楊亞東，王禮偉，屈勇剛，李 飛，楊一鳴，楊 蓓

（石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832000）

奶牛乳房炎是奶牛的常見多發(fā)病，直接給我國的奶產業(yè)帶來了嚴重的經濟損失［1］。目前在臨床防治中大多采用抗菌藥物來治療，普遍存在耐藥性和用藥成本增加等問題。同時，由于長期使用抗生素，使畜產品存在嚴重藥物殘留，導致產品品質下降，很難滿足人們對綠色健康養(yǎng)殖的要求。噬菌體是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的生物病毒的總稱。自1917年人們發(fā)現(xiàn)噬菌體以來，如何利用噬菌體預防和治療細菌性疾病引起了人們的關注［2］。早在20世紀初噬菌體治療就已經取得過可喜的成果，國外第一次公開報道的噬菌體治療是在1921年，Richard B等利用噬菌體制劑治療葡萄球菌皮膚感染，24h～48h之內，感染消退［3］?，F(xiàn)今，噬菌體的應用越來越廣泛［4］。利用噬菌體治療細菌感染具有一些抗菌藥物無法比擬的優(yōu)勢，如噬菌體超強的繁殖能力、裂解細菌的特異性、無耐藥性、無殘留等。本研究從牛糞便中分離到1株裂解致奶牛乳房炎大腸埃希菌的噬菌體，對其生物學特性進行分析，為開展奶牛乳房炎噬菌體治療研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和糞便 21株奶牛源致病性大腸埃希菌（Eco1～Eco21）由石河子大學獸醫(yī)傳染病實驗室分離鑒定所得，用甘油在-40℃保存。26份牛糞便采自石河子周邊奶牛場。

1.1.2 主要試劑 LB培養(yǎng)液配方按文獻［5］配制；普通營養(yǎng)瓊脂購于北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 宿主菌的準備 將21株牛源致病性大腸埃希菌分別接種到裝有3mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，于37℃條件下，180r／min搖床培養(yǎng)6h，置4℃冰箱保存。

1.2.2 噬菌體的富集與分離 參照文獻［6］將牛糞便樣品放入1 000mL自來水中充分混勻，自然沉降10min后，取上清液用16層紗布粗過濾，所得濾液4℃冰箱過夜，后將上清以10 000r／min離心10 min。取上清液，放置4℃冰箱過夜。將所得上清液20mL，以及21株菌懸液各3mL，分別加入100mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)24h，10 000r／min離心10min，取上清液備用。取21支試管，每管分別加大腸埃希菌菌懸液0.1mL和處理后的噬菌體液0.1mL，振蕩使其充分混勻，靜置15min，使噬菌體和宿主菌充分吸附。將7g／L半固體LB培養(yǎng)基融化后自然降溫到50℃左右，取10mL加入試管，搖晃，充分混勻，再倒入LB平板，37℃培養(yǎng)6h，觀察結果。

1.2.3 噬菌體的純化 當有噬菌斑出現(xiàn)時，用滅菌牙簽挑取單個噬菌斑接種于相應的宿主菌菌懸液中，37℃、180r／min搖床培養(yǎng)8h，10 000r／min離心處理10min，重復此挑斑步驟2次～3次即可得到較純的噬菌體。

1.2.4 噬菌體的保存 取最終純化的噬菌體加入甘油分6管凍存。

1.2.5 滴度測定 參照文獻［6］，以LB液體培養(yǎng)基為稀釋液，將純化后的噬菌體作連續(xù)10倍稀釋。分別取100μL稀釋后的各個梯度噬菌體與100μL對應宿主菌菌懸液充分作用后，采用雙層平板法進行培養(yǎng)，觀察結果。上述每個稀釋度分別做三個平行重復。計數(shù)時，選取噬菌斑數(shù)在30～300之間的平板，采用平均數(shù)計算滴度。噬菌體的滴度（PFU／mL）＝稀釋倍數(shù)×噬菌斑個數(shù)的平均數(shù)×10。

1.2.6 裂解譜的測定 取純化后的噬菌體原液0.1mL，分別加入到21株奶牛乳房炎大腸埃希菌菌懸液（0.1mL）中，室溫靜置15min，采用雙層瓊脂平板法觀察分離株噬菌體對不同大腸埃希菌的裂解情況。

1.2.7 最佳感染復數(shù)的測定 感染復數(shù)是指感染發(fā)生之前，噬菌體與宿主菌數(shù)量的比值。最佳感染復數(shù)（Multiplicity of infection，MOI）表示子代最高產出率。參照文獻［7］，取分離株噬菌體對應的對數(shù)期菌懸液，按感染復數(shù)分別為0.1、1、10、100加入噬菌體。37℃搖床培養(yǎng)8h，采用雙層瓊脂平板法測定最佳感染復數(shù)。

