石賢愛，裴世鋒，李向楠，朱秋享，葉小軍，樊海平

（1.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108；2.福建省醫(yī)療器械和醫(yī)藥技術(shù)重點實驗室，福建 福州 350002；3.福建省淡水水產(chǎn)研究所，福建 福州 350002）

硝基呋喃類藥物是一種廣譜抗生素，其中呋喃唑酮主要用于治療腸道感染和球蟲病[1-2]。呋喃唑酮在體內(nèi)迅速代謝，主要代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮（3-amino-2-oxazolidinone，AOZ）可與細(xì)胞膜蛋白質(zhì)結(jié)合成形成穩(wěn)定化合物而長期存在于體內(nèi)[3-4]。AOZ具有很強(qiáng)的“三致”作用，被視為呋喃唑酮殘留標(biāo)示物[5-6]。我國于2007年將硝基呋喃類藥物列為違禁藥物。

目前用于檢測AOZ的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[7]、液相色譜-紫外法[8]、液相色譜-質(zhì)譜法[9-10]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-12]等。其中，ELISA法具有成本低、靈敏度高、特異性好、操作簡便、適合高通量樣品篩選等優(yōu)點，成為現(xiàn)場快速檢測的首選[13-15]。

AOZ結(jié)構(gòu)中無芳香族化合物基團(tuán)，且分子質(zhì)量小，在體內(nèi)較難激活產(chǎn)生抗體，從而限制了基于半抗原AOZ的單克隆抗體免疫檢測試劑盒的開發(fā)[16]。目前研究者多采用先將AOZ與帶苯環(huán)的化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)生成衍生物后，再與蛋白質(zhì)進(jìn)行偶聯(lián)以制備人工抗原等，再獲得抗體用于檢測。如AOZ與2-硝基苯甲醛反應(yīng)生成3-（2-硝基苯亞甲基）-氨基-2-惡唑烷酮[17-18]、與4-羧基苯甲醛反應(yīng)生成3-（4-羧基苯亞甲基）-氨基-2-惡唑烷酮（3-{[(4-carboxyphenyl)methylene]-amino}-2-oxazolidinone，CPAOZ)[19-21]、與2,4-二硝基氟苯反應(yīng)生成3-（2,4-二硝基苯胺基）-2-惡唑烷酮[22]、或與順丁烯二酸酐反應(yīng)生成相應(yīng)的衍生物[23]等，這就需要先將被測樣品粉碎、除水、衍生化后，經(jīng)過提取、凈化等步驟后再進(jìn)行分析，過程繁瑣，檢測時間長，檢測精度受到限制。如德國R-Biopharm公司研發(fā)出AOZ酶聯(lián)免疫試劑盒需將AOZ衍生成3-（2-硝基苯亞甲基）-氨基-2-惡唑烷酮[4,24]；常超等[25]開發(fā)的方法需要將AOZ與苯甲醛衍生化成N-苯亞甲基-3-氨基-2-惡唑烷酮后進(jìn)行測定。鑒于衍生化過程的繁瑣與耗時，若要實現(xiàn)AOZ的直接現(xiàn)場快速檢測，制備基于非衍生化半抗原的呋喃唑酮代謝物的單克隆抗體是十分必要的。本實驗室經(jīng)過對完全抗原的制備方法及免疫等抗原抗體制備過程的優(yōu)化，利用戊二醛法成功制備了基于AOZ的完全抗原并獲得了具有高特異性的抗AOZ的單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上建立了酶聯(lián)免疫檢測試劑盒并應(yīng)用于實際樣品檢測，同時將其與外購的抗CPAOZ單克隆抗體建立的檢測試劑盒進(jìn)行了比較，開發(fā)了基于抗AOZ的單克隆抗體的免疫檢測試劑盒，證明了該試劑盒具有諸多優(yōu)勢且展示了良好的應(yīng)用前景。

