章杰兵，徐燕茹，邱 彥，霍中華

·論著·

過表達LncRNA-MEG3對腸癌細胞Lovo增殖活性的影響

章杰兵，徐燕茹，邱 彥，霍中華

目的 用PCR擴增長鏈非編碼RNA-MEG3，構(gòu)建MEG3真核表達載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人腸癌細胞Lovo，觀察MEG3含量改變對Lovo細胞增殖活性的影響。方法 用293細胞提取人總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，PCR擴增MEG3基因并構(gòu)建克隆，陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒至Lovo細胞，轉(zhuǎn)染后48 h通過熒光標(biāo)記物GFP觀察細胞轉(zhuǎn)染效率。RealTime-PCR檢測轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)MEG3含量變化。CCK-8檢測腫瘤細胞對數(shù)生長期基因干預(yù)對于增殖活性的影響。結(jié)果 成功獲取了MEG3基因并構(gòu)建了重組表達載體;成功轉(zhuǎn)染Lovo細胞，轉(zhuǎn)染后48 h，細胞轉(zhuǎn)染效率約為60%;轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)MEG3含量明顯升高，與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，相對含量上升約6.8倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);外源MEG3的高表達可抑制Lovo細胞增殖活性，基因干預(yù)后48、72 h，與未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染對照組細胞比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論 LncRNA-MEG3可顯著抑制Lovo細胞增殖活性。

LncRNA;Lovo;MEG3;細胞活性

腸癌是目前世界范圍內(nèi)消化系統(tǒng)中常見的惡性 腫瘤，發(fā)病率僅次于胃和食管癌，是大腸癌的最常見部分，全世界每年因病致死率約為40萬［1］。雖然我國的發(fā)病率原本不高，但近年來隨著國民飲食和生活習(xí)慣的改變，其發(fā)病率逐漸上升，并且以平均每年4.2%的速率遞增［2］。因此，探索腸癌新的發(fā)病機理，尋找新的治療途徑，已成為提高全民健康的迫切要求。

長非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)一般是指內(nèi)源性，長度大于200個堿基的RNA序列，母系表達基因 3(materally expressed gene 3，MEG3)是第一個被發(fā)現(xiàn)有腫瘤抑制功能的 lncRNA［3］。MEG3作為腫瘤抑制因子，在腦膜瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤及血液瘤中已經(jīng)得到證實［4］，而其在腸癌細胞中的作用未有見相關(guān)報道。

1 材料與方法

1.1 材料

正常人腸上皮細胞FHC、腸癌細胞株Lovo購于上海中科院細胞所;胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶，F(xiàn)-12K培養(yǎng)基、Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑及Trizol均為Invitrogen公司產(chǎn)品;細胞培養(yǎng)耗材為BD公司產(chǎn)品;pCDF1-copGFP vector購于美國System Biosciences公司;限制性內(nèi)切酶XbaI和EcoR I、DH5α感受態(tài)細胞、DNA Marker、M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、連接酶、DNA回收試劑盒、熒光定量試劑盒等購于大連寶生物工程有限公司;定量檢測PCR管及無菌離心管為Axygen公司產(chǎn)品;CCK-8細胞活性檢測試劑盒購于日本同仁化學(xué);質(zhì)粒提取試劑盒購于Qiagen公司;細胞培養(yǎng)箱為日本三洋公司產(chǎn)品，移液器、離心機為Eppendof公司產(chǎn)品;定量PCR、梯度PCR儀均為Takara公司產(chǎn)品，電泳儀為上海天能公司產(chǎn)品，酶標(biāo)儀及紫外分光光度計為Thermo公司產(chǎn)品;引物合成及測序在上海Invitrogen公司完成。

1.2 方法

MEG3重組表達載體構(gòu)建Lovo細胞轉(zhuǎn)染、MEG3含量測定、CCK-8檢測細胞活性方法參考文獻［3］。

根據(jù)MEG3(NR_002766.2)的RNA序列信息，設(shè)計PCR擴增引物，上下游引物分別添加酶切位點Xba I及EcoRΙ及保護堿基，上游引物添加kozak序列。PCR引物序列:Forward primer-MEG3:5＇-TCTAGA(Xba I)GCCACC(kozak)AGCCCCTAGCGCAGA-3＇;Revese primer-MEG3:5＇-GAATTC(EcoR I)TTGTTAAGACAGGAAACAC-3＇，PCR長度為1 592 bp。Real Time-PCR檢測，引物序列:Beta actin-forward primer，5＇-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3＇，Beta actin-reverse primer 5＇-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3＇，PCR產(chǎn)物長度為211bp;MEG3-forward primer 5＇-TGCGGATGGAAGCTGCGGAAGAG-3＇，MEG3-reverse primer 5＇-CGCCCAAACCAGGAAGGAGACGAG-3＇，PCR產(chǎn)物長度為102 bp。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用析因分析進行組間差異及組內(nèi)差異的比較。P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 目的基因獲得

