李長健，張旻，洪煬，韓艷輝，曹曉丹，韓宏曉，傅志強(qiáng)，朱傳剛，陸珂，李浩，林矯矯

1上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234 2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部寄生蟲重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200241

動(dòng)物及獸醫(yī)生物技術(shù)

日本血吸蟲SjRAD23基因的克隆表達(dá)及基因重組抗原的免疫保護(hù)效果

李長健1,2，張旻2，洪煬2，韓艷輝2，曹曉丹2，韓宏曉2，傅志強(qiáng)2，朱傳剛2，陸珂2，李浩2，林矯矯2

1上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234 2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部寄生蟲重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200241

輻射敏感蛋白23具有核苷酸切除修復(fù)功能，在泛素蛋白酶體途徑中起到重要作用。本研究利用PCR技術(shù)克隆了日本血吸蟲輻射敏感蛋白23(SjRAD23)編碼的cDNA序列，成功獲得SjRAD23的基因序列，其ORF為1 053 bp。構(gòu)建SjRAD23基因重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-SjRAD23，并在大腸桿菌BL21中成功誘導(dǎo)表達(dá)，重組蛋白在上清和沉淀中都有存在。利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)該蛋白在蟲體的分布情況，該蛋白廣泛分布在日本血吸蟲蟲體被膜。用重組蛋白免疫BALB/c小鼠后，免疫小鼠血清中檢測(cè)到較高水平的特異性IgG、IgG1和IgG2a。Western blotting分析顯示重組蛋白能夠被日本血吸蟲成蟲可溶性抗原免疫小鼠血清所識(shí)別。用重組蛋白rSjRAD23免疫結(jié)果與206佐劑對(duì)照組比較，rSjRAD23在BALB/c小鼠中誘導(dǎo)了35.94%減蟲率，40.59%肝臟減卵率。結(jié)果表明SjRAD23具有作為疫苗候選分子的潛力。

日本血吸蟲，輻射敏感蛋白23，表達(dá)，免疫保護(hù)，疫苗候選分子

血吸蟲病(Schistosom iasis)是由血吸蟲感染引起的一種慢性寄生蟲病，危害嚴(yán)重，是我國重要的公共衛(wèi)生問題之一。被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為具有社會(huì)經(jīng)濟(jì)破壞的寄生蟲病，流行于全球70多個(gè)國家和地區(qū)，約6億人生活在有感染危險(xiǎn)的環(huán)境中，深受其害[1-2]。寄生于人體的血吸蟲主要有3種：日本血吸蟲、曼氏血吸蟲和埃及血吸蟲，流行于我國的是日本血吸蟲。雖然半個(gè)多世紀(jì)以來，我國血吸蟲病防治取得巨大成就，但該病防治形勢(shì)依然嚴(yán)峻。在血吸蟲病治療方面，目前唯一大規(guī)模使用的治療藥物是吡喹酮，有研究表明在長期使用吡喹酮的情況下，可以產(chǎn)生對(duì)中國大陸株血吸蟲的抗藥性[3-4]。所以，如果有有效的疫苗再結(jié)合藥物治療，可能會(huì)給防治血吸蟲病帶來更為理想的防治效果[5-6]。

