亢寧寧，刀筱芳，馮旭飛，虎 嘯，馬曉楠，楊發(fā)龍

（西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都610041）

呼吸道疾病是影響山羊養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病之一，主要引起山羊群體性發(fā)病、死亡或生產性能下降，給山羊養(yǎng)殖戶造成了嚴重的經濟損失。其中，山羊支原體山羊肺炎亞種（Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae，Mccp）可引起山羊傳染性胸膜肺炎，該病以嚴重的纖維素性胸膜肺炎為主要特性，是一種高度傳染性、致死性的山羊呼吸道傳染病，發(fā)病率可達到100%［1－2］，該病在我國青海、甘肅等地發(fā)生并廣泛流行［3－5］，近年報道其可引起藏羚羊的胸膜肺炎［6］。多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）是存在于羊上呼吸道的條件致病菌，在長途運輸、營養(yǎng)不良、過度擁擠以及其他支原體或病毒感染等條件作用下，迅速增殖而引起山羊肺炎的發(fā)生［7］。山羊支原體山羊肺炎亞種和多殺性巴氏桿菌可混合感染亦可繼發(fā)感染［8－9］，給疾病的診斷和治療造成困難。

傳統的細菌分離培養(yǎng)及鑒定費時費力，此外，支原體在體外培養(yǎng)較為困難，且生長周期相對較長，一般需要1周～2周，因此不常作為常規(guī)手段用于病原的鑒定、疾病的診斷及流行病學調查。而PCR技術以其快速、靈敏等優(yōu)點，已逐漸成為病原鑒定和疾病診斷的常規(guī)方法。針對山羊支原體山羊肺炎亞種和多殺性巴氏桿菌，Woubit S［10］分別建立了特異性PCR方法，并已廣泛用于這兩種病原的檢測及其感染的診斷［6，11］。由于山羊支原體山羊肺炎亞種和多殺性巴氏桿菌均可引起山羊肺炎，且可以混合感染，因此有必要建立一種能夠同時檢測該兩種病原的雙重PCR方法，從而為生產中快速、準確檢測這兩種病原及其感染的鑒別診斷和流行病學調查提供一種新手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及臨床樣品 絲狀支原體山羊亞種Y－goat株、絲狀支原體山羊亞種PG3株、無乳支原體PG2株、山羊支原體山羊肺炎亞種C87－1株及綿羊肺炎支原體Y－98株均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；金黃色葡萄球菌SW07株、大腸埃希菌013株、沙門菌、多殺性巴氏桿菌及溶血性曼氏桿菌均為西南民族大學動物醫(yī)學四川省高校重點實驗室分離鑒定并保存。用于臨床檢測的26份山羊鼻腔棉拭子均采集于四川省成都市青白江區(qū)某山羊場。用于樣品采集的山羊均有不同程度的呼吸道癥狀。

1.1.2 主要試劑 Taq DNA 聚合酶、MgCl2、dNTP及10×PCR buffer均為TaKaRa公司產品；蛋白酶K為美國Sigma公司產品；瓊脂糖為英國OXOID公司產品；DNA分子量標準 Marker I和Goldview核酸染料為天根生化科技有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物信息 本研究中用于雙重PCR建立的引物直接采用 Woubit S［10］和 Townsend K M 等［11］所設計的山羊支原體山羊肺炎亞種特異性引物Mccp－F／Mccp－R和多殺性巴氏桿菌特異性引物KMT1／KMT2，具體信息如表1。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primers used in this study

1.2.2 DNA的提取 在提取DNA前，對不同的樣品進行了相應的前處理：對于鼻腔棉拭子，浸入1mL無菌水中并反復擠壓，將懸液經12 000r／min離心30min，棄上清，收沉淀；對于支原體培養(yǎng)物，12 000r／min離心30min，收集沉淀；對于其他細菌培養(yǎng)物，則10 000r／min離心3min后收集沉淀。隨后，采用常規(guī)酚－氯仿法提取基因組DNA，并置于－20℃保存。

1.2.3 雙重PCR反應體系及反應條件優(yōu)化 將兩對引物分別按不同比例混合進行引物濃度比例的優(yōu)化，然后分別以46 、48 、50、52 、54 、56 、58 和60℃為退火溫度進行優(yōu)化，所有PCR均采用下列反應體系和條件進行擴增：10×PCR buffer 2.5μL，2.5mmol／L dNTP 2μL，25mmol／L MgCl21.5 μL，10pmol／μL上、下游引物（以不同的引物比），5 U／μLTaq酶0.2μL，DNA模板2μL，滅菌去離子水補足25μL。反應條件為：95℃5min；94℃30s，退火（按上述溫度梯度）30s，72℃45s，共進行35個循環(huán)；72℃10min。以擴增產物電泳條帶亮度大、無非特異性擴增條帶和引物二聚體少為標準選擇最佳引物比例和退火溫度。

1.2.4 雙重PCR的特異性評價 采用上述優(yōu)化反應體系和反應條件，分別以山羊支原體山羊肺炎亞種C87－1株、多殺性巴氏桿菌、絲狀支原體山羊亞種Y－goat株、絲狀支原體山羊亞種PG3株、無乳支原體PG2株、綿羊肺炎支原體Y－98株、金黃色葡萄球菌SW07株、大腸埃希菌013株、沙門菌和溶血性曼氏桿菌DNA為模板進行PCR擴增。