1.2.8 pH 穩(wěn)定性的測定 制備pH 為4、5、6、7、8、9的LB液體培養(yǎng)基。取6個試管，分別加入9 mL不同pH的LB液體培養(yǎng)基，再分別加入1mL純化后的噬菌體原液，于37℃條件下作用2h。采用雙層瓊脂平板法分析不同pH對噬菌體滴度的影響。

1.2.9 溫度穩(wěn)定性的測定 將噬菌體分別在30℃、40℃、50℃、60℃溫度條件下處理1h，采用雙層瓊脂平板法分析不同溫度對噬菌體滴度的影響。

1.2.10 紫外線穩(wěn)定性的測定 將1mL噬菌體稀釋液（1.98×102PFU／mL）加入平板中，直接暴露在超凈工作臺中，紫外線燈照射。在0、2、4、6、8、10、12min時，取0.1mL噬菌體處理液加入0.1mL相應宿主菌，震蕩使其充分混勻，室溫靜置15min，倒板，測定不同照射時間條件下噬菌體的滴度。

2 結果

2.1 大腸埃希菌噬菌體的分離及噬菌斑觀察結果

采用雙層瓊脂平板法培養(yǎng)6h后，肉眼可見直徑相差不大，邊緣整齊，無暈環(huán)、透明清晰的噬菌斑（圖1），將其命名為EcP1。

2.2 噬菌體EcP1滴度測定結果

通過雙層瓊脂平板法測定計數(shù)可知，噬菌體EcP1的滴度為7.75×1010PFU／mL。

2.3 噬菌體EcP1裂解譜測定結果

通過裂解譜的測定，可知EcP1的裂解率為33.3%（表1）。

2.4 噬菌體EcP1的最佳感染復數(shù)測定結果

經過4h的培養(yǎng)，通過滴度的測定，在MOI為0.1、1、10、100時進行試驗，當 MOI＝10時，噬菌體EcP1產生子代的滴度為1.65×109PFU／mL，是4種感染中最高的（表2）。

圖1 噬菌體EcP1形成的噬菌斑Fig.1 The plaque of bacteriophage EcP1

表1 噬菌體EcP1的裂解譜Table 1 The lysis spectrum of bacteriophage EcP1

表2 最佳感染復數(shù)的測定Table 2 Determination of optimal multiplicity of infection（MOI）

2.5 噬菌體EcP1的pH穩(wěn)定性測定結果

噬菌體EcP1經過不同的pH處理2h后，pH為6時滴度最高，滴度維持在1011左右。當pH為4、10時，滴度為零。這種趨勢說明強酸、強堿都會嚴重影響噬菌體的活性（圖2）。

2.6 噬菌體EcP1熱穩(wěn)定性測定結果

噬菌體EcP1經過不同溫度處理1h后，溫度為30℃時滴度最高，達到1.00×1011PFU／mL，同時，40℃～50℃時滴度均維持在1010，當60℃的時候，滴度明顯下降，這種趨勢說明高溫也嚴重影響噬菌體的活性（圖3）。

2.7 噬菌體EcP1紫外線穩(wěn)定性測定結果

隨著紫外線照射時間的持續(xù)，噬菌體EcP1的活性逐漸降低。紫外線持續(xù)照射12min時僅產生2個噬菌斑，紫外線的照射直接導致噬菌體的快速失活（圖4）。

2.8 噬菌體EcP1在-20℃保存

經本實驗室在-20℃冰箱中保存1個月后，可重新分離到噬菌體，其滴度沒有發(fā)生明顯的變化，維持在105。保存10個月后依然可以分離到噬菌體，滴度維持在104。

圖2 噬菌體EcP1對pH的耐受能力Fig.2 The resistance of bacteriophage EcP1to different pH

圖3 噬菌體EcP1對溫度的耐受能力Fig.3 The resistance of bacteriophage EcP1 to different temperatures