泛素是一類低分子量的蛋白質(zhì)，泛素化是指泛素分子在一系列特殊的酶作用下，將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)分類，從中選出靶蛋白分子，并對(duì)靶蛋白進(jìn)行特異性修飾的過程[7]。泛素化是真核細(xì)胞中廣泛存在的蛋白修飾方式，在蛋白質(zhì)的定位、代謝、調(diào)節(jié)和降解中都起著十分重要的作用。同時(shí)，它也參與了細(xì)胞增殖、凋亡、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、基因表達(dá)、損傷修復(fù)、信號(hào)傳遞、炎癥免疫等幾乎一切生命活動(dòng)的調(diào)控[8-9]。RAD23是蛋白泛素化過程中的配體蛋白，具有泛素連接酶E3的功能，其C末端具有泛素相關(guān)基序(Ubiquitin-associated motif，UBA)，能夠與多泛素蛋白鏈相結(jié)合，同時(shí)也在N端具有一泛素樣結(jié)構(gòu)域(Ubiquitin-like domain，UBL)，能夠指引配體蛋白和底物蛋白進(jìn)入蛋白酶體，蛋白酶體可以識(shí)別多泛素化修飾的底物蛋白，進(jìn)而促使泛素化修飾的底物蛋白進(jìn)入蛋白酶體進(jìn)而被降解[10]。此外，Rad23蛋白還可能保護(hù)多泛素蛋白側(cè)鏈免遭泛素蛋白水解酶的降解作用。同時(shí)，泛素化相關(guān)蛋白能夠借助RAD23蛋白的作用使糖蛋白去糖基化。由于RAD23在泛素化過程中起到重要作用，所以RAD23參與重要的生命活動(dòng)的調(diào)控[11]。盡管RAD23在其他物種已有相關(guān)報(bào)道，但關(guān)于日本血吸蟲RAD23蛋白尚未報(bào)道。

我們實(shí)驗(yàn)室在日本血吸蟲蛋白質(zhì)組學(xué)中鑒定到輻射敏感蛋白(SjRAD23)。本研究根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的日本血吸蟲輻射敏感蛋白(SjRAD23)基因序列(GI:226470141)克隆表達(dá)了SjRAD23基因，通過Western blotting、ELISA及動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)評(píng)估了SjRAD23重組蛋白在小鼠中誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與寄生蟲

日本血吸蟲中國大陸株尾蚴由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所釘螺實(shí)驗(yàn)室提供；雄性(SPF)6?8周齡BALB/c小鼠購自上海史萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；新西蘭大白兔(雄性2.0?3.5 kg)購自上海羅涇飛達(dá)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 主要試劑和菌種

206佐劑為SEPPIC公司的QP239129；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、Bam HⅠ、T4 DNA連接酶、Ex Taq Hot Start DNA聚合酶、pMT19-T載體等購自TaKaRa生物工程有限公司；DNA marker DL2 000、DL5 000，小量質(zhì)粒抽提試劑盒和DAB底物顯色液，感受態(tài)大腸桿菌DH5α、BL21 (DE3)，購于上海天根生物科技有限公司；QIAquick?Gel Extraction Kit購自Qiagen公司；Agarose、DEPC、DNA latter、Bradford Reagent蛋白定量試劑盒等購自上海生工生物工程公司；硝酸纖維素膜(Whatman)購自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；Bacto-yeast extract、Bacto-trypton為Oxoid公司產(chǎn)品；Ni-NTA His Bind Resin(Merck-Novagen)購自中科新生命生物科技有限公司；四甲基聯(lián)苯胺(TMB)購自天根生化科技(北京)有限公司；山羊抗小鼠IgG-HRP購自北京康為世紀(jì)生物工程公司。表達(dá)載體pET28a(+)和日本血吸蟲成蟲由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 蟲體的收集及c-DNA制備

新西蘭大白兔以腹部貼片法分別感染2 000?20 000條尾蚴，并分別于感染42 d后剖殺，肝門靜脈灌注法收集蟲體，將蟲體置于液氮凍存?zhèn)溆?。將液氮保存的蟲體取出，按照Trizol試劑盒說明書進(jìn)行總RNA提取及純化。反轉(zhuǎn)錄按照TaKaRa試劑盒說明書來操作進(jìn)行。

