王風(fēng)芹，劉亞瓊，張瑞，汪媛媛，謝慧，宋安東

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點實驗室，河南 鄭州 450002

能源問題是當(dāng)今世界面臨的關(guān)系國家安全和社會經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的焦點，纖維乙醇因其原料來源廣泛、清潔、可再生的特點被認(rèn)為是21世紀(jì)發(fā)展循環(huán)經(jīng)濟(jì)的有效途徑[1-2]。纖維乙醇同步糖化發(fā)酵 (Simultaneous saccharification and fermentation，SSF) 將木質(zhì)纖維素水解與乙醇發(fā)酵同步進(jìn)行，理論上可解除水解得到的葡萄糖等產(chǎn)物對纖維素酶的反饋抑制，提高酶解效率，縮短發(fā)酵周期，降低生產(chǎn)成本[3]。然而傳統(tǒng)乙醇發(fā)酵菌株的最適發(fā)酵溫度在28?32 ℃之間，一般不超過35 ℃[4]，而木質(zhì)纖維素的最適糖化溫度為 45?50 ℃，發(fā)酵溫度與糖化溫度不協(xié)調(diào)是限制 SSF順利進(jìn)行的關(guān)鍵問題之一，耐高溫乙醇發(fā)酵菌株的選育是解決該問題的有效途徑。

木質(zhì)纖維素資源主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，通過預(yù)處理技術(shù)可以使木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)松散，將更多的纖維素和半纖維素暴露在表面，促進(jìn)后期的水解糖化[5]。預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素經(jīng)水解糖化后形成以葡萄糖和木糖為主的單糖水解液，高效利用葡萄糖等單糖是纖維質(zhì)原料乙醇發(fā)酵的關(guān)鍵。但是葡萄糖等糖類物質(zhì)以及木質(zhì)素降解的多種單環(huán)芳香族化合物在高溫下會進(jìn)一步發(fā)生多種形式的分解和氧化反應(yīng)，產(chǎn)生有機(jī)酸 (甲酸、乙酸和少量的乙酰丙酸等)、醛類 (糠醛、羥甲基糠醛等) 和芳香族化合物等對微生物生長和代謝具有抑制作用的副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物通過抑制酵母菌的有氧呼吸、增加細(xì)胞膜的透性、破壞酶活性等抑制微生物菌體生長和產(chǎn)物生成[6-7]。

課題組從煙葉腐解物中分離篩選出一株東方伊薩酵母Issatchenkia orientalisHN-1菌株，該菌株具有發(fā)酵溫度高 (38?45 ℃)、耐高糖(150 g/L葡萄糖) 等特點，利用含43.08 g/L葡萄糖的玉米秸稈水解液發(fā)酵，乙醇產(chǎn)量達(dá)20.74 g/L，為理論轉(zhuǎn)化率的91.6%[8]。本文研究了木質(zhì)纖維素水解液主要副產(chǎn)物甲酸鈉、乙酸鈉、糠醛、5-HMF和香草醛等對東方伊薩酵母菌體生長和乙醇生成的影響，以進(jìn)一步客觀評判該菌株用于纖維乙醇發(fā)酵的潛力，并為提高東方伊薩酵母纖維水解液乙醇發(fā)酵的生產(chǎn)效率奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

東方伊薩酵母Issatchenkia orientalisHN-1，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物能源工程研究室分離保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 菌種活化培養(yǎng)基

葡萄糖20 g，酵母浸粉10 g，蛋白胨20 g，固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g，蒸餾水定容至1 L，115 ℃滅菌15 min。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖50 g，酵母粉3 g，蛋白胨5 g，尿素0.2 g，磷酸氫二銨0.1 g，蒸餾水定容至1 L，pH值5.5，115 ℃滅菌15 min。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 抑制物對乙醇發(fā)酵單因素影響試驗設(shè)計

選取甲酸鈉、乙酸鈉、糠醛、5-羥甲基糠醛 (5-hydroxymethylfurfural, 5-HMF) 和香草醛作為考察因素，其添加濃度分別為：甲酸鈉：0、1、2、3、5 g/L；乙酸鈉：0、2.5、4、6、8 g/L；糠醛：0、0.2、0.4、1、2 g/L；5-HMF：0、0.1、0.3、1 g/L；香草醛：0、0.5、0.75、1、2 g/L。

