劉躍生，潘陳苗，姚寧屏，邵忠海

（1.嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江嘉興 314036；2.嘉興市新塍鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)監(jiān)督管理所，浙江嘉興 314015）

直接肉湯藥敏試驗在豬病防治中的應(yīng)用

劉躍生1，潘陳苗2，姚寧屏1，邵忠海1

（1.嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江嘉興 314036；2.嘉興市新塍鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)監(jiān)督管理所，浙江嘉興 314015）

為快速篩選出敏感獸藥，減少盲目用藥和細菌耐藥性的產(chǎn)生，為臨床獸醫(yī)防治疾病提供依據(jù)，本研究以藥物臨床治療劑量為基礎(chǔ)，制備含藥的藥敏培養(yǎng)基，研發(fā)直接肉湯藥敏試驗方法。經(jīng)6個試驗組的試驗證明，以直接肉湯藥敏試驗方法篩選的敏感獸藥與臨床療效高度相符，待檢樣品中細菌分別對試驗豬場常用獸藥有一定耐藥性；藥敏試驗前后防治效果的差異極其顯著；直接肉湯藥敏試驗的重復(fù)性和穩(wěn)定性高，準(zhǔn)確率＞97%。直接肉湯藥敏試驗方法具有操作簡便、快速，可定量的特點，有較高的臨床應(yīng)用價值，篩選并合理使用敏感藥物，能顯著提高臨床治療效果。

藥敏試驗；敏感獸藥；臨床療效

近年來，我國豬場經(jīng)常流行或散發(fā)不明原因的高熱、拒食、呼吸困難、皮膚發(fā)紅等癥狀的生豬疫病。據(jù)報道主要由豬藍耳病病毒、豬圓環(huán)病毒、豬丹毒桿菌、豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、豬多殺性巴氏桿菌等病原混合感染引起［1］。實驗室診斷生豬疫病后，一般采用紙片擴散法或肉湯稀釋法對分離菌株進行藥敏試驗，前者只能定性檢測細菌藥敏性，后者定量檢測藥物最小殺菌濃度和最小抑菌濃度，但要求條件較高，操作煩瑣，耗時較長，一般5d以上才能得出確診和藥敏結(jié)果［2］。在藥敏結(jié)果出來前，僅憑獸醫(yī)經(jīng)驗防治復(fù)雜疫病，往往導(dǎo)致延誤最佳治療時間，造成疫情反復(fù)、損失巨大。故實驗室常規(guī)診斷及藥敏試驗方法在獸醫(yī)臨床應(yīng)用上的價值受到限制。

為了尋求操作簡便快速、臨床實用、可定量，重復(fù)性和穩(wěn)定性高的藥敏方法，我們成功研發(fā)了直接肉湯藥敏試驗，取得了理想的防治效果，為獸醫(yī)臨床工作者有效控制動物疫情提供了新思路。現(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 制備藥敏培養(yǎng)基

選擇細菌干粉培養(yǎng)基（Mueller-HintonBroth，簡稱MH肉湯），購自杭州天和微生物試劑有限公司，產(chǎn)品執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)YZB／浙0660—2009，細菌干粉培養(yǎng)基成分符合GB4789—28的要求，外觀為細粉末狀，產(chǎn)品批號在有效期內(nèi)，細菌干粉培養(yǎng)基pH值為7.4，用于抗生素敏感試驗。需氧菌及兼性厭氧菌在此培養(yǎng)基中生長良好。

準(zhǔn)確稱取干粉培養(yǎng)基36g，加入到1000mL蒸餾水中，煮沸充分溶解，補足水分，過濾、準(zhǔn)確分裝到小試管，每管5mL，蓋上硅膠塞。121℃滅菌30min，37℃培養(yǎng)20h，無菌檢驗合格的放入4℃冰箱備用。