1.2.2 SjRAD23基因的克隆及生物信息學(xué)分析

根據(jù)日本血吸蟲輻射敏感蛋白SjRAD23 (GI:226470141)基因的ORF序列，設(shè)計(jì)引物，以日本血吸蟲42 d成蟲cDNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增含有完整ORF的cDNA序列片段。上游引物P1：GCG GGATCC ATGAAGGTTACTTTC，下游引物P2：CAG CTCGAG TCATACCATTTCATC。斜體下劃線部分分別為上下游引物的酶切位點(diǎn)部位。PCR反應(yīng)條件為：92℃預(yù)變性10 m in，92℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 m in。PCR產(chǎn)物純化回收以后，將其亞克隆至pMD19-T載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，培養(yǎng)12?16 h后挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)8 h后提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒命名為pMD19-T-SjRAD23。質(zhì)粒雙酶切鑒定后，將陽性質(zhì)粒送上海華津生物科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序得到的cDNA序列在NCBI上進(jìn)行同源性比對(duì)。用DNAStar軟件分析該基因的ORF，并對(duì)該基因的等電點(diǎn)、殘基數(shù)、蛋白相對(duì)分子量進(jìn)行分析。利用軟件Signal(http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)對(duì)其序列信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用CBS服務(wù)器(http://www.cbs.dtu.dk/services)提供的TMHMM Server v.2.0預(yù)測(cè)氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.2.3 重組質(zhì)粒pET28α(+)-SjRAD23的構(gòu)建與表達(dá)

將測(cè)序鑒定正確的SjRAD23的ORF序列的5?端和3?端分別加入Bam HⅠ和XhoⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)后定向亞克隆至原核表達(dá)載體pET28a的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建得到pET28a(+)-SjRAD23重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中。挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，通過菌液PCR鑒定和雙酶切鑒定正確后，陽性質(zhì)粒送上海華津生物科技有限公司測(cè)序。將鑒定測(cè)序正確的陽性菌液接種至LB培養(yǎng)基，37℃，250 r/m in，振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD值=0.6時(shí)加入終濃度為1 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。在誘導(dǎo)劑加入后不同時(shí)間段收取菌液，以SDS-PAGE電泳分析最佳表達(dá)時(shí)間及鑒定表達(dá)蛋白的存在形式。用不同濃度的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行多次透析，最終獲得穩(wěn)定的pET28α(+)-SjRAD23重組蛋白。

1.2.4 重組蛋白rSjRAD23多克隆抗體的制備及動(dòng)物免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)

將30只6?8周齡雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分成3組，每組10只。分別為PBS對(duì)照組，206佐劑對(duì)照組和重組蛋白rSjRAD23免疫組。PBS對(duì)照組每次每只皮下注射100μL的PBS。206佐劑對(duì)照組每次每只皮下注射100μL的206佐劑與PBS的乳化液，其中乳化劑中含有乳液54μL。重組蛋白rSjRAD23免疫組每次每只皮下注射100μL的重組蛋白rSjRAD23與206佐劑的乳化液，其中乳化劑中含有206佐劑54μL，含重組蛋白rSjRAD23(20μg)46μL。以相同的免疫計(jì)量，每隔兩周免疫1次，共免疫3次。分別于第1次免疫前1周及每次免疫后1周經(jīng)眼眶靜脈采集小鼠血液，37℃靜置1 h，4℃、2 000 r/min離心10 m in，分離并收集血清于?20℃保存。第3次免疫2周后，每只小鼠經(jīng)腹部皮膚貼片攻擊感染40±2條日本血吸蟲尾蚴。在感染尾蚴42 d剖殺小鼠，收集血清，以肝門靜脈灌注法收集蟲體并計(jì)數(shù)，計(jì)算減蟲率。同時(shí)，收集肝臟，稱重，置于50 m L離心管內(nèi)，加入適量去離子水，用勻漿機(jī)勻漿后定容至20 m L。取1 m L勻漿液和10%NaOH等體積混合，56℃水浴消化20 m in，消化完全后取20μL在光學(xué)顯微鏡下計(jì)算蟲卵數(shù)，每份樣品重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取其平均值，按照以下公式計(jì)算減蟲率和減卵率(EPG=每克肝組織中的蟲卵數(shù))。