1.2.5 雙重PCR的敏感性評價 從山羊支原體山羊肺炎亞種C87－1和多殺性巴氏桿菌的純培養(yǎng)物中分別提取全基因組DNA。采用核酸蛋白檢測儀測定其濃度，并進行10倍系列稀釋，將以每個稀釋度的兩種細菌DNA等量混合作為模板進行PCR擴增。同時，將上述不同稀釋度的模板分別進行單獨PCR檢測。

1.2.6 雙重PCR對臨床樣品的檢測 提取臨床所采集的26份鼻拭子的全基因組DNA，同時應用所建立的雙重PCR方法和單獨PCR方法分別進行檢測，比較兩者的檢出率。

2 結果

2.1 雙重PCR條件優(yōu)化結果

經優(yōu)化，最終獲得雙重PCR反應的最佳退火溫度為52℃，山羊支原體山羊肺炎亞種和多殺性巴氏桿菌引物的最佳濃度為10pmol／μL和10pmol／μL。

2.2 雙重PCR的特異性

分別以山羊支原體山羊肺炎亞種和多殺性巴氏桿菌的基因組DNA單獨或以兩者等量混合后作為模板進行雙重PCR擴增。同時以其他多種常見非目的病原菌DNA為模板，進行雙重PCR擴增。結果表明，以單一病原DNA為模板時，分別得到316 bp或460bp的單一條帶；將2種病原DNA混合后作為模板，能得到預期大小的2個條帶。而對絲狀支原體山羊亞種、無乳支原體、綿羊肺炎支原體、大腸埃希菌、沙門菌及金黃色葡萄球菌等均無擴增（圖1）。經3次重復試驗，此結果穩(wěn)定。

圖1 雙重PCR特異性試驗Fig.1 Specificity test of duplex PCR

2.3 雙重PCR的敏感性

分別對山羊支原體山羊肺炎亞種和多殺性巴氏桿菌的基因組DNA進行10倍系列稀釋，將各稀釋度的兩種DNA分別進行等量混合后作為模板，并進行雙重PCR和單獨PCR檢測。結果表明，雙重PCR對山羊支原體山羊肺炎亞種DNA的最低檢測限為32 pg，對多殺性巴氏桿菌的最低檢測限為50pg，其敏感性與采用一對引物的單獨PCR相同（圖2）。

圖2 雙重PCR的敏感性Fig.2 Sensitivity of the duplex PCR

2.4 臨床樣品的檢測

從患病山羊采集的26份鼻拭子中提取總DNA，然后分別用所建立的雙重PCR和現有的單獨PCR進行檢測。結果表明，采用雙重PCR方法，26份樣品中山羊支原體山羊肺炎亞種和多殺性巴氏桿菌的檢出率分別為23.1%（6／26）和26.9%（9／26），其中有3份鼻拭子中同時檢測出山羊支原體山羊肺炎亞種和多殺性巴氏桿菌。用單獨PCR檢測所得到結果與雙重PCR檢測結果完全一致。

3 討論

相對于單獨PCR方法，多重PCR可實現一次同時檢測多種病原，對一些可引起混合感染的多個病原進行檢測時十分有用。針對山羊的某些其他病原，已建立了一些雙重PCR方法［12－14］。山羊支原體山羊肺炎亞種和多殺性巴氏桿菌是引起山羊呼吸道傳染病的重要病原［15］，并且常存在兩者混合感染或山羊支原體山羊肺炎亞種繼發(fā)多殺性巴氏桿菌感染的現象。因此，本研究建立的可同時檢測這兩種病原的雙重PCR技術，為其感染的快速診斷和流行病學調查提供了有用的手段。

特異性是PCR檢測的關鍵，是對病原進行準確檢測的基礎。在建立雙重PCR方法時，由于要同時應用兩對引物，從而增加了對非目的病原產生非特異擴增的可能性。為了獲得特異性較好的雙重PCR方法，本研究根據國內外學者此前所建立的針對上述兩種病原的PCR技術的多對引物，首先對各引物用于雙重PCR的可行性進行了分析，包括對各引物間形成引物二聚體的可能性，以及產生非特異性擴增的可能性等。選擇已經反復驗證的具有很好特異性、理論上形成最小引物二聚體和不產生非特異擴增的引物用于本研究。本研究中對引物的特異性評價結果表明其僅對山羊支原體山羊肺炎亞種和多殺性巴氏桿菌產生陽性擴增，且獲得預期大小片段，而對其他常見的羊呼吸道病原無擴增。說明本研究建立的雙重PCR具有良好的特異性，這有利于對兩種病原感染的準確診斷。

本研究對該雙重PCR的敏感性進行了評價，并與單獨PCR方法進行了比較。結果顯示，所建立的雙重PCR對兩種病原的檢測敏感性與單獨PCR相同。這說明，經過反應條件和體系的優(yōu)化后，將兩對引物按優(yōu)化的比例混合不會降低檢測的敏感性。

在無需進行分離及培養(yǎng)的情況下，直接從臨床樣品中對病原DNA進行檢測是PