翁文霞，張金金，黃幼生，薛逢貴，羅志飛，佘梓宏，解娜

（海南醫(yī)學(xué)院病理教研室海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，海南?？?70102）

·臨床病理·

四跨膜蛋白CD151在胃癌組織中表達(dá)的臨床意義

翁文霞，張金金，黃幼生，薛逢貴，羅志飛，佘梓宏，解娜

（海南醫(yī)學(xué)院病理教研室海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，海南?？?70102）

目的 探討四跨膜蛋白CD151過(guò)表達(dá)與胃癌進(jìn)展的關(guān)系。方法收集胃癌組織蠟塊及手術(shù)標(biāo)本，應(yīng)用免疫組化SP法及RT-PCR的方法檢測(cè)CD151在胃癌組織中的表達(dá)情況。結(jié)果CD151在胃癌組織、腸化生、修復(fù)性胃黏膜上皮中表達(dá)；CD151在腸型胃癌組織中的表達(dá)明顯高于彌漫型胃癌(28/52 vs 25/71，P=0.045)；在發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，CD151的表達(dá)強(qiáng)度高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌組織(12/42 vs 41/81，P=0.022)；在Ⅲ、Ⅳ期胃癌組織中的表達(dá)要強(qiáng)于Ⅰ、Ⅱ期胃癌(22/64 vs 31/59，P=0.047)。與年齡、性別、部位沒(méi)有明顯關(guān)系(P＞0.05)。結(jié)論CD151在胃癌組織中過(guò)表達(dá)，與胃癌的Lauren分型、轉(zhuǎn)移及分期相關(guān)。

胃癌；CD151；轉(zhuǎn)移；分期

胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，絕大多數(shù)胃癌患者的死亡與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)，抑制胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)是提高患者生存率的重要途徑，研究胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的分子機(jī)制對(duì)判斷胃癌預(yù)后具有重要意義[1]。

CD151是四跨膜蛋白超家族(TM4SF)的重要成員之一，在人體細(xì)胞中廣泛表達(dá)，包括上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、雪旺氏細(xì)胞、血小板等。其功能廣泛，如調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和粘附等[2]。目前已經(jīng)證實(shí)CD151與前列腺癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌、肝癌等轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)[3-6]，CD151在腫瘤組織中表達(dá)越高，患者腫瘤的轉(zhuǎn)移率越高，預(yù)后越差，有學(xué)者認(rèn)為其可作為腫瘤預(yù)后的一新指標(biāo)[3-7]。

目前已經(jīng)證實(shí)CD151在胃癌組織中存在過(guò)表達(dá)，部分學(xué)者認(rèn)為CD151過(guò)表達(dá)可能與胃癌的轉(zhuǎn)移、分化、TNM分期相關(guān)[8-9]。文獻(xiàn)報(bào)道中的數(shù)據(jù)部分不一致[10]，為進(jìn)一步證實(shí)CD151表達(dá)與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，我們擴(kuò)大胃癌標(biāo)本量，從基因及蛋白水平上進(jìn)一步驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料收集海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2008-2013年檔存胃癌及其配對(duì)正常胃黏膜組織蠟塊123例(其中30例含胃癌轉(zhuǎn)移灶，15例含有新鮮胃癌及其配對(duì)組織)，均為胃大部或全切手術(shù)標(biāo)本，有完整病史資料，具體信息見(jiàn)表1。所有病例均經(jīng)病理確診，顯微鏡下選擇有代表性的區(qū)域進(jìn)行標(biāo)記、取材、制作芯片。

1.2 試劑CD151多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，PV-9000通用型二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒、3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液均為福州邁新生物有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)SP方法切片常規(guī)脫蠟、水化后30%H2O2-甲醇封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶5 min，(pH 6.0)高壓修復(fù)10 min，一抗4℃冰箱過(guò)夜，第2天切片恢復(fù)室溫后二抗室溫各孵育20 min，DAB顯色，蘇木精襯染。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3.2 組織芯片制作根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究的目的和需要，受體蠟塊設(shè)計(jì)為18×12點(diǎn)陣。光鏡下選擇HE標(biāo)本中適宜的樣本位置，對(duì)照相應(yīng)的供體蠟塊，每個(gè)標(biāo)本取兩點(diǎn)。把各組樣本的點(diǎn)陣按順序排放，設(shè)陣列孔的左上方第一排第一個(gè)孔為空白標(biāo)記，以免混淆方向。320個(gè)蠟塊制作成4個(gè)組織芯片。組織芯片制作具體操作步驟見(jiàn)應(yīng)用文獻(xiàn)[11]。