1 1 材料與方法

1.1 材料與試劑

明蝦購于福州永輝超市。

CPAOZ單克隆抗體 杭州格朗瑞公司；AOZ單克隆抗體 自制；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記羊抗小鼠IgG 美國Thermo Fisher Scientific公司；四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB） 北京天根公司；呋喃西林 日本TCI公司；呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、氨基脲、AOZ 德國Dr. Ehrenstorfer公司；4-羧基苯甲醛（4-carboxybenzaldehyde，4-CBA）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 美國Sigma公司；卵白蛋白（ovalbumin，OVA） 美國Worthington公司；重組蛋白A瓊脂糖凝膠柱（rProtein A Sepharose） 廣州精達(dá)公司；Tween-20磷酸鹽緩沖液（modified D-PBS Tween-20，PBST） 美國Amresco公司；葡聚糖凝膠G-25（Sephadex G-25） 德國Pharmacia公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SH-1000全波長酶標(biāo)儀 日本Corona公司；BS224S電子天平 德國Sartorius公司；DKZ-1電熱恒溫振蕩水槽 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；1525高效液相色譜儀 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 AOZ-BSA單克隆抗體的制備

1.3.1.1 人工抗原的合成

稱取1.6 mg AOZ溶于0.1 mL甲醇中（A液）；用0.01 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）稀釋25%（V/V）的戊二醛至2.5%（B液）；將A緩慢加入B中，室溫振蕩反應(yīng)2 h后，加入到4 mL含35 mg BSA的PBS緩沖液中，于37 ℃振蕩反應(yīng)24 h。取出后于3 000 r/min離心10 min，得到AOZ-BSA偶聯(lián)產(chǎn)物。用OVA代替BSA制備檢測抗原。

1.3.1.2 偶聯(lián)物的液相色譜分析

色譜柱為G 5 0 0 0 P W X L凝膠色譜柱（30 cm×7.8 mm，10 μm）；二極管陣列檢測器；單通道檢測；波長278 nm（BSA的紫外特征吸收峰）；流動相為0.01 mol/L PBS；流速0.5 mL/min。

1.3.1.3 動物免疫

分別取3 只健康Balb/c小鼠，分別用3 種方法制備的免疫抗原進(jìn)行免疫。人工免疫抗原與等量弗氏完全佐劑（complete Freund’s adjuvant，CFA）混合，振蕩至完全乳化，腹腔注射至小鼠體內(nèi)。此后，每隔10 d人工免疫抗原與等量弗氏不完全佐劑（incomplete Freund’s adjuvant，IFA）混合，同上加強(qiáng)免疫1 次。每次免疫前對小鼠進(jìn)行尾部采血，用間接非競爭ELISA法測定抗血清的效價，直至抗血清效價大于5×104，進(jìn)行沖刺免疫，4 d后取小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。

1.3.1.4 腹水單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）的制備

雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)篩選和克隆化后，取小鼠腹腔注射液體石蠟0.5 mL，7 d后每只再注射3×106個雜交瘤細(xì)胞。當(dāng)小鼠腹部明顯膨大，即可用針頭采集腹水。4 ℃、3 000 r/min離心20 min，棄脂肪層和細(xì)胞層，收集中間澄清層，采用間接非競爭ELISA方法測定腹水中抗體效價，并將澄清層分裝，－20 ℃保存。

1.3.1.5 腹水mAb效價的測定

以AOZ-OVA包被酶標(biāo)板，采用間接非競爭ELISA法測定每只注射雜交瘤細(xì)胞的小鼠腹水mAb的效價。

1.3.1.6 單抗的分離純化

用結(jié)合緩沖液（0.1 mol/L PBS，pH 7.4）平衡rProtein A Sepharose柱，將腹水用結(jié)合緩沖液稀釋（大約1∶5），上柱，4 ℃孵育5 h后用PBS洗脫未結(jié)合蛋白質(zhì)至A=0，用洗脫緩沖液（0.05 mol/L Gly-HCl，pH 2.5）洗脫目的蛋白質(zhì)，分管收集后每管立即加入中和緩沖液（1.0 mol/L Tris-HCl，pH 10.5）調(diào)節(jié)pH值至中性，凍干后重新溶解后測定。