減蟲率=[1?免疫組平均蟲荷數(shù)/206佐劑對(duì)照組平均蟲荷數(shù)]×100%

肝臟減卵率=[1?免疫組EPG/206佐劑對(duì)照組EPG]×100%

1.2.5 間接ELISA法檢測(cè)特異性抗體

純化的重組蛋白rSjRAD23用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液將純化的重組蛋白rSjRAD23稀釋至10μg/m L，包被96孔酶標(biāo)板，每孔100μL。將收集的各組小鼠血清1∶100稀釋后作為一抗，羊抗小鼠IgG-HRP、羊抗小鼠IgG1-HRP和羊抗小鼠IgG2a-HRP作1∶5 000稀釋后作為二抗，可溶性單組分TMB 100 m L避光顯色，2 mol/m L硫酸終止反應(yīng)，最后置于酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度，檢測(cè)抗體水平。

1.2.6 間接免疫熒光技術(shù)分析SjRAD23的蟲體組織定位

取日本血吸蟲42 d新鮮成蟲蟲體，制成厚度為10μm的冰凍切片，?20℃用丙酮固定30 m in后用10%山羊血清封閉2 h。以重組蛋白rSjRAD23免疫的BALB/c小鼠血清作為一抗孵育1 h，以正常小鼠血清作為陰性對(duì)照，Cy3標(biāo)記的山羊抗小鼠的IgG作為二抗孵育1 h，加入10μg/m L DAPI溶液室溫避光復(fù)染5 m in，置熒光顯微鏡下觀察蛋白的分布情況。

1.2.7 Western blotting分析重組蛋白rSjRAD23的抗原性

將純化的重組蛋白rSjRAD23進(jìn)行SDS-PAGE電泳，低溫轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜上，以日本血吸蟲成蟲可溶性抗原免疫小鼠血清(實(shí)驗(yàn)室保存提供)作為一抗，正常的小鼠血清作為陰性對(duì)照，以羊抗小鼠IgG-HRP(1∶5 000)作為二抗，二氨基苯胺(DAB)作為底物進(jìn)行顯色觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用Graph Pad Prism 5對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 SjRAD23基因的克隆及生物信息學(xué)分析

以42 d成蟲cDNA作為模板，應(yīng)用PCR技術(shù)克隆獲得含有完整ORF的SjRAD23編碼基因。分析表明該基因ORF為1 053 bp，編碼351個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量大概為37.88 kDa，等電點(diǎn)為4.46。獲取的目的基因通過BLSAT比對(duì)，結(jié)果顯示該基因與NCBI GenBank中日本血吸蟲輻射敏感蛋白(RAD23，GI:226470141)基因序列的相似性為100%。經(jīng)生物信息學(xué)分析該蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)域，不含信號(hào)肽。

2.2 SjRAD23基因的原核表達(dá)及重組蛋白的純化及鑒定

經(jīng)過PCR、雙酶切鑒定及測(cè)序，證實(shí)pET28α(+)-SjRAD23重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1)。pET28a(+)-SjRAD23重組表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果顯示重組蛋白以可溶性和包涵體形式存在。重組蛋白分子量約為44 kDa，與預(yù)測(cè)的分子量相符(圖2)。

2.3 間接ELISA法檢測(cè)特異性抗體結(jié)果

利用間接ELISA法檢測(cè)免疫小鼠血清中抗rSjRAD23特異性抗體IgG抗體水平變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重組蛋白免疫組小鼠在第1次免疫后就能夠檢測(cè)到抗rSjRAD23特異性IgG抗體，第2次免疫后特異性IgG抗體水平升高，第3次免疫后又進(jìn)一步升高，剖殺時(shí)特異性IgG抗體水平基本保持不變。而206佐劑組對(duì)照組和PBS空白對(duì)照組在3次免疫及剖殺后特異性IgG抗體基本保持不變。t檢驗(yàn)分析表明，重組蛋白免疫組與206佐劑組對(duì)照組和PBS空白對(duì)照組比較，特異性IgG抗體水平差異極顯著(P<0.01) (圖3)。