1.3.2 抑制物對乙醇發(fā)酵交互影響試驗設(shè)計

選取甲酸鈉、糠醛、5-HMF和香草醛4種抑制物為自變量考察因素，以發(fā)酵36 h時乙醇濃度為響應(yīng)值，運(yùn)用中心組合試驗設(shè)計 (The Central Composite experimental Design, CCD)，考察抑制物交互作用對乙醇發(fā)酵的影響。中心組合試驗設(shè)計因素和水平如表1所示。

表1 中心組合試驗設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels of CCD test

1.4 菌種活化與擴(kuò)大培養(yǎng)

取斜面保藏菌種接種至菌種活化固體斜面培養(yǎng)基，38 ℃培養(yǎng)48 h后，接3環(huán)斜面活化菌種至裝有50 mL液體活化培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，38 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)10 h。

1.5 發(fā)酵試驗

按照試驗設(shè)計在300 mL三角瓶中配制添加不同濃度抑制物的發(fā)酵培養(yǎng)基，115 ℃滅菌15 min，按體積分?jǐn)?shù)為10%接種量接入活化好的種子液，控制最終裝液量240 mL，38 ℃靜置發(fā)酵。

1.6 測定方法

取發(fā)酵液2 mL，9 000 r/min離心10 min，液體部分留樣測定乙醇和葡萄糖濃度，細(xì)胞沉淀用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85% NaCl水洗2次后重懸浮，用分光光度計測定660 nm處吸光值，利用吸光值與菌體細(xì)胞干重標(biāo)準(zhǔn)曲線 (y=1.493 8x+0.009 8，R2=0.9 9 9 3) 換算細(xì)胞干質(zhì)量。

乙醇濃度采用氣相色譜儀 (Agilent technologies 7890A GC System) 進(jìn)行測定，色譜柱：DB-FFAP (30 m×0.32 mm×1 μm)；檢測器：FID (250 ℃)；進(jìn)樣溫度：200 ℃；柱溫：60 ℃；氮氣：25 mL/min；氫氣：40 mL/min；空氣：45 mL/min。

葡萄糖濃度采用 P680高效液相色譜儀(Diodex) 進(jìn)行測定， RI 101示差折光 (Shodex)檢測器；色譜柱：Xbridge Amide 3.5 (4.6 mm×250 mm，Waters)；流動相：V乙腈： V水=8∶2(V∶V)，流速：0.8 mL/min；柱溫：35 ℃。

甲酸鈉和乙酸鈉濃度采用高效液相色譜儀(HPLC, Shimadzu, Kyoto, Japan) 進(jìn)行測定，色譜柱：Rezex ROA-Organic Acid H+，紫外檢測器 (SPD-15C UV-210 nm)，柱溫45 ℃，流動相：0.005 mol/L H2SO4(pH 2)，流速：0.6 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL。

糠醛、5-羥甲基糠醛和香草醛濃度采用Waters 2695高效液相色譜儀，Waters Sunfire C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm)，Waters 2996二極管矩陣檢測器。流動相：A：1%乙酸，B：甲醇，梯度洗脫：0?15 min，72% A；15?35 min，53% A。流速：0.6 mL/min，柱溫：30 ℃，檢測波長：280 nm，進(jìn)樣量：10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 木質(zhì)纖維素水解液副產(chǎn)物對乙醇發(fā)酵的單因素影響試驗

2.1.1 甲酸鈉和乙酸鈉對乙醇發(fā)酵的影響

甲酸鈉和乙酸鈉對東方伊薩酵母 HN-1菌株的菌體生長具有顯著抑制作用，添加1–5 g/L甲酸鈉或2.5?8.0 g/L乙酸鈉，發(fā)酵36 h時菌體細(xì)胞干重分別較對照下降了 25.04%?37.02%和28.83%?43.82% (圖1)。添加1 g/L甲酸鈉可以提高菌體對葡萄糖的利用速率和發(fā)酵前期(24 h前) 乙醇的生成速率，然而培養(yǎng)基中添加1?5 g/L甲酸鈉對乙醇的最終產(chǎn)量影響不大 (圖1A)。低于8 g/L乙酸鈉添加量對葡萄糖利用速率影響不明顯；4 g/L乙酸鈉添加能顯著促進(jìn)發(fā)酵前期乙醇產(chǎn)生速率，當(dāng)乙酸鈉添加量達(dá)到8 g/L時，乙醇產(chǎn)量提高10.23% (圖1B)。東方伊薩酵母不具有降解轉(zhuǎn)化甲酸鈉和乙酸鈉的能力。

