陳 琳，李 榮，劉 韜，姜子濤*

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

紫蘇油主要是由甘油三酸酯構(gòu)成的（含量＞99%以上）。且紫蘇油甘油三酸酯中亞麻酸含量很高，因此紫蘇油具有重要的保健作用和巨大的開發(fā)價(jià)值，可作為功能性食品、化妝品和藥品的基料加以開發(fā)[1-4]。目前，市售的紫蘇油分為冷榨和熱榨兩種。冷榨紫蘇油避免了傳統(tǒng)高溫加工過(guò)程對(duì)紫蘇油所產(chǎn)生的不利影響，最大限度的保留了紫蘇油甘油三酸酯中的各種不飽和脂肪酸和其他油溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生 物活性，大大提高了紫蘇油的 品質(zhì)[5]，備受廣大消費(fèi)者的喜愛和推崇。另外，冷榨紫蘇油一般不需要加添加劑就可以長(zhǎng)時(shí)間的保存，市場(chǎng)價(jià)值相對(duì)較高。而熱榨所獲得的紫蘇油在經(jīng)過(guò)多道精煉工序如水化脫膠、堿煉脫酸、吸附脫色和水蒸氣蒸餾脫臭提純處理后，盡管二者的質(zhì)量上有很大區(qū)別，但消費(fèi)者從感官上很難將之與冷榨紫蘇油區(qū)別開來(lái)。

目前，國(guó)內(nèi)外分析脂肪酸常用的方法是將其衍生化生成較易揮發(fā)的甲酯類化合物，然后用氣相色譜（gas chromatography，GC）法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[6]或高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測(cè)定[7]。但是衍生過(guò)程中易發(fā)生異構(gòu)化、氧化和分解等副反應(yīng)，而且很難保證脂肪酸衍生化完全。因此前兩種方法靈敏度偏低、穩(wěn)定性差、衍生重現(xiàn)性不夠理想[8]。另外，由于大多數(shù)脂肪酸在紫外區(qū)吸收非常弱，因此直接采用HPLC法測(cè)定脂肪酸時(shí)，靈敏度較低。近年來(lái)蒸發(fā)光檢測(cè)器（evaporative light-scattering detector，ELSD）技術(shù)已趨成熟，由于ELSD的響應(yīng)信號(hào)與樣品的光學(xué)特性無(wú)關(guān)，并適于梯度洗脫。因此，ELSD在糖類和脂類化合物的分析檢測(cè)中顯示出了紫外檢測(cè)器不可比擬的優(yōu)越性[9-11]。

本實(shí)驗(yàn)利用直接滴定法測(cè)定了冷、熱兩種壓榨工藝所獲得的紫蘇油的酸價(jià)，并首次利用HPLC-ELSD法對(duì)冷、熱榨紫蘇油甘油三酸酯中的脂肪酸組成成分進(jìn)行了定性和定量分析，為區(qū)別冷、熱榨紫蘇油以及對(duì)紫蘇油的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了一定的參考依據(jù)，同時(shí)也為紫蘇油的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同壓榨工藝紫蘇油樣品（冷榨油、熱榨油） 天津東方雷格工貿(mào)有限公司。

亞油酸、油酸（純度≥99%）標(biāo)準(zhǔn)品、亞麻酸（純度＞98%）標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；棕櫚酸和硬脂酸（純度＞99%）標(biāo)準(zhǔn)品 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；氫氧化鈉、氫氧化鉀、硫酸和酚酞 天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司；無(wú)水乙醇和乙醚 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；甲醇（色譜純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；冰乙酸 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；所用試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水均為娃哈哈純凈水，由杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

SSI 1500高效液相色譜儀（配備四元梯度泵）、ELSD2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 美國(guó)Alltech公司；FA1104N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；HSS-1（B）型恒溫浴槽 成都儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 紫蘇油酸價(jià)的測(cè)定

參照GB/T 5530—2005《動(dòng)植物油脂酸值和酸度測(cè)定》。

1.3.2 紫蘇油甘油三酸酯中脂肪酸組成的測(cè)定

1.3.2.1 脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測(cè)定

分別準(zhǔn)確稱取亞麻酸、亞油酸、油酸、棕櫚酸和硬脂酸0.158 5、0.102 0、0.171 0、0.161 5 g和0.112 5 g，均置于同一只250 mL容量瓶中，加入少許甲醇，在50 ℃水浴中溶解后取出，冷卻至室溫，用甲醇定容得到混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0、20.0 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別傾入50 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到不同質(zhì)量濃度的高級(jí)脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