1.4 結(jié)果判定免疫組織化學(xué)陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕褐色顆粒狀，位于細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)，采用半定量積分法判定結(jié)果：顯色度按細(xì)胞著色深淺計(jì)分(0分基本無(wú)著色；1分淺黃；2分淺棕色；3分為深棕色)。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分；陽(yáng)性細(xì)胞＜20%為1分；陽(yáng)性細(xì)胞20%～50%為2分；陽(yáng)性細(xì)胞＞50%～75%為3分；陽(yáng)性細(xì)胞＞75%以上為4分。兩種分值相乘若＞3，則為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。芯片中每例二個(gè)點(diǎn)陣取平均值記為該例分值。

1.5 RT-PCR檢測(cè)組織總RNA提取參照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作；CD151引物由Primer 6.0引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，選擇最佳引物，引物序列為5'-ATGGGTGAGTTCAACGAGAAG-3'(上游引物)，5'-TCAGTAGTGCTC CAGCTTGAG-3'(下游引物)；選取GAPDH基因作為內(nèi)參照基因，引物序列5'-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3'(上游引物)，5'-GTAGAGGCAGGGATGATG TTC-3'(下游引物)。反應(yīng)體系參照二步法反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)，PCR產(chǎn)物電泳后經(jīng)凝膠圖像分析儀進(jìn)行積分吸光度分析并攝像。反應(yīng)條件為：94℃45 s，53℃40 s，72℃45 s，30個(gè)循環(huán)，最后一次循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下分析PCR結(jié)果。拍照后用圖像分析儀分析目的帶和GAPDH的灰度，并計(jì)算兩者的比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS18.0軟件，臨床病理參數(shù)間的比較采用四格表χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率計(jì)算；各因素相關(guān)關(guān)系，采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)α值等于0.05。

2 結(jié)果

2.1 CD151在胃癌組織中的表達(dá)情況免疫組化染色顯示CD151在正常胃黏膜組織中局灶陽(yáng)性表達(dá)，修復(fù)性上皮表達(dá)較強(qiáng)；82.1%(101/123)胃癌組織CD151陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率明顯高于配對(duì)胃黏膜組織(56/123，P＜0.01)；腸型胃癌組織100%(52/52)陽(yáng)性表達(dá)，53.8% (28/52)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，明顯高于彌漫型胃癌組織(69.0%陽(yáng)性表達(dá)，39%強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，P=0.045)。CD151在胃癌組織中的具體表達(dá)情況見(jiàn)表1及圖1。RT-PCR顯示，在胃癌組織中CD151mRNA擴(kuò)增強(qiáng)度明顯高于配對(duì)正常胃黏膜組織(P＜0.01)，見(jiàn)圖2。

表1 CD151在胃癌組織中的表達(dá)情況（例）

2.2 CD151表達(dá)與胃癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系CD151未轉(zhuǎn)移胃癌組織強(qiáng)表達(dá)率為28.6%(12/42)，在轉(zhuǎn)移的癌組織中強(qiáng)表達(dá)率為50.6%(41/80)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022)。原發(fā)灶呈弱表達(dá)CD151的胃癌組織中，在轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)明顯增強(qiáng)；個(gè)別彌漫性胃癌組織，原發(fā)灶CD151表達(dá)缺失，但在轉(zhuǎn)移灶中呈弱或中等強(qiáng)度的陽(yáng)性(見(jiàn)表1及圖3)。

圖1 CD151在胃癌組織中的表達(dá)

圖2 CD151在胃癌組織中表達(dá)的瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 CD151在轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)

2.3 CD151表達(dá)與胃癌分期的關(guān)系CD151的表達(dá)隨胃癌的進(jìn)展表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在Ⅲ、Ⅳ期胃癌組織中的表達(dá)要明顯強(qiáng)于Ⅰ、Ⅱ期胃癌(22/64 vs 31/59，P=0.047)。