在一免、二免及三免后重組蛋白rSjRAD23在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生了特異性的IgG1和IgG2a抗體，且呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而206佐劑對(duì)照組卻沒有誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的IgG1和IgG2a抗體。免疫組與對(duì)照組比較，差異極顯著(P<0.01)(表1)。

2.4 間接免疫熒光分析SjRAD23的蟲體組織定位結(jié)果

在熒光顯微鏡下可以觀察到Cy3標(biāo)記的羊抗小鼠二抗IgG發(fā)出紅色熒光，DAPI復(fù)染細(xì)胞核后發(fā)出藍(lán)色熒光(圖4A)。用免疫前小鼠血清作為陰性對(duì)照(圖4B)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該蛋白廣泛分布在蟲體表膜中及部分蟲體實(shí)質(zhì)中(圖4)。

圖1 SjRAD23基因的克隆及重組質(zhì)粒雙酶切鑒定；Fig.1 Cloning of SjRAD23 gene and the identification of recombinant plasmid pET28a(+)-SjRAD23 by Eco RⅠand XhoⅠdigestion.(A)PCR Product of SjRAD23 gene.M: DNA marker DL2 000;1:PCR product of SjRAD23 gene. (B)Identification of the recombinant plasmid pET28a(+)-SjRAD23 by Bam HⅠand XhoⅠ.M:DNA marker DL5 000;2:production of the recombinant plasmid pET28a(+)-SjRAD23 by Bam HⅠand XhoⅠdigestion.

圖2 SDS-PAGE分析pET28a(+)-SjRAD23/BL21重組蛋白的表達(dá)Fig.2 SDS-PAGE analysis of the expression products of pET28a(+)-SjRAD23/BL21 in E.coli.M:protein marker; 1,2:expression of plasm id pET28a and recombinant plasm id of pET28a(+)-SjRAD23;3:purified recombinant protein of pET28a(+)-SjRAD23/BL21.

2.5 Western blotting分析重組蛋白rSjRAD23的抗原性

以純化的重組蛋白rSjRAD23作為抗原，以日本血吸蟲成蟲可溶性抗原免疫小鼠血清作為一抗進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果顯示在44 kDa呈現(xiàn)一條明顯的條帶，而正常小鼠血清作為陰性對(duì)照在此處未有條帶出現(xiàn)(圖5)，表明重組蛋白rSjRAD23具有良好的抗原性。

2.6 動(dòng)物保護(hù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

重組蛋白pET28α(+)-SjRAD23免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)顯示與206佐劑對(duì)照組比較顯示，rSjRAD23在BALB/c小鼠中誘導(dǎo)表達(dá)了35.94%減蟲率，40.59%肝臟減卵率。t檢驗(yàn)分析表明差異顯著(P＜0.05)(表2)，說明rSjRAD23在BALB/c小鼠中誘導(dǎo)產(chǎn)生了部分的免疫保護(hù)效果。

表1 rSjRAD23誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體亞型分析Tab le 1 Analysis of the level of IgG subtype induced by vaccination w ith rSjRAD23

圖4 SjRAD23蛋白在42 d日本血吸蟲蟲體內(nèi)的免疫組織定位(100×)Fig.4 The localization analysis of SjRAD23 by

immunofluorescence in 42 d worms(100×).

圖5 重組蛋白SjRAD23的Western b lotting分析Fig.5 Western blotting analysis of recombinant SjRAD23 protein.M:protein marker;1:probed w ith m ice serum specific to schistosome adult worm antigen preparation; 2:probed by negative mouse serum.