依次吸取上述所配制的不同質(zhì)量濃度的脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作液各10 μL，在所提出的最佳色譜條件下進(jìn)樣分析。以HPLC-ELSD色譜圖中脂肪酸的峰面積A的對(duì)數(shù)lgA為縱坐標(biāo)，以脂肪酸的進(jìn)樣質(zhì)量濃度ρ的對(duì)數(shù)lgρ為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.3.2.2 紫蘇油的堿水解

取紫蘇油樣約0.1 g加入0.4 mL 40% NaOH水溶液及0.6 mL 95%乙醇，連接回流冷凝器，于60 ℃水浴中皂化30 min（至無(wú)油滴）。蒸去乙醇，加1 mL熱蒸餾水，混勻后用20%的硫酸調(diào)溶液pH值至3，此時(shí)溶液分為明顯的兩層：上層為透明的脂肪酸層，下層為酸性甘油液。用無(wú)水乙醚萃取3 次，每次用乙醚2 mL，合并醚層，并用氮?dú)獯蹈桑缓笥眉状既芙獠⒍ㄈ葜?00 mL，過(guò)0.45 μm微孔濾膜備用。

1.3.2.3 HPLC-ELSD分析條件

色譜柱：A l l t i m aTMC18柱（2 5 0 m m×4.6 mm，5 μm），柱溫：28 ℃，流動(dòng)相：A液為甲醇，B液為水（含1%乙酸）；梯度洗脫程序：90%A（保持5 min）然后10 min內(nèi)上升到95%A，然后流動(dòng)相保持該比例不變；流速：0.8 mL/min。ELSD參數(shù)：漂移管溫度70 ℃，載氣流速1.7 L/min。進(jìn)樣量：10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷、熱榨紫蘇油酸價(jià)

酸價(jià)是指中和1 g油脂中的游離脂肪酸所需要的氫氧化鉀的質(zhì)量（mg）。酸價(jià)越高，紫蘇油的品質(zhì)越差。經(jīng)檢測(cè)，冷、熱榨紫蘇油酸價(jià)分別為（0.54±0.013）、（1.53±0.032）mg/g。熱榨紫蘇油的酸價(jià)明顯高于冷榨紫蘇油的酸價(jià)。這說(shuō)明在熱榨紫蘇油甘油三酸酯更容易發(fā)生水解生成游離的脂肪酸，因而導(dǎo)致熱榨紫蘇油中游離脂肪酸含量增高，酸價(jià)上升。而冷榨紫蘇油甘油三酸酯中的不飽和脂肪酸沒有受到高溫的不利影響，避免了由于高溫所造成的不飽和雙鍵的氧化聚合或分解，并且保留了紫蘇籽中的其他脂溶性生物活性成分，在一定程度上提高了紫蘇油的穩(wěn)定性[12]。由此可以推斷，熱榨對(duì)紫蘇油的酸價(jià)影響較大，降低了紫蘇油的品質(zhì)。

2.2 紫蘇油甘油三酸酯中脂肪酸組成及含量的測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線與檢測(cè)限

表1給出了紫蘇油甘油三酸酯分子中所含的亞麻酸、亞油酸、油酸、棕櫚酸和硬脂酸5 種脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將最小質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液逐級(jí)稀釋，依次進(jìn)樣10 μL，以信噪比3 倍時(shí)對(duì)應(yīng)的每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸的質(zhì)量濃度為最低檢測(cè)限。從表1可以看出，所提出的方法線性范圍均較寬，在所擬定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，高級(jí)脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性良好，且紫蘇油中所含全部5 種脂肪酸的最低檢 測(cè)限均在0.12 μg/mL以下。

注：Y為峰面積；X為標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度/（mg/L）。

2.2.2 方法回收率

取相同的樣品2 份，其中一份作為基準(zhǔn)，另1 份分別加入一定量的亞麻酸、亞油酸、棕櫚酸、油酸和硬脂酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用方法1.3.2.3節(jié)進(jìn)樣分析，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2。由表2可見，紫蘇油中所含全部5 種高級(jí)脂肪酸的回收率為99.70%～101.11%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）介于0.44%～3.66%之間，說(shuō)明該所提出的方法回收率較高，精密度好。

表 2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The recoveries of spiked standards