通過PCR的方法成功得到目的基因，根據(jù)DNA Marker判斷PCR擴增產(chǎn)物大小與理論值(1 592 bp)完全相符合，PCR反應(yīng)體系無條帶，說明體系未受到污染。見圖1。

圖1 PCR擴增目的基因瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 克隆構(gòu)建

成功構(gòu)建了MEG3基因真核表達載體，陽性菌落檢測結(jié)果見圖2，其中2、4號克隆有目的基因插入，且大小與理論值相符，選取4號克隆提取質(zhì)粒，用載體多克隆位點上游的通用引物對重組質(zhì)粒進行測序，測序結(jié)果經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)序列比對，完全一致。

圖2 PCR檢測陽性菌落瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 Lovo細胞轉(zhuǎn)染效率檢測

轉(zhuǎn)染后48 h，使用熒光倒置顯微鏡觀察細胞，通過熒光標(biāo)記物GFP的表達判斷，細胞基因?qū)胄始s為90%。見圖3。

圖3 Lovo細胞轉(zhuǎn)染HE染色圖

2.4 轉(zhuǎn)染后Lovo細胞內(nèi)MEG3相對含量分析

以Ct值分析MEG3的相對含量，以Beta actin作為參照基因。數(shù)據(jù)分析顯示，Lovo細胞轉(zhuǎn)染后實驗組細胞MEG3相對含量明顯上升，與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對細胞內(nèi)MEG3相對含量無明顯影響(P＞0.05)。見圖4。

圖4 RNA含量檢測

2.5 MEG3過表達對Lovo細胞增殖活性影響檢測

使用pcDNA-MEG3及對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Lovo細胞，轉(zhuǎn)染后細胞培養(yǎng)24、48及72 h，CCK-8檢測細胞活性。檢測結(jié)果顯示，在對數(shù)增殖期，MEG3含量升高能夠明顯抑制Lovo細胞增殖活性，轉(zhuǎn)染后48、72 h，與對照組細胞相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對照組細胞活性與未轉(zhuǎn)染組(Lovo組)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，這說明轉(zhuǎn)染試劑及實驗本身對細胞增殖活性無明顯影響。見圖5。

圖5 細胞活性檢測

3 討論

進一步研究和揭示結(jié)腸癌的分子發(fā)病機制，尋找新的治療途徑和基因治療靶點，一直以來都是腸癌相關(guān)研究領(lǐng)域的熱點，對于我國這樣的人口大國，直接關(guān)系到全民健康水平。LncRNA起初被認為是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，是基因轉(zhuǎn)錄的“噪音”，因此其不具有生物學(xué)功能。然而，近年研究表明，LncRNA具有諸多生物學(xué)功能:其參與染色體沉默、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種生物學(xué)過程［5-7］;以多種形式影響蛋白功能;影響 miRNA含量。LncRNA的作用方式如下:(1)影響基因啟動子區(qū)域，從而干擾鄰近蛋白編碼基因的表達;(2)抑制RNA聚合酶Ⅱ，或介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)和組蛋白修飾，而影響基因表達;(3)與基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補雙鏈，進而影響基因轉(zhuǎn)錄效率及剪切形式;(4)結(jié)合在特定蛋白質(zhì)上調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性;(5)作為結(jié)構(gòu)組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體;(6)結(jié)合在特定蛋白上從而改變該蛋白的胞質(zhì)定位;(7)可作為miRNA的前體分子［8］。

現(xiàn)有研究證實，腫瘤的形成及發(fā)展，與lncRNA異常密切相關(guān)。第二軍醫(yī)大學(xué)孫樹漢教授課題組，首次發(fā)現(xiàn)了能抑制肝癌轉(zhuǎn)移的新 LncRNA-Dreh。Gabory A等［9］研究發(fā)現(xiàn)LncRNA H19與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。LinR等［10］在2007年發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞中LncRNA-MALAT1具有異常表達，其與腫瘤具有相關(guān)性。lncRNA還被證實與肝癌的耐藥性有關(guān)，位于染色體19p13.1，CUDR lncRNA可通過抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表達而引起細胞增殖活性增強，當(dāng)其表達下調(diào)后細胞對化療藥物變得不敏感，產(chǎn)生耐藥［11］。

本實驗通過構(gòu)建MEG3重組表達載體，脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染人腸癌細胞株Lovo，MEG3相對含量檢測結(jié)果說明，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法可以在Lovo細胞中高效表達外源性MEG3。細胞活性檢測結(jié)果則說明，外源性MEG3的高表達可明顯抑制Lovo細胞增殖活性，MEG3含量水平與腫瘤細胞增殖活性具有負相關(guān)性，提示MEG3具有抑制腫瘤細胞增殖的活性，其可成為腸癌治療潛在的基因靶點，為腸癌的臨床治療提供新的理論依據(jù)。

［1］ Pisani P，Parkin DM，Bray F，et al.Estimates of the worldwide mortality from 25 cancers in 1990［J］.Int JCancer，1999，83(1): 18-29.

［2］ Guttman M，Amit I，Garber M，etal.Chromatin signature reveals over a thousand highly conserved large non-coding RNAs in mammals［J］.Nature，2009，458:223-227.

［3］ Zhang X，Gejman R，Mahta A，et al.Maternally expressed gene3，an imprinted noncoding RNA gene，is associated with meningioma pethpgenesis and progression［J］.Cancer Res，2010，70 (6):2350-2358.

［4］ Wang PJ，Ren ZQ，Sun PY.Overexpression of the long non-coding RNA MEG3 impairs in vitro glioma cell proliferation［J］.JCell Biochem，2012.

［5］ 孫奮勇.解碼基因組中的“暗物質(zhì)”［J］.同濟大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2011，32(1):1-4.

［6］ Mercer TR，Dinger ME，Sunkin SM，et al.Specific expression of long noncoding RNAs in themouse brain［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(2):716-721.

［7］ Ponting CP，Oliver PL，Reik W.Evolution and functions of long noncoding RNAs［J］.Cell，2009，136(4):629-641.

［8］ Ogawa Y，Sun BK，Lee JT.Intersect ion of the RNA interference and X-inact ivation pathways［J］.Science，2008，320:1336-1341.

［9］ Gabory A，Ripoche MA，Yoshimizu T，etal.The H19 gene:regulation and function of a non-coding RNA［J］.Cytogenet Genome Res，2006，113(1-4):188-193.

［10］Lin R，Maeda S，Liu C，etal.A large noncoding RNA is amarker formurine hepatocellular carclnomas and a spectrum of human carcinomas［J］.Oncogene，2007，26(6):851-858.

［11］Tsang WP，Wong TW，Cheung AH，et al.Induction of druag resistance and transformation in human cancer cells by the noncoding RNA CUDR［J］.RNA，2007，13(6):890-898.

Effect of LncRNA-MEG3 over-expression on the proliferation activity of colorectal cancer Lovo cells

ZHANG Jie-bing，XU Yan-ru，QIU Yan，HUO Zhong-hua

(Drug and Instrument Control Institute，Joint Logistic Command，Nanjing Military District，Nanjing 210002，China)

Objective To investigate the effect of the changes in MEG3 level on proliferation activity in Lovo cells，through the amplification of the non-coding RNA-MEG3 by PCR and the construction of a eukaryotic expression vector forMEG3，which was transfected into a human colon cancer cell line，Lovo.Methods cDNA was prepared from the total RNA extracted from 293 cells by reverse transcription and MEG3 genewas amplified by PCR and was used to construct a recombinant plasmid，which was transfected into Lovo cells by using cationic liposome.Transfection efficiency was evaluated by observation on the expression of GFPmarker48 hours after transfection，and changes in MEG3 contentwere detected by RT-PCR(Real-time-PCR).CCK-8 was used tomeasure the effect of genetic intervention on proliferative activity in tumor cells in the logarithmic growth phase.Results MEG3 gene was successfully obtained and the recombinant expression vectorwas constructed.Lovo cellswere successfully transfected，and 48 hours after transfection，the transfection efficiency reached as high as60%.MEG3 level in transfected cellswas significantly increased for approximately 6.8 folds，as compared with that of the transfected control group(P＜0.01).High expression ofexogenousMEG3 in Lovo cells could inhibit cell proliferation，and significant differences could be noted at hours 48 and 72 after the genetic intervention，as compared with those of the untransfected group and the transfected control group(P＜0.01).Conclusion LncRNA-MEG3 could obviously inhibit the proliferation of Lovo cells.

LncRNA;Lovo;MEG3;Proliferation activity

R735.3

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2014.05.005

210002 南京，南京軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗所(章杰兵);南京軍區(qū)衛(wèi)生部(徐燕茹);解放軍第四五四醫(yī)院(邱彥、霍中華)

霍中華，電子信箱:nky454@126.com