1.2 采集及制備待檢樣品

2012年11月至2013年10月，選擇6個發(fā)病豬場作為試驗組。

各組撲殺典型發(fā)病豬2～3頭，無菌采集心包滲出液、胸腔積液等，每份病料采集1～2mL，混合后作為待檢樣品。

試驗組1，初步診斷為豬肺疫、豬偽狂犬病，無菌采集3例病豬的心包液混合物。

試驗組2，初步診斷為豬出血性胸膜肺炎、豬藍耳病，無菌采集2例病豬的胸腔積液混合物。

試驗組3，初步診斷為豬肺疫、豬藍耳病，無菌采集3例病豬的胸腔積液混合物。

試驗組4，初步診斷為豬出血性胸膜肺炎、豬氣喘病，無菌采集2例病豬的胸腔積液混合物。

試驗組5，初步診斷為副豬嗜血桿菌病、豬氣喘病，無菌采集2例病豬的胸腔積液混合物。

試驗組6，初步診斷為副豬嗜血桿菌病、豬出血性胸膜肺炎、豬氣喘病，無菌采集2例病豬的胸腔積液混合物。

1.3 藥敏培養(yǎng)基中試驗獸藥的劑量

藥敏培養(yǎng)基以MH肉湯培養(yǎng)液5mL（5g）為基質(zhì)，1mL肉湯培養(yǎng)液代表1個kg體重單位，以藥物的高限臨床治療劑量1／1000為單位，計算藥物的添加劑量。

例如，液體制劑的臨床治療劑量0.1～0.2mL· kg－1，試驗選用高限0.2mL·kg－1，5mLMH肉湯試驗管中應(yīng)加入試驗獸藥原液1μL。固體制劑的臨床治療劑量如是3mg·kg－1，則5mL（5g）MH肉湯中應(yīng)加入15μg獸藥。

1.3.1 頭孢噻呋鈉的劑量

頭孢噻呋鈉，江西金康佳生化藥業(yè)有限公司出品，批號20120718，規(guī)格0.5g·瓶－1，臨床治療3mg·kg－1，配制5mL試驗劑量為15μg。

1.3.2 復(fù)方氨芐西林的劑量

復(fù)方氨芐西林，湖北省武當(dāng)動物藥業(yè)有限公司，批號20120701，規(guī)格0.5g·瓶－1，臨床治療3mg·kg－1，配制為5mL用15μg。

1.3.3 慶大霉素的劑量

慶大霉素，杭州錢浪藥業(yè)有限公司，批號20120601，規(guī)格8萬IU·2mL－1，臨床治療0.1 mL·kg－1，配制為5mL用0.5μL。

1.3.4 替米考星的劑量

替米考星，江西金康佳生化藥業(yè)有限公司，批號20120608，規(guī)格3g·10mL－1，臨床治療0.15 mL·kg－1，配制為5mL用0.75μL。

1.3.5 林可霉素的劑量

林可霉素，湖北省武當(dāng)動物藥業(yè)有限公司，批號20120823，規(guī)格3.0g·10mL－1，臨床治療劑量0.1mL·kg－1，配制為5mL用0.5μL。

1.3.6 氟苯尼考的劑量

氟苯尼考，湖北省武當(dāng)動物藥業(yè)有限公司，批號20120720，規(guī)格2g·10mL－1，臨床治療0.1 mL·kg－1，配制為5mL用0.5μL。

1.3.7 硫酸粘菌素的劑量

硫酸粘菌素，湖南偉達生物科技有限公司，批號20120309，規(guī)格150萬IU·2mL－1，臨床治療0.1mL·kg－1，配制為5mL用0.5μL。

1.3.8 10%恩諾沙星的劑量

10%恩諾沙星，江西金康佳生化藥業(yè)有限公司，批號20120430，規(guī)格1g·10mL－1，臨床治療0.15mL·kg－1，配制為5mL0.75μL。

1.3.9 乳酸環(huán)丙沙星的劑量

乳酸環(huán)丙沙星，浙江大飛龍動物保健品有限公司，批號20120202，規(guī)格0.2g·10mL－1，臨床治療0.1mL·kg－1，配制為5mL用0.5μL。

1.3.10 復(fù)方磺胺嘧啶鈉注射液（簡稱SD-TMP）的劑量

復(fù)方磺胺嘧啶鈉注射液，浙江金力制藥有限公司，批號20120625，規(guī)格1g＋0.2g·10mL－1，臨床治療30mg·kg1，配制為5mL150μg。