1.3.1.7 純化后mAb純度的鑒定

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳對純化后的單抗進(jìn)行純度鑒定。

1.3.2 間接競爭ELISA法操作步驟

包被：用0.1 mol/L pH 9.5碳酸鹽緩沖液稀釋檢測抗原至20 μg/mL，100 μL/孔，37 ℃反應(yīng)3 h。洗滌：傾去包被液，用含0.05% Tween-20的PBST緩沖液300 μL/孔洗滌3 次，4 min/次，扣干。封閉：每孔加入200 μL脫脂奶，37 ℃封閉2 h；傾去封閉液，洗滌3 次。加一抗：每孔加入100 μL用PBS稀釋成不同梯度的抗血清，37 ℃孵育2 h；傾去抗血清，洗滌3 次，扣干。加二抗：加入稀釋2 000 倍的山羊抗小鼠IgG-HRP，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h。傾去酶標(biāo)二抗，洗滌3 次，扣干。顯色：每孔加100 μL TMB，37 ℃避光反應(yīng)15 min；加入2 mol/L H2SO4，100 μL/孔以終止反應(yīng)。檢測：測定450 nm波長處的吸光度（A450nm）。結(jié)果判定：當(dāng)（A陽性血清－A空白對照）≥2.1×（A陰性血清－A空白對照）時的抗體稀釋倍數(shù)即為該抗體的效價。

1.3.3 ELISA試劑盒最佳工藝的確定

1.3.3.1 最佳包被質(zhì)量濃度與抗體工作質(zhì)量濃度的選擇

分別將CPAOZ-OVA和AOZ-OVA檢測抗原進(jìn)行倍比稀釋，使終質(zhì)量濃度分別為10、5、1、0.5、0.25 μg/mL，以100 μL/孔包被于酶標(biāo)板中，每個質(zhì)量濃度橫向包被8 個孔，4 ℃過夜；用脫脂牛奶37 ℃封閉3 h；將純化的腹水單抗分別作1 000、2 000、3 000、4 000、5 000倍稀釋，加入酶標(biāo)板中（每個稀釋度2豎排），其余步驟同間接ELISA方法。

1.3.3.2 一抗最佳反應(yīng)時間的確定

用1 μg/mL AOZ-OVA包被酶標(biāo)板，一抗稀釋5倍、稀釋20 倍、陰性血清（空白小鼠血清稀釋1 000倍）、空白（PBS）4 個梯度（均設(shè)3 個平行）。分別選擇37 ℃反應(yīng)15、30、60、120 min，二抗反應(yīng)1h，TMB顯色30 min。其余步驟同間接ELISA方法。測定450 nm波長處的吸光度，以I=（A1－A0）/（A2－A0）為最佳反應(yīng)時間評價指數(shù)，其中A1為稀釋5 倍時的吸光度，A2為稀釋20倍的吸光度，A0為陰性樣品的吸光度。

1.3.3.3 二抗最佳反應(yīng)時間的確定

經(jīng)包被、封閉后，選擇一抗的最佳反應(yīng)時間進(jìn)行反應(yīng)，一抗的梯度與1.3.3.2節(jié)中相同。分別設(shè)定二抗的反應(yīng)10、20、30、45、60 min。其余步驟同間接ELISA方法。

1.3.3.4 TMB顯色時間的確定

在最優(yōu)的包被抗原濃度、一抗反應(yīng)時間、二抗反應(yīng)時間條件下，分別設(shè)定顯色時間為加入TMB后37℃反應(yīng)5、10、15、20、25、30 min，其余步驟同上。

1.3.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

CPAOZ：先用100 μL的二甲基甲酰胺溶解CPAOZ，再用PBS稀釋為100 000、10 000、1 000、100、10、1 ng/mL 6 個質(zhì)量濃度，根據(jù)已經(jīng)建立的間接競爭ELISA方法進(jìn)行檢測，并繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

AOZ：取1 mg AOZ，用995 μL 10%（V/V）甲醇溶解后，加入5 μL戊醛溶液；振蕩均勻后，室溫放置30 min；再用PBS稀釋為1 000、400、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1、0.5、0.1、0.05 ng/mL 12 個質(zhì)量濃度。其他步驟同1.3.2節(jié)。

1.3.3.6 交叉反應(yīng)率的確定

取硝基呋喃類藥物呋喃西林（nitrofurazone，NFZ）、呋喃唑酮（furazolidone，F(xiàn)ZD）、呋喃它酮（furaltadone，F(xiàn)TD）、呋喃妥因（furadantin，F(xiàn)DT）、氨基脲（semicarbazide，SEM）和AOZ，使其質(zhì)量濃度分別為100 000、10 000、1 000、100、10、1 ng/mL，作為競爭物，參照1.3.2節(jié)進(jìn)行間接競爭ELISA，測定抗CPAOZ檢測方法的特異性。