3 討論

日本血吸蟲生活史復(fù)雜，中間宿主是釘螺，終末宿主包括人類及其他多種哺乳動(dòng)物，危害嚴(yán)重。截止2012年底，我國推算日本血吸蟲病人共計(jì)240 597例[12]。日本血吸蟲體被是與宿主直接接觸的界面，是血吸蟲攝取營養(yǎng)物質(zhì)和運(yùn)送代謝物質(zhì)的重要場所。同時(shí)，日本血吸蟲體被表膜含有一些重要的生長因子、通道蛋白、受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，在日本血吸蟲生長發(fā)育過程中起到重要作用[13-14]。例如，乙酰膽堿通過與表膜上的乙酰膽堿受體作用，可以輔助血吸蟲吸收營養(yǎng)和神經(jīng)調(diào)節(jié)[15]。更值得關(guān)注是，在日本血吸蟲不同的生長發(fā)育階段，為了適應(yīng)宿主內(nèi)不同的環(huán)境，其體被表膜不斷地更新和改變，以修復(fù)宿主抗體損傷的部位，從而逃避宿主的免疫攻擊。因此，體被相關(guān)蛋白的研究對(duì)于日本血吸蟲病疫苗發(fā)展和免疫診斷具有重要意義[16]。

RAD23最初是從酵母輻射突變體(Radiation sensitive mutant，RAD)中分離發(fā)現(xiàn)的[17]。早期研究發(fā)現(xiàn)該蛋白能夠促使核酸切除修復(fù)(Nucleotide excision repair，NER)復(fù)合體中的TFIIH與RAD14的結(jié)合，在DNA的切除修復(fù)過程中起到重要作用[18-19]。RAD23是蛋白泛素化過程中的配體蛋白，蛋白泛素化是真核細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的蛋白修飾方式，泛素化在蛋白的定位、代謝、功能及降解中都起到重要作用，同時(shí)它也參與了細(xì)胞增殖、分化、基因表達(dá)、損傷修復(fù)等生命活動(dòng)的調(diào)控[20]。越來越多的研究表明，蛋白質(zhì)的泛素化在調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮著非常重要的作用[21-22]。RAD23具有泛素連接酶E3的功能，其C末端具有泛素相關(guān)基序(Ubiquitin-associated motif，UBA)，能夠與多泛素蛋白鏈相結(jié)合，同時(shí)也在N端具有一泛素樣結(jié)構(gòu)域(Ubiquitin-like domain，UBL)，能夠通過泛素-26S蛋白酶體途徑在細(xì)胞周期調(diào)控、基因表達(dá)、細(xì)胞增殖分化等生物過程中發(fā)揮重要作用[23-24]。

表2 BALB/c小鼠免疫保護(hù)效果Tab le 2 Resu lts of protective efficacy against S.japonicum challenge in BALB/c m ice induced by rSjRAD23