2.1.2 糠醛和5-HMF對乙醇發(fā)酵的影響

糠醛和5-HMF是木質(zhì)纖維素水解液中主要的醛類抑制物。由圖 2可以看出，糠醛主要抑制菌體的生長，培養(yǎng)基中添加0.4?2 g/L糠醛，發(fā)酵 36 h時菌體細(xì)胞干重較對照下降了20.06%?37.60%。培養(yǎng)基中添加0.2?2 g/L糠醛對乙醇產(chǎn)量和乙醇產(chǎn)生速率沒有顯著影響 (圖2A)。添加0.1?1 g/L 5-HMF對菌體生長影響不顯著。培養(yǎng)基中5-HMF濃度< 1 g/L時，對乙醇產(chǎn)量沒有顯著影響；添加1 g/L 5-HMF，乙醇產(chǎn)量較對照降低了11.2%，達(dá)到顯著水平 (圖2B)。在發(fā)酵12 h和24 h時，2 g/L糠醛和1 g/L 5-HMF可被東方伊薩酵母HN-1完全轉(zhuǎn)化利用。

2.1.3 香草醛對乙醇發(fā)酵的影響

香草醛可以顯著抑制微生物菌體的生長，添加0.5?2 g/L香草醛，發(fā)酵36 h時菌體細(xì)胞干重較對照下降了26.39%?52.64%。與對照相比，添加2 g/L香草醛，乙醇產(chǎn)生速率和乙醇產(chǎn)量均顯著降低，發(fā)酵 36 h時乙醇產(chǎn)量較對照降低20.38% (圖 3)。

圖1 甲酸鈉 (A) 和乙酸鈉 (B) 對東方伊薩酵母乙醇發(fā)酵的影響Fig. 1 The influence of sodium formate (A) and sodium acetic (B) on ethanol fermentation of Issatchenkia orientalis HN-1.

圖2 糠醛 (A) 和5-HMF (B) 對東方伊薩酵母乙醇發(fā)酵的影響Fig. 2 The influence of furfural (A) and 5-HMF (B) on ethanol fermentation of Issatchenkia orientalis HN-1.

圖3 香草醛對東方伊薩酵母乙醇發(fā)酵的影響Fig. 3 The influence of Vanillin on ethanol fermentation of Issatchenkia orientalis HN-1.

2.2 抑制物交互作用對乙醇發(fā)酵的影響

根據(jù)單因素試驗結(jié)果及已有的文獻(xiàn)報道，選取甲酸鈉、糠醛、5-HMF和香草醛4個因素，運(yùn)用響應(yīng)面中心組合試驗設(shè)計研究抑制物交互作用對乙醇發(fā)酵的影響。根據(jù)設(shè)計結(jié)果，共安排30組試驗，發(fā)酵36 h的乙醇產(chǎn)量結(jié)果見表2，其方差分析結(jié)果如表3所示。甲酸、糠醛、5-HMF和香草醛 4種抑制物交互作用對乙醇發(fā)酵影響不顯著，但香草醛對乙醇產(chǎn)量影響的P值為0.038 9，達(dá)到顯著水平。

3 討論

木質(zhì)纖維素預(yù)處理過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸、醛類和芳香族化合物等副產(chǎn)物對微生物生長和代謝的抑制作用是影響木質(zhì)纖維素原料乙醇轉(zhuǎn)化過程的重要因素之一。其中有機(jī)酸分子如甲酸、乙酸、乙酰丙酸等通過簡單擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并發(fā)生解離，使細(xì)胞膜內(nèi)H+濃度增加，通過破壞膜電位使ATP不能正常生成，最終引起細(xì)胞生長代謝緩慢或死亡[9]；纖維水解液中以糠醛和 5-HMF為主的醛類物質(zhì)能在一定程度上增加細(xì)胞膜的通透性，破壞酶活性，直接或間接影響糖代謝途徑[10-11]；香草醛、丁香醛等酚類物質(zhì)是木質(zhì)素的主要降解物，這類物質(zhì)能夠破壞細(xì)胞膜的完整性，影響膜的選擇透過性，從而影響菌體生長，其中，低分子量的香草醛負(fù)作用更明顯，1 g/L香草醛即開始抑制菌體生長[12]。

表2 中心組合試驗設(shè)計方案和發(fā)酵36 h時乙醇產(chǎn)量試驗結(jié)果Table 2 Design of CCD test and results of ethanol production fermented at 36 h