1.3.11 復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液（簡稱SMM-TMP）的劑量

復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液，湖南偉達生物科技有限公司，批號20120819，規(guī)格1g＋0.2g· 10mL－1，臨床治療0.2mL·kg－1，配制為5mL用1μL。

1.4 藥敏試驗結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)和方法

每種試驗獸藥按設(shè)定劑量配制后，分別加入2支藥敏試驗管，以便重復(fù)對照，再加入待檢樣品10μL；另設(shè)不加抗菌藥物及待檢樣品的MH肉湯空白對照管、不加抗菌藥物而加待檢樣品10μL的MH肉湯細菌對照管各2支；分別充分混勻，經(jīng)（35±2）℃培養(yǎng)18h，根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)進行對比分析，篩選敏感藥物。

藥敏反應(yīng)程度設(shè)5個級別：＋＋＋＋表示100%液體完全透明，無細菌生長，管底無凝集沉淀物；＋＋＋表示75%液體透明，有少量細菌生長，略呈混濁，管底有極少量凝集沉淀物；＋＋表示50%液體透明，有部分細菌生長，中等程度混濁，管底有少量凝集沉淀物；＋表示25%液體透明，有多量細菌生長，明顯混濁，管底有較多凝集沉淀物；－表示100%液體不透明，有大量細菌生長，有明顯凝集沉淀物，振蕩呈均勻混濁。

試驗對照管必須達到標(biāo)準(zhǔn)：MH肉湯空白對照管，100%液體完全透明，無細菌生長，管底無凝集沉淀物，以＋＋＋＋標(biāo)記；MH肉湯細菌對照管，100%液體不透明，有大量細菌生長，有明顯凝集沉淀物，振蕩時呈均勻混濁。以－標(biāo)記。

藥敏試驗管及對照管經(jīng)（35±2）℃培養(yǎng)18h后，在試驗對照管符合標(biāo)準(zhǔn)的情況下，根據(jù)各藥敏試驗管中肉湯的透明度、混濁度、管底沉淀物的性狀，分別與對照管標(biāo)準(zhǔn)進行比較，得出待檢樣品中細菌對各種獸藥的敏感程度，分別確定＋＋＋＋為高度敏感，＋＋＋為敏感，＋＋為中度敏感，＋為低度敏感，－不敏感。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥敏情況

采用11種獸藥分別對6個試驗組的待檢樣品進行藥敏試驗。

有關(guān)試驗芭敏情況的詳細結(jié)果列于表1。

表1 各試驗組別的藥敏情況

2.2 臨床療效

試驗組1前期已飼喂SMM-TMP5d，故不選用，病重者選用復(fù)方氨芐西林肌注1～2次·d－1，3mg·kg－1，連用3d；輕者選用10%恩諾沙星，0.15mL·kg－1，必要時第3天再注射1次。經(jīng)5d治療，出現(xiàn)豬偽狂犬病癥狀，全群緊急免疫，3d后逐漸康復(fù)。

試驗組2選用最敏感藥物頭孢噻呋鈉肌注，3 mg·kg－1，1次·d－1，連用3～5d。

試驗組3豬群病情較重，硫酸粘菌素毒性大，故選用中度敏感藥物頭孢噻呋鈉，3mg·kg－1，1次·d－1，連用3～5d。

試驗組4對咳嗽嚴(yán)重的選用替米考星，0.15 mL·kg－1，1次·d－1，連用3d，輕者用10%恩諾沙星，0.15mL·kg－1，或3d再打1次。

試驗組5選用頭孢噻呋鈉，3mg·kg－1，1次·d－1，連用3～5d；添加10%恩諾沙星混料，連用5d。

試驗組6及時選用硫酸慶大霉素，4mg· kg－1，1次·d－1，連用3～5d。

各試驗組分別應(yīng)用上述藥物治療的同時，飼料中添加多種維生素、氨基酸，增強機體抵抗力。經(jīng)統(tǒng)計分析，藥敏試驗前后死亡率的變化呈極顯著差異，取得了顯著的防治效果（表2）。