分別取NFZ、FZD、FDT、FTD、SEM、CPAOZ，使其質(zhì)量濃度分別為100 000、10 000、1 000、100、10、1 ng/mL，作為競爭物，參照1.3.2節(jié)進(jìn)行間接競爭ELISA，測定抗AOZ檢測方法的特異性。

1.3.4 模擬樣品檢測

將明蝦分為5組，分別在AOZ質(zhì)量濃度為0.0、0.5、5.0、5.0、5.0 μg/mL條件下養(yǎng)殖30 h后，按下述方法處理。

1.3.4.1 樣品預(yù)處理

CPAOZ檢測樣品處理：將蝦去頭，脫殼后，放入組織絞碎器攪碎，稱取1 g，加入10 mL 0.2 mol/L HCl攪勻后，加入4-CBA溶液，渦旋混合1 min，置于37 ℃振蕩反應(yīng)12 h使衍生化完全；取出樣品，加入1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.5后，加入5 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩1 min，超聲萃取10 min，以1 000 r/min離心10 min后，小心吸出上層乙酸乙酯層，乙酸乙酯重復(fù)提取1 次，合并乙酸乙酯層；收集的乙酸乙酯層在40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干，用1 mL正己烷溶解干燥物；加入1 mL PBS緩沖液，3 000 r/min離心10 min，取50 μL下層液體進(jìn)行分析。

AOZ檢測樣品處理：稱取蝦的肌肉組織1 g，加入HCl和5 μL戊醛溶液，37 ℃放置12 h，其余步驟同上。

1.3.4.2 明蝦中呋喃唑酮代謝物間接競爭ELISA方法檢測

檢測時，將待測溶液用PBS稀釋到一定的濃度，采用間接競爭ELISA進(jìn)行檢測。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程及樣品競爭抑制率，求出AOZ的含量。

1.3.5 明蝦加標(biāo)回收率測定

取空白蝦組織樣品1.0 g，加入1.0 mg AOZ標(biāo)準(zhǔn)品，采用1.3.4.1節(jié)中的樣品處理方法提取凈化，得到待測液。將待測液分別稀釋成5、10、40 ng/mL 3 個質(zhì)量濃度，每個質(zhì)量濃度分別檢測3 次，計算回收率和變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AOZ人工抗原的制備與鑒定

戊二醛兩端均帶有醛基，可分別與含氨基的化合物（如AOZ）和蛋白質(zhì)反應(yīng)形成共價連接。這種連接不僅僅限于戊二醛與AOZ的氨基及BSA的氨基之間，也可能發(fā)生在AOZ與AOZ之間、BSA與BSA之間，甚至可能發(fā)生在BSA自身的2 個氨基之間。為盡量減少戊二醛的無效連接，在制備AOZ抗原的過程中，戊二醛需要保持過量于AOZ和BSA。因此先將AOZ與過量的戊二醛反應(yīng)一段時間后，再加入BSA，這樣可與避免不需要的連接出現(xiàn)。

2.1.1 偶聯(lián)物的液相色譜分析

通過戊二醛法制備AOZ-BSA人工抗原，經(jīng)G-25柱層析分離純化后，對AOZ-BSA偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行液相色譜分析，結(jié)果如圖1所示。偶聯(lián)之后的產(chǎn)物的出峰時間為18.266 min，而BSA的出峰時間卻為19.468 min，說明偶聯(lián)成功。

圖 1 AOZ與BSA偶聯(lián)前（A）、后（B）的氣相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of AOZ (A)(A) and AOZ-BSA (B)(B)

圖 2 AOZ與BSA偶聯(lián)前后紫外圖譜Fig.2 UV absorption spectra of AOZ, BSA and AOZ-BSA

由圖2可知，AOZ在200～400 nm波長范圍內(nèi)無特征吸收峰，戊二醛的特征吸收峰出現(xiàn)在233 nm波長處，BSA在278 nm波長處也存在一定的紫外吸收。而AOZBSA在266.5 nm波長處出現(xiàn)一特征吸收峰，與AOZ、BSA和戊二醛的特征吸收峰出現(xiàn)的位置均不同，進(jìn)一步證明偶聯(lián)成功。

2.1.3 偶聯(lián)物的紅外分析

圖 3 AOZ-BSA偶聯(lián)前后紅外圖譜Fig.3 IR absorption spectra of BSA and AOZ-BSA

如圖3所示，在1 5 0 0～1 7 0 0 c m-1區(qū)域以及2 800～3 400 cm-1區(qū)域內(nèi)，二者有著類似的吸收峰，這是由其中酰胺基和胺基伸縮所形成的特征吸收峰，說明戊二醛法的偶聯(lián)是成功的。

2.2 AOZ-BSA單克隆抗體的制備

2.2.1 AOZ-BSA抗原免疫小鼠產(chǎn)生抗體

將制備得到的完全抗原用于小鼠免疫，五免后獲得的多抗的最高效價為1∶24 000，繼續(xù)對小鼠進(jìn)行免疫，直至抗體效價達(dá)到1∶5×104后，進(jìn)行細(xì)胞融合。

2.2.2 抗AOZ抗體的特異性

對多抗血清進(jìn)行特異性研究，擬合得到的AOZ競爭抑制曲線方程為y=17.66x－3.012（R2=0.989），抗血清的IC50達(dá)1 μg/mL，表明戊二醛偶聯(lián)產(chǎn)生的多抗對AOZ的特異性十分顯著。由此可以推斷，戊二醛作為連接載體蛋白與AOZ的臂參與到小鼠的免疫環(huán)節(jié)，并且由于戊二醛所接引出來的長鏈可以有效地將AOZ的結(jié)構(gòu)與載體蛋白相分開，使之成功地暴露于小鼠的免疫系統(tǒng)中，故戊二醛法合成AOZ人工抗原所產(chǎn)生的小鼠抗體其特異性十分顯著。

2.2.3 雜交瘤細(xì)胞的篩選

將AOZ-BSA人工抗原免疫得到的小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合。以SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)的上清液作陰性對照，陽性的鼠血清作陽性對照，采用間接非競爭ELISA法對雜交瘤細(xì)胞上清進(jìn)行檢測。選擇陽性較強(qiáng)的單克隆細(xì)胞孔內(nèi)的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化。采用間接競爭ELISA法測定細(xì)胞上清的特異性，選擇特異性強(qiáng)的孔中的細(xì)胞進(jìn)行克隆化。重復(fù)上述步驟，直至得到穩(wěn)定分泌抗AOZ的雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)過一次克隆化后，陽性克隆采用有限倍比稀釋法進(jìn)行亞克隆，直至全陽性。經(jīng)過4 次克隆篩選到2株能穩(wěn)定分泌抗AOZ單克隆抗體的細(xì)胞株，命名為Z4-C5和Z4-H1。

2.2.4 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液mAb效價、亞類分析及特異性分析

以骨髓瘤細(xì)胞上清液為空白對照、空白小鼠血清為陰性對照。采用間接ELISA法測定雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清液mAb效價，測得Z4-C5的效價為1∶781，Z4-H1的效價為1∶543。

使用不同類別及亞類的HRP-羊抗小鼠的二抗，采用間接非競爭ELISA測定單抗的類別及亞類。結(jié)果表明，Z4-C5和Z4-H1均屬IgG2a。

采用間接競爭ELISA對雜交瘤細(xì)胞上清液中mAb進(jìn)行特異性測定，結(jié)果表明Z4-C5和Z4-H1分別對CPAOZ和AOZ有良好的競爭反應(yīng)，說明抗體的特異性良好，可以進(jìn)行抗體的制備。

2.2.5 單克隆抗體的制備及純化

細(xì)胞株Z4-C3和Z4-H1分泌的腹水mAb效價分別達(dá)到1∶9.7×103和1∶3.5×104。

Z4-C5 mAb和Z4-H1 mAb純化后的聚丙烯酰氨凝膠電泳圖中均有2條帶，一條為IgG的重鏈，分子質(zhì)量約55 ku左右，另一條為輕鏈，分子質(zhì)量約26 ku左右。

2.3 抗原質(zhì)量濃度和抗體稀釋度優(yōu)化

檢測抗原和單抗的濃度是ELISA測定方法中的重要影響因素，只有合適的檢測抗原濃度和單抗?jié)舛炔拍塬@得較好的靈敏度。

由間接非競爭ELISA測定的方陣實驗結(jié)果可知，CPAOZ-OVA最佳抗原工作質(zhì)量濃度為1 μg/mL，在此包被濃度下，抗體稀釋倍數(shù)在1∶2 000時吸光度在1.0附近，故選擇1∶2 000作為抗體最佳稀釋倍數(shù)。而AOZ-OVA蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為1 μg/mL，抗體稀釋3 000倍時，吸光度為1.072 8，抗原抗體達(dá)到最佳的配比。