表3 CCD結(jié)果方差分析表Table 3 Uviariate analysis of variance of CCD test

覃香香等研究發(fā)現(xiàn)，東方伊薩酵母S-7對半纖維素水解液中的微生物代謝抑制物乙酸、糠醛、香草醛、阿魏酸等具有較強(qiáng)的生物降解能力，可用于半纖維素水解液發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇的生物脫毒[13]。本文研究了從煙葉腐解物中分離篩選出的耐高溫東方伊薩酵母 HN-1菌株對木質(zhì)纖維素水解液副產(chǎn)物甲酸鈉、乙酸鈉、糠醛、5-羥甲基糠醛和香草醛的耐受能力，結(jié)果表明，木質(zhì)纖維素水解液中含有的有毒物質(zhì)對東方伊薩酵母菌體生長具有顯著抑制作用，添加1?5 g/L甲酸鈉、2.5?8.0g/L乙酸鈉、0.2?2 g/L糠醛或0.5?2 g/L香草醛，發(fā)酵36 h時菌體細(xì)胞干重分別較對照下降了25.04%?37.02%、28.83%?43.82%、20.06%?37.60%和 26.39%?52.64%。試驗濃度范圍內(nèi)，甲酸鈉、乙酸鈉、糠醛和5-HMF對乙醇發(fā)酵影響較小，但添加2 g/L香草醛或1 g/L 5-HMF可使乙醇產(chǎn)量分別降低20.38%和11.2% (圖2和3)。中心組合試驗結(jié)果表明，各抑制物對乙醇發(fā)酵影響的交互作用不顯著。表 4總結(jié)了木質(zhì)纖維素水解液有毒物質(zhì)對東方伊薩酵母 HN-1及其他微生物乙醇發(fā)酵影響的起始濃度。由表 4可以看出，東方伊薩酵母HN-1對甲酸、乙酸、糠醛、5-HMF和香草醛的耐受能力與釀酒酵母相當(dāng)，對糠醛、5-HMF和香草醛的耐受能力高于I. orientalisIPE 100。

表 5總結(jié)了近年來文獻(xiàn)報道的木質(zhì)纖維素酶水解液中各有毒副產(chǎn)物的含量，除采用酸熱預(yù)處理得到的水解液中5-HMF含量及Alriksson利用蒸汽爆破和補(bǔ)料酶解得到的高糖水解液中甲酸和乙酸的含量較高外，其他水解液中5種有毒物質(zhì)的含量均低于對東方伊薩酵母乙醇發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用的起始濃度。本課題組建立了玉米秸稈的稀酸預(yù)處理和酶水解技術(shù)體系，采用補(bǔ)料酶解得到的水解液中葡萄糖和木糖的濃度分別為43.08和27.13 g/L，東方伊薩酵母HN-1利用該水解液發(fā)酵乙醇產(chǎn)量為20.74 g/L，乙醇產(chǎn)率為0.468 g/g，達(dá)到理論轉(zhuǎn)化率的91.6%[8]。該水解液中甲酸、乙酸、糠醛、5-HMF和香草醛的含量分別為：550、1 940、72.89、18、1.78 mg/L(表5)，水解液濃縮3倍后，各抑制物濃度將達(dá)到1 650、5 820、219、54和5.34 g/L，仍低于對東方伊薩酵母 HN-1乙醇發(fā)酵產(chǎn)生抑制的起始濃度。以上研究結(jié)果表明東方伊薩酵母具有較強(qiáng)的耐毒能力，可適用于木質(zhì)纖維素水解液乙醇發(fā)酵。

表4 木質(zhì)纖維素水解液有毒副產(chǎn)物影響乙醇發(fā)酵的起始抑制濃度Table 4 The initial inhibiting concentration of inhibitory compounds in lignocellulosic hydrolysate on ethanol production

表5 木質(zhì)纖維素酶水解液中各有毒抑制物含量Table 5 The content of inhibitory compounds in lignocellulosic enzyme hydrlysates

4 結(jié)論

東方伊薩酵母 HN-1對木質(zhì)纖維素水解液有毒副產(chǎn)物甲酸鈉、乙酸鈉、糠醛、5-HMF和香草醛具有較強(qiáng)的耐受能力，除添加2 g/L香草醛或添加1 g/L 5-HMF可使乙醇產(chǎn)量分別降低

20.38%和11.2%外，其他抑制物的添加對乙醇的生成未有顯著影響。但是，當(dāng)副產(chǎn)物濃度較高時，可以顯著抑制菌體生長。中心組合試驗結(jié)果表明各抑制物交互作用對乙醇的生成影響不顯著。

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