本實(shí)驗(yàn)首次克隆、表達(dá)了日本血吸蟲輻射敏感蛋白SjRAD23，生物信息學(xué)分析表明該蛋白不含信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析顯示日本血吸蟲SjRAD23蛋白廣泛分布于蟲體表膜和部分實(shí)質(zhì)中。間接ELISA和Western blotting結(jié)果都顯示重組抗原rSjRAD23可被日本血吸蟲成蟲可溶性抗原免疫小鼠血清和重組蛋白免疫小鼠血清識(shí)別，表明日本血吸蟲SjRAD23具有較好的抗原性和免疫原性。用純化的rSjRAD23蛋白免疫小鼠后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示小鼠產(chǎn)生了較高水平的IgG、IgG1、IgG2a抗體，IgG1參與激活Th2型輔助細(xì)胞，IgG2a與激活Th1型輔助細(xì)胞有關(guān)[25]，表明rSjRAD23誘發(fā)小鼠產(chǎn)生了抗日本血吸蟲感染的Th1/Th2混合型免疫反應(yīng)。PBS組和206佐劑組中在3次免疫后未能產(chǎn)生針對(duì)重組蛋白rSjRAD23的抗體，只在感染6周后出現(xiàn)很低滴度的抗rSjRAD23的特異性抗體。推測(cè)其原因可能是：首先，RAD23是蛋白泛素化過程中的配體蛋白，主要參與26S蛋白酶體調(diào)控，而調(diào)控過程主要是在真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，因此此蛋白主要存在于細(xì)胞內(nèi)，難以誘導(dǎo)較高滴度的特異性抗體；其次，血吸蟲蛋白種類非常多，RAD23可能含量較低，只是蟲體源的蛋白難以誘導(dǎo)較高滴度的特異性抗體。重組蛋白免疫組小鼠感染后6周的抗體與第3次免疫后抗體比較沒有差異，可能是因?yàn)榈?次免疫后針對(duì)重組蛋白的特異性抗體沒有能夠繼續(xù)上升；也可能是由于小鼠感染血吸蟲后，如上所述，重組蛋白只產(chǎn)生很低滴度的特異性抗體。動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)顯示，重組蛋白rSjRAD23免疫的BALB/c小鼠與206佐劑對(duì)照組比較，減蟲率和減卵率分別為35.94%和40.59%，獲得部分免疫保護(hù)效果。這些都表明，日本血吸蟲SjRAD23具有成為日本血吸蟲疫苗的候選抗原的潛能。SjRAD23蛋白作為蛋白泛素化途徑中的重要配體蛋白，在泛素化過程中起到重要的作用，可能也在日本血吸蟲的生長和發(fā)育過程中產(chǎn)生了重要、不可替代的作用，2005年Guerra-Sa R等也實(shí)驗(yàn)證明了泛素蛋白酶體途徑對(duì)曼氏血吸蟲的生長發(fā)育的重要性[26]。有關(guān)日本血吸蟲SjRAD23蛋白在日本血吸蟲體內(nèi)具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Cloning,expression and protective efficacy evaluation of radiation sensitive protein 23(RAD23)from Schistosoma japonicum

Changjian Li1,2,M in Zhang2,Yang Hong2,Yanhui Han2,Xiaodan Cao2,Hongxiao Han2, Zhiqiang Fu2,Chuangang Zhu2,Ke Lu2,Hao Li2,and Jiaojiao Lin2
1 College of Life and Environment Science,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China 2 Key Laboratory of Animal Parasitology,M inistry of Agriculture,Shanghai Veterinary Research,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Shanghai 200241,China

Radiation sensitive protein 23(RAD23)is a nucleotide excision repair(NER)protein that plays an important role in Ubiquitin-proteasome pathway(UPP).Schistosoma japonicum radiation sensitive protein23(SjRAD23)cDNA sequences were amplified by PCR and cloned into pET28a(+)vector to construct recombinant expression plasm id pET28a (+)-SjRAD23.The recombinant protein was expressed as both inclusion bodies and the supernatant in Escherichia coli BL21(DE3)cell.Immunofluorescence observation show s that SjRAD23 was mainly distributed on the tegument surface of the worms.ELISA assay reveals that specific IgG,IgG1 and IgG2a antibodies could be detected in the sera of rSjRAD23 immunized mice.Western blotting analysis shows that the recombinant SjRAD23 could be recognized by serum specific to soluble adult worm antigen of S.japonicum.BALB/c m ice vaccinated w ith rSjRAD23 combined w ith 206 adjuvant revealed 35.94%worm reduction and 40.59%liver egg reduction when compared w ith that of the adjuvant control group.This study suggests that rSjRAD23 has the potential as a vaccine against schistosome infection.

Schistosoma japonicum,SjRAD23,expression,immunoprotection,vaccine candidate

February 19,2014;Accep ted:April 25,2014

Jiaojiao Lin.Tel:+86-21-34293440;E-mail:jjlin@shvri.ac.cn

李長健,張旻,洪煬,等.日本血吸蟲SjRAD23基因的克隆表達(dá)及基因重組抗原的免疫保護(hù)效果.生物工程學(xué)報(bào),2014, 30(11):1669?1678.

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