2.4 一抗最佳反應(yīng)時間的確定

在實驗條件下，稀釋1 000 倍的陰性小鼠血清的吸光度在15、30、60、120 min時吸光度分別為1.39、1.70、1.55、1.37。其中30 min時吸光度最高，且空白對照值低。因此一抗最佳反應(yīng)時間為30 min。

2.5 二抗最佳反應(yīng)時間的確定

由于10 min時二抗結(jié)合不穩(wěn)定，PBST洗滌時很容易把與一抗結(jié)合不緊密的二抗洗掉，導(dǎo)致吸光度偏低。20、30、40 min吸光度比較穩(wěn)定，相差不超過0.2，在這3 個時間段中，反應(yīng)20 min的吸光度最高。隨著二抗反應(yīng)時間的加長，吸光度不斷升高。60 min時達(dá)到最高值，但比較吸光度，20 min時依然最高，因此二抗反應(yīng)最佳時間為20 min。

2.6 TMB顯色時間的確定

抗體稀釋5倍時，30 min時吸光度最高，為2.03；從5 min到15 min，隨著顯色時間的延長，吸光度也出現(xiàn)了較大幅度的增加，從1.29增加到1.74，15 min時增加到1.95。相對增加值分別為0.45、0.21、0.08。因此，從快速檢測的角度來考慮，選擇15 min即可。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

CPAOZ質(zhì)量濃度在1.0～100 ng/mL時，間接競爭ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)方程為：y=44.46x－1.748（R2=0.991），計算可知IC50值為14.6 ng/mL。AOZ在0.5～12.5 ng/mL之間有很好的線性關(guān)系，擬合方程為y=50.15x－130.1（R2=0.989），有較好的擬合效果，IC50值為3.9 ng/mL。

2.8 基于不同半抗原建立的間接競爭ELISA方法的特性

2.8.1 檢測限

挑選6 個1 ng/mL以下的AOZ質(zhì)量濃度值做間接競爭ELISA零標(biāo)準(zhǔn)實驗。檢測限為0.3452，相應(yīng)的抑制率為34.52%。對應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)曲線上CPAOZ的質(zhì)量濃度為6.56 ng/mL，即檢測限為6.56 ng/mL。采用相同的方法得到基于AOZ單抗檢測方法的檢測限為0.45 ng/mL。

2.8.2 交叉反應(yīng)分析

圖 4 CPAOZ mAb（A）和AOZ mAb（B）單抗與其他化合物的交叉反應(yīng)Fig.4 Cross-reactivity of CPAOZ mAb (A) and AOZ mAb (B) with other compounds

從圖4可以看出，抗CPAOZ單抗與NFZ、FTD、FDT、AOZ、SEM均不存在競爭，與FZD有輕微的交叉，但交叉反應(yīng)率＜0.001%，說明抗CPAOZ單抗具有很高的特異性。

同樣，從圖4可以看出，抗AOZ單抗與6 種類似物的IC50值均大于100 μg/mL，可以視為不存在交叉，因此戊二醛法制備的單克隆抗體具有很好的特異性。

2.8.3 明蝦樣品中呋喃唑酮代謝物含量測定

從預(yù)先經(jīng)過AOZ處理的明蝦樣品1～5的肌肉中按照1.3.4.1節(jié)提取、間接競爭ELISA方法檢測代謝物的質(zhì)量濃度，每個樣品重復(fù)測定3 次。從表1可以看出，未用FZD處理的樣品1中的未檢測到AOZ，其他經(jīng)過FZD處理的樣品均能檢測到AOZ的存在，所建立的ELISA方法檢測的變異系數(shù)在1.72%～6.99%。因此所建立的ELISA檢測AOZ的方法具有較高的準(zhǔn)確度、變異系數(shù)低、重復(fù)性好。

表 1 樣品中AOZ含量的測定Table 1 Results of repeated determinations of AOZ in five different shrimp samples