3 討論

四跨膜蛋白超家族(TM4SF)是近年來(lái)被廣泛研究的一個(gè)跨膜蛋白家族，在人體細(xì)胞中廣泛表達(dá)。這個(gè)家族的成員參與細(xì)胞表面分子之間的連接信號(hào)傳導(dǎo)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、激活以及細(xì)胞粘附活力中起重要作用。研究證明，TM4SF家族在腫瘤的生長(zhǎng)、遷移及血管生成中起重要的作用[2，7]。迄今為止，該家族已檢測(cè)出30多個(gè)成員，其中絕大多數(shù)被認(rèn)為是抑癌基因，例如CD9、CD82。它們的產(chǎn)物與腫瘤發(fā)展、預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。

研究表明，CD151是TM4SF超家族中唯一的癌基因，在人類多種腫瘤細(xì)胞表面均有較高水平的表達(dá)，與腫瘤的組織分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[7]，與惡性腫瘤的預(yù)后、進(jìn)展、治療等有密切的關(guān)系；隨著癌的進(jìn)展，CD151的表達(dá)增加，患者預(yù)后變差[2-7]。并且研究證實(shí)，CD151對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的移行及微血管形成起促進(jìn)作用，在血管生成及重塑中起關(guān)鍵作用，有利于腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移[12]，CD151與腫瘤發(fā)展呈正相關(guān)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移，在腫瘤惡性進(jìn)展中起著重要的作用。

部分研究顯示，CD151在胃癌組織中也存在著高表達(dá)。國(guó)內(nèi)的研究顯示，CD151過(guò)表達(dá)與腫瘤的分化、分期等密切相關(guān)，認(rèn)為腫瘤分化越低，CD151表達(dá)越高[8-9]。最近，Sang等[10]的研究顯示，在胃癌組織中CD151的過(guò)表達(dá)與胃癌的Lauren分類及進(jìn)展相關(guān)，他們的數(shù)據(jù)顯示CD151的過(guò)表達(dá)與胃癌的分化相關(guān)，但不是正相關(guān)，而是負(fù)相關(guān)。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示CD151在胃癌組織中的高表達(dá)與胃癌的分期、轉(zhuǎn)移相關(guān)；我們發(fā)現(xiàn)CD151的表達(dá)隨分化程度的降低而表達(dá)減少，在彌漫性胃癌中表達(dá)要低于腸型胃癌。有意思的是我們實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在腸化的胃黏膜腺體呈現(xiàn)CD151的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，這點(diǎn)可能預(yù)示CD151的過(guò)表達(dá)與腸型胃癌的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。

出現(xiàn)結(jié)果的不一致性可能與研究者選用的抗體型號(hào)、技術(shù)方法、標(biāo)本量等有關(guān)。為避免相類似情況的出現(xiàn)，我們采用組織芯片技術(shù)、自動(dòng)免疫組化、大樣本、不同公司抗體進(jìn)行本次實(shí)驗(yàn)。

組織芯片技術(shù)與傳統(tǒng)的病理學(xué)技術(shù)方法相比，有高通量、高效性的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)組織芯片因其體積小，采用同一標(biāo)準(zhǔn)選材、操作和判定結(jié)果，所得結(jié)果均一可靠，實(shí)驗(yàn)誤差小[11]。本次實(shí)驗(yàn)，組織芯片中的石蠟組織都處在相同條件、同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，把實(shí)驗(yàn)誤差控制在最小。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果多次重復(fù)進(jìn)行，采用不同公司CD151抗體進(jìn)行染色，結(jié)果顯示，除個(gè)別病例陽(yáng)性程度出現(xiàn)表達(dá)的偏差，絕大多數(shù)結(jié)果一致。

綜上所述，我們認(rèn)為CD151在胃癌組織中存在過(guò)表達(dá)，在腸型胃癌及TNM分期Ⅲ、Ⅳ期胃癌組織中表達(dá)增強(qiáng)，與胃癌的轉(zhuǎn)移、TNM分期、lauren分型相關(guān)。

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R735.2

B

1003—6350（2014）21—3245—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.21.1273

2014-06-03)

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81260321)；海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：811206)；國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新項(xiàng)目及海南省大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(編號(hào)：201211810076，HYCX201104)

黃幼生。E-mail：hys768811@163.com