問題，本研究開發(fā)了一條包括大孔樹脂(AB-8大孔樹脂)初純和反相色譜(C18反相填料)精制的分離純化工藝，分離純化得到2種高純度的恩拉霉素關(guān)鍵組分：恩拉霉素a和恩拉霉素b。該工藝路線首先使用AB-8大孔樹脂在0.012 mol/L鹽酸溶液-甲醇(50：50，V/V)緩沖液條件下洗脫實現(xiàn)恩拉霉素初步純化，再使用制備型C18反相色譜柱在0.05 mol/L磷酸二氫鈉-乙腈(70：30，V/V)(pH 4.5)緩沖液洗脫下實現(xiàn)恩拉霉素a和b的有效分離，a、b兩個組分純度分別達到98.5%和98.0%，a和b兩種有效成分的總收率為29.2%，該純度高于現(xiàn)有的分離純化方法，為恩拉霉素的分析檢測以及高純度恩拉霉素產(chǎn)品的開發(fā)奠定了堅實的基礎(chǔ)。

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(本文責編 陳宏宇)

Purification of enram ycin by macroporous resin adsorption and reversed phase chromatography purification

Jiaxin W u1,2,3,4,Yongdong Huang5,Peng Qi1,2,3,4,Jihong He1,2,3,4,Ping Li5, Guodong Zhang1,2,3,4,and M eixian Zhao1,2,3,4
1 China Animal Husbandry Industry Co.,Ltd,Beijing 100095,China

2 Key Laboratory of Biological Products and Chemical Drugs for Animals,M inistry of Agriculture,Beijing 100095,China 3 Beijing Engineering Research Center of Design and Development of Synthetic Peptide Vaccines for Animals,Beijing 100095,China 4 China Animal Husbandry Group,Beijing 100095,China 5 National Key Laboratory of Biochemical Engineering,Institute of Process Engineering,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,China

Enramycin is a polypeptide antibiotic and new,safe animal feed additive.A new purification process was developed,based on pre-purification by macroporous resin and refining by reversed phase chromatography.AB-8 macroporous resin was used for the pre-purification process of enramycin,w ith an elution buffer of 0.012 mol/L aqueous HCl solution-methanol(50:50,V/V).Then,enramycin a and enramycin b were separated effectively by C18 reversed phase chromatography,w ith a elution buffer of 0.05 mol/L aqueous KH2PO4solution-acetonitrile(70:30,V/V,pH 4.5).The purities of enramycin a and enramycin b were up to 98.5%and 98.0%,respectively.The yield reached 29.2%.This study would provide a useful reference for the preparation of enramycin a and enramycin b w ith ahigh purity.

enramycin,macroporous adsorption resin,reverse-phase chromatography,purification

February 12,2014;Accep ted:April 25,2014

吳家鑫,黃永東,齊鵬,等.大孔樹脂吸附與反相色譜純化恩拉霉素.生物工程學報,2014,30(11):1701–1708.

Wu JX,Huang YD,Qi P,et al.Purification of enram ycin by macroporous resin adsorption and reversed phase chromatography purification.Chin J Biotech,2014,30(11):1701–1708.

Suppo rted by:National High Technology Research and Development Program of China(863 Program)(No.2011AA 10A214). Corresponding autho r:Yongdong Huang.Tel:+86-10-82544987;E-mail:ydhuang@home.ipe.ac.cn Peng Qi.Tel:+86-10-56518199;E-mail:cahic_ivd@163.net

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(No.2011AA10A214)資助。