2.8.4 樣品加標(biāo)回收率

采用1.3.5節(jié)所述方法測定樣品的AOZ含量，抗CPAOZ單克隆抗體建立的檢測試劑盒測定樣品的回收率為97.6%～101.3%，而采用抗AOZ的單克隆抗體建立的檢測試劑盒測定樣品的回收率為94.1%～97.4%，兩者均具有較高的回收率（表2）。

表 2 明蝦樣品中CPAOZ回收率測定Table 2 Recovery of CPAOZ from spiked shrimp samplesTable 2 Recovery of CPAOZ from spiked shrimp samples

2.9 2 種ELISA檢測試劑盒的比較

外購和實驗室制備的2 種單抗所建立快速檢測AOZ的ELISA試劑盒均具有可行性，2 種單抗均具有良好的特異性和親和力。但從抗原的制備、細(xì)胞株的篩選、抗體性能、樣品檢測及回收率等各方面來考慮，采用戊二醛法合成人工抗原、建立基于AOZ的免疫檢測方法優(yōu)于CPAOZ。

表 3 2種檢測試劑盒的比較Table 3 Comparison of the two ELISA kits

3 結(jié) 論

本研究采用戊二醛法合成了AOZ-BSA人工抗原，免疫小鼠后產(chǎn)生特異性抗體，五免后小鼠抗血清的IC50為1 μg/mL。將小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，通過有限稀釋法克隆化，篩選出2株能穩(wěn)定分泌抗AOZBSA單抗的雜交瘤細(xì)胞株Z4-C5和Z4-H1，所分泌的抗體均屬IgG2a，且通過動物體內(nèi)法制備的腹水效價分別為1∶7.8×104和1∶3.5×104，單抗重鏈的分子質(zhì)量約55 ku，輕鏈約為26 ku。

基于抗CPAOZ單抗的間接競爭ELISA檢測方法的檢測抗原工作質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL，一抗稀釋倍數(shù)為1∶2 000。在CPAOZ質(zhì)量濃度為1.0～100.0 ng/mL時有較好的線性關(guān)系，IC50值為14.6 ng/mL，檢測限為6.56 ng/mL，與其他結(jié)構(gòu)相似物不存在交叉反應(yīng)。

基于抗AOZ單抗建立間接競爭ELISA檢測方法的抗原工作質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL，最佳的抗體稀釋倍數(shù)為1∶3 000。在AOZ質(zhì)量濃度為0.5～12.5 ng/mL時有較好的線性關(guān)系，IC50值為3.9 ng/mL，檢測限為0.45 ng/mL，與其他結(jié)構(gòu)相似物不存在交叉反應(yīng)。

用C PA O Z E L I S A檢測方法測定5個模擬樣品中的CPAOZ含量。ELISA檢測法的變異系數(shù)為1.72%～6.99%。在加標(biāo)回收率實驗中，CPAOZ檢測方法的回收率為97.6%～101.3%，AOZ檢測方法的回收率為94.1%～97.4%，表明本工作建立的ELISA方法具有較高的準(zhǔn)確度。對2 種ELISA檢測試劑盒的制備過程及特性進(jìn)行了比較，從制備的難易程度、使用的方便性和經(jīng)濟(jì)上綜合考慮，認(rèn)為后者優(yōu)于前者。

[1]生威, 李季, 許艇, 等. 動物性產(chǎn)品中硝基呋喃類抗生素殘留檢測方法研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2006, 25(增刊): 429-434.

[2]葛寶坤, 王云鳳, 賀信, 等. 高效液相色譜法測定雞肉、水產(chǎn)品中呋喃西林和呋喃哩酮殘留量的研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2002,12(6): 661-662.

[3]王習(xí)達(dá), 陳輝, 吳光紅, 等. 水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物殘留的檢測與控制[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2007, 36(18): 152-154.

[4]COOPER K M, CADDELL A, ELLIOTT C T, et al. Production and characterization of polyclonal antibodies to a derivative of 3-amino-2-oxazolidinone, a metabolite of the nitro furan furazolidone[J].Analytica Chimica Acta, 2004, 520(1): 79-86.

[5]AURO A, SUMANO H, OCAMPO L, et al. Evaluation of the carcinogenic effects of furazolidone and its metabolites in two fish species[J]. The Pharmacogenomics Journal, 2004, 4(1): 24-28.