圖4 噬菌體EcP1對紫外線的耐受能力Fig.4 The resistance of bacteriophage EcP1to ultraviolet rays

3 討論

奶牛乳房炎是奶牛的常見多發(fā)病，在奶牛養(yǎng)殖中危害最大，是投入藥費最多、防治最難的奶牛主要疾病之一。目前，全世界約有2.2億頭奶牛，其中1／3患有各種類型的乳房炎。我國奶牛乳房炎發(fā)病率在20%～70%之間，有的甚至更高［8-10］?，F(xiàn)已證實大腸埃希菌是引致奶牛乳房炎的主要病原菌之一，檢出率為7.22%［11-12］。傳統(tǒng)的抗生素治療方法因其在臨床上容易出現(xiàn)耐藥和藥物殘留等問題受到廣泛爭議。所以，探索新型的治療方案迫在眉睫。以中草藥制劑、疫苗等為代表的生物制劑因具有較多的優(yōu)點而被人們廣泛關注［13］。近年來，噬菌體作為一種微生態(tài)制劑已經廣泛的在醫(yī)學、獸醫(yī)學、食品行業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、環(huán)境等相關領域得到了廣泛的應用［14-15］。作為一種微生態(tài)制劑，噬菌體治療具有取材廣泛、較強的復制能力、宿主特異性、無耐藥性、無殘留等優(yōu)點，越來越多受到人們的重視。本研究在前期病原分離的基礎上，以致奶牛乳房炎的大腸埃希菌為宿主菌分離到1株裂解性噬菌體，該分離株噬菌體滴度為1010PFU／mL，與國內有關研究的結果相似［16］。該株噬菌體對試驗中21株大腸埃希菌的裂解率為33.3%，最佳感染復數(shù)為10，在pH 5～9范圍內作用2h、30℃～40℃時作用1h其滴度變化不顯著，紫外線照射14min可被全部滅活，在-20℃條件下保存10個月仍保持活性。

根據(jù)本試驗對于最佳感染復數(shù)的測定結果表明，噬菌體的分離與最佳感染復數(shù)有關，本試驗中在最佳感染復數(shù)為0.1時，沒有出現(xiàn)相應的噬菌斑，可能是由于噬菌體數(shù)量的過少導致噬菌體增殖速度跟不上細菌的增殖速度，被菌苔覆蓋，無法獲得明顯的噬菌斑。所以，調節(jié)菌懸液的濃度可以提高噬菌體的分離率。

噬菌體與細菌作用的過程中，只有完全充分的吸附后才有可能使噬菌體依附細菌大量繁殖，在噬菌體富集的時候，保證噬菌體與宿主菌混合后靜置15min～20min是很有必要的；搖床培養(yǎng)的時候轉速過高也會對噬菌體與細菌的吸附過程造成影響，選擇180r／min是本試驗采用的方法。

噬菌體的常規(guī)保存方法是甘油凍存，本試驗將所得噬菌體甘油凍存的同時，取一部分于-20℃冰箱冷凍，經10個月后，測定其滴度，發(fā)現(xiàn)該噬菌體依舊保持較高生物活性，證實了該保存方法的可行性。

［1］富艷玲，劉愛玲，李旭東.奶牛乳房炎防治技術研究進展［J］.中國獸藥雜志，2010，44（7）：51-54.

［2］武 英.應對耐藥菌的新方法-噬菌體制劑［J］.國外醫(yī)藥抗生素分冊，2011，32（5）：223-227.

［3］王 靜，王 勁，孫運峰，等.治療性噬菌體制劑的研究進展［J］.食品與藥品，2011，13（9）：366-370.

［4］趙慶友，朱瑞良.噬菌體制劑的研究現(xiàn)狀及發(fā)展前景［J］.中國獸藥雜志，2010，44（7）：40-43.

［5］Sambrook J，Russell D W.分子克隆實驗指南［M］.3版.黃培堂，等，譯.科學出版社，2002：27-30.

［6］Jamalludeen N，Johnson R P，F(xiàn)riendship R，et al.Isolation and characterrization of nine bacteriophages that lyse O149enterotoxigenic Escherization coli［J］.Vet Microbiol，2007，124：47-57.

［7］孫榮華，李菁華，史紅艷，等.大腸埃希菌噬菌體的分離鑒定及其生物學特性研究［J］.中國病原生物學雜志，2009，4（2）：88-90.

［8］劉建平，杜 江，劉 琴.奶牛乳房炎研究概況［J］.動物醫(yī)學進展，2008，29（增）：40-41.

［9］鄧海平，蒲萬霞，俞詩源，等.奶牛乳房炎主要病原菌及其分離鑒定方法研究進展［J］.中國草食動物，2009，29（2）：52-55.

［10］王 鳳，宋 立，湯德元，等.奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定、血清型、及耐藥性研究［J］.動物醫(yī)學進展，2013，34（6）：62-67.

［11］高 潮，劉國慶，連英琪，等.奶牛隱性乳房炎病原菌的分離鑒定與DGGE追溯［J］.上海交通大學學報：農業(yè)科學版，2014，31（3）：88-94.

［12］McGrath S，Sinderen D V.Bacteriophage：Genetics and molecuLar biology［M］.Caister Academic Press，2007：1221.

［13］錢 立，丁建平，陶 勇，等.中草藥防治奶牛乳房炎［J］.動物醫(yī)學進展，2006，27（5）：105-108.

［14］李宏勝，郁 杰，李新圃，等.奶牛乳房炎類型與病原菌感染之間相關性的研究［J］.動物醫(yī)學進展，2004，25（6）：80-84.

［15］張 娜，李書光，陳金龍，等.噬菌體制劑治療細菌感染的研究進展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（9）：221-223.

［16］李隴平，張智英.金黃色葡萄球菌烈性噬菌體的分離鑒定和最佳保存方法研究［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（6）：141-146.