2.2.3 冷、熱榨紫蘇油甘油三酸酯中脂肪酸含 量

分別對(duì)冷、熱榨紫蘇油甘油三酸酯水解后進(jìn)行了HPLC-ELSD分析，定性及定量地測(cè)定了紫蘇油樣品中的全部脂肪酸即亞麻酸、亞油酸、棕櫚酸、油酸和硬脂酸。冷、熱榨紫蘇油樣品及混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜分離結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，紫蘇油中存在的脂肪酸在30 min內(nèi)都得到了有效的分離，采用外標(biāo)法定量分析的結(jié)果見表3。測(cè)定結(jié)果表明， 冷、熱榨工藝所制得的紫蘇油中脂肪酸組成一致，但脂肪酸含量有一定的差異。冷、熱榨紫蘇油均以亞麻酸含量最高（冷榨58.96%，熱榨53.14%），其次為亞油酸和油酸。冷榨紫蘇油中亞麻酸和亞油酸含量顯著高于熱榨紫蘇油，棕櫚酸和油酸比熱榨紫蘇油略低，而硬脂酸含量二者幾乎相同。熱榨紫蘇油中5 種高級(jí)脂肪酸的含量為87.89%，而冷榨紫蘇油中其含量已達(dá)到95.09%。但冷、熱榨紫蘇油中不飽和脂肪酸含量有很大差異，熱榨油中不飽和脂肪酸含量81.83%，冷榨油高達(dá)89.21%。冷榨紫蘇油中不飽和脂肪酸的含量顯著高于熱榨紫蘇油，這是因?yàn)橛椭跓嵴ミ^(guò)程中經(jīng)過(guò)高溫等過(guò)程，使得甘油三酸酯的不飽和脂肪酸由于發(fā)生熱聚合和熱分解等反應(yīng)使其含量降低[13]。眾所周知，亞麻酸、亞油酸和油酸是人體所必需的不飽和脂肪酸[14-18]，具有降低膽固醇、調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防心腦血管疾病等作用，亞麻酸對(duì)視網(wǎng)膜還具有較高營(yíng)養(yǎng)生理作用[19]。因此，冷、熱榨紫蘇油均為優(yōu)良的保健食用油，尤其是冷榨的紫蘇油，具有重要的營(yíng)養(yǎng)保健作用和巨大的開發(fā)價(jià)值。

圖 1 熱榨紫蘇油（A）、冷榨紫蘇油（B）和5種脂肪酸混合標(biāo)樣（C）的HPLC色譜圖。Fig.1 HPLC chromatograms of hot-pressed perilla oil (A),cold-pressed perilla oil (B), and mixed standards of five fatty acids(C)

n=5）=5 Table 3 Fatty acid composition and contents of triglycerides in表 3 紫蘇油中甘油三酸酯的脂肪酸組分及其含量（Table 3 Fatty acid composition and contents of triglycerides in perilla oils ( ls (n = 5) = 5)%樣品 亞麻酸 亞油酸 棕櫚酸 油酸 硬脂酸熱榨紫蘇油 53.14±0.37 12.06±0.34 4.11±0.23 16.63±0.22 1.95±0.23冷榨紫蘇油 58.96±0.49 14.71±0.33 3.96±0.21 15.54±0.28 1.92±0.25

3 結(jié) 論

冷榨紫蘇油的酸價(jià)顯著低于熱榨紫蘇油，即游離脂肪酸較少，最大限度地保留了紫蘇原有的成分，油的新鮮度較高，品質(zhì)較好。采用HPLC-ELSD和梯度洗脫的方式使紫蘇油甘油三酸酯水解得到的亞麻酸、亞油酸、棕櫚酸、油酸和硬脂酸得到了有效地分離，冷榨紫蘇油甘油三酸酯水解得到的脂肪酸總量達(dá)95.09%，而熱榨油為87.89%。亞麻酸是對(duì)紫蘇油功能特性貢獻(xiàn)最大的不飽和脂肪酸[20]，冷榨紫蘇油甘油三酸酯中亞麻酸含量高達(dá)58.96%，顯著高于熱榨油甘油三酸酯中亞麻酸的含量53.14%。冷熱榨紫蘇油甘油三酸酯中不飽和脂肪酸含量也有很大差異，冷榨油甘油三酸酯中不飽和脂肪酸含量高達(dá)89.21%，而熱榨油甘油三酸酯中不飽和脂肪酸含量為81.83%。冷榨紫蘇油的品質(zhì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于熱榨紫蘇油。隨著國(guó)內(nèi)消費(fèi)市場(chǎng)對(duì)冷榨油脂產(chǎn)品的認(rèn)知和對(duì)冷榨油脂產(chǎn)品的及副產(chǎn)品的深度開發(fā)[2,21-25]，冷榨紫蘇油將比熱榨紫蘇油在紫蘇油深加工領(lǐng)域具有更廣泛的應(yīng)用前景。

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