[6]司紅彬, 梁軍. 硝基呋喃類藥物的殘留檢測: 上[J]. 獸醫(yī)導(dǎo)刊, 2007,7(9): 48-49.

[7]CHENG C C, HSIEH K H, LEI Y C, et al. Development and residue screening of the furazolidone metabolite, 3-amino-2-oxazolidinone(AOZ), in cultured fi sh by an enzyme-linked immunosorbent assay[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(13): 5687-5692.

[8]CHUMANEE S, SUTTHIVAIYAKIT S, SUTTHIVAIYAKIT P.New reagent for trace determination of protein-bound metabolites of nitrofurans in shrimp using liquid chromatography with diode array detector[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(5):1752-1759.

[9]?NIEGOCKI T, ?MUDZKI J, POSYNIAK A. Determination of nitrofuran metabolites in the poultry muscle and eggs by LC-MS[J].Folia, 2012, 56(Suppl I): 48-50.

[10]BOGIALLI S, di CORCIA A. Recent applications of liquid chromatography-mass spectrometry to residue analysis of antimicrobials in food of animal origin[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2009, 395(4): 947-966.

[11]劉永濤, 艾曉輝, 索紋紋, 等. 呋喃唑酮代謝物AOZ在斑點叉尾(鲴)體內(nèi)組織分布與消除規(guī)律研究[J]. 淡水漁業(yè), 2012, 42(5): 38-43.

[12]尹江偉, 劉紅河, 劉桂華, 等. HPLC-MS/MS法測定水產(chǎn)品中硝基呋喃類化合物代謝物[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2007, 17(12): 2141-2143.

[13]VASS M, DIBLIKOVA I, CERNOCH I, et al. ELISA for semicarbazide and its application for screening in food contamination[J]. Analytica Chimica Acta, 2008, 608(1): 86-94.

[14]DIBLIKOVA I, COOPER K M, KENNEDY D G, et al. Monoclonal antibody-based ELISA for the quantif i cation of nitrofuran metabolite 3-amino-2-oxazolidinone in tissues using a simplified sample preparation[J]. Analytica Chimica Acta, 2005, 540(2): 285-292.

[15]沈美芳, 宋紅波, 耿雪冰, 等. 酶聯(lián)免疫法測定水產(chǎn)品中呋喃唑酮代謝物AOZ的殘留[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2006, 30(4): 520-524.

[16]KRONGPONG L, FUTAM K. Application of ELISA-based kit for detecting AOZ and determining its clearance in eel tissues[J]. Fisheries Science, 2008, 74(5): 1055-1061.

[17]李敏, 何小維. 間接競爭ELISA法檢測呋喃唑酮代謝物[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2012, 28(4): 476-479.

[18]柳愛春, 劉超, 趙蕓, 等. 免疫膠體金法快速檢測水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2013, 25(1): 95-102.

[19]常超, 伍金娥, 袁宗輝. 呋喃唑酮殘留標(biāo)示物人工抗原合成與抗體制備[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(12): 444-448.

[20]ZHU H P, LIU T T, LIU B, et al. Antigens synthesis and antibodies preparation for furazolidone and its metabolite 3-amino-2-oxazolidinone[J]. Chinese Chemical Letters, 2010, 21(9): 1049-1052.

[21]柳愛春, 劉超, 桑麗雅, 等. 硝基呋喃類代謝物抗原合成及在膠體金試紙條上的應(yīng)用[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2012(23): 265-267.

[22]李麗華, 徐振林, 孫遠(yuǎn)明, 等. 3-氨基-2-噁唑烷酮半抗原、人工抗原的合成及鑒定[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(2): 49-51.

[23]SHEN Y D, WANG Y, ZHANG S W. Design and efficient synthesis of novel haptens and complete antigens for the AOZ, a toxic metabolite of furazolidone[J]. Chinese Chemical Letters, 2007, 18(8): 1490-1492.

[24]YIBAR A, CETINKAYA F, SOYUTEMIZ G E. Nitrofuran metabolite 3-amino-2-oxazolidinone residues in chicken liver: a screening study[J]. Asian Journal of Animal and Veterinary Advances, 2012,7(4): 346-350.

[25]常超, 伍金娥, 袁宗輝. 免疫化學(xué)方法測定動物組織中呋喃唑酮殘留標(biāo)示物[J]. 分析化學(xué), 2009, 37(4): 527-531.