表2 各試驗組別的臨床療效

2.3 細菌耐藥性

各試驗組細菌耐藥性的產(chǎn)生，與各豬場平時反復(fù)、不當(dāng)使用抗菌藥物有密切關(guān)系（表3）。從表1及表3顯示，待檢樣品中細菌對試驗獸藥中度敏感以下占74%。

試驗組1和5病菌對經(jīng)常使用的頭孢噻呋鈉、替米考星、林可霉素為中敏以下，其他為敏感以上；試驗組2，3和6長期濫用抗菌藥物，分別只有1種獸藥敏感以上；試驗組4注重飼養(yǎng)管理，做好保健、防疫工作，不隨意使用各類抗生素，大部分為敏感以上。

表3 各試驗組別的細菌耐藥性

3 小結(jié)與討論

實驗室診斷、分離病原細菌后，以紙片擴散法或肉湯稀釋法進行常規(guī)藥敏試驗，由于操作復(fù)雜、檢測時間較長，且誤差率偏高，種種條件均限制常規(guī)藥敏試驗快速、高效檢驗［3－4］；而直接肉湯藥敏試驗一般不超過20h便可得出藥敏結(jié)果。6組藥敏試驗管中，僅2對藥敏試驗管的誤差大，忽略操作誤差后準(zhǔn)確率約＞97%。6組試驗病豬群在選擇敏感獸藥治療后，病死率大大下降，防治效果顯著。試驗方法操作簡便、快速，重復(fù)性和穩(wěn)定性高，具有較高的臨床應(yīng)用價值。

選擇各類試驗獸藥，按臨床治療劑量配制試驗獸藥劑量，可以使體外藥敏結(jié)果更接近臨床療效。有報道稱，藥敏結(jié)果和臨床療效兩者符合率一般為70%～80%［5］，但通常藥敏結(jié)果是選擇抗菌藥物的最重要科學(xué)依據(jù)。臨床獸醫(yī)根據(jù)藥敏結(jié)果，結(jié)合前期獸藥使用情況、多種病原菌感染、抗菌藥物特性、藥品價格、病畜狀況等因素，確定首選的敏感獸藥，進行及時有效防治。

總之，當(dāng)規(guī)模豬場發(fā)生疫情，臨床初步診斷是多重細菌性感染或混合感染時，采用直接肉湯藥敏試驗方法，快速確定藥敏結(jié)果，合理使用首選敏感藥物，可減少盲目用藥和細菌耐藥性的產(chǎn)生，有效控制臨床并發(fā)癥及死亡率，顯著提高臨床治療效果。

［1］ 楊潤德.當(dāng)前豬病流行現(xiàn)狀及防控［J］.今日畜牧獸醫(yī)，2013（6）：11－12.

［2］ 施琛.直接藥敏試驗與常規(guī)藥敏試驗在臨床血液細菌鑒定與檢驗中的應(yīng)用價值研究［J］.臨床合理用藥，2013，6（40）：5－6.

［3］ 楊文祥，李新宇.營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)法對雞大腸桿菌的藥敏試驗［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2009（1）：42－43.

［4］ 陳光宏，賀曉龍.豬源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定與藥敏試驗［J］.畜牧與獸醫(yī)，2012，44（8）：70－71.

［5］ 貢聯(lián)兵，魏曉敬，洪波，等.543株病原菌耐藥分析［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2001，21（3）：37.

（責(zé)任編輯：盧福莊）

S854.5＋3

B

0528-9017（2014）08-1274-04

文獻著錄格式：劉躍生，潘陳苗，姚寧屏，等.直接肉湯藥敏試驗在豬病防治中的應(yīng)用［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（8）：1274－1277.

2014-06-04

鴨坦布蘇病毒及其抗體檢測技術(shù)及流行病學(xué)研究（2012AY1063）

劉躍生（1963－），副教授，從事動物微生物教學(xué)及獸醫(yī)臨床工作。E-mail：1239811191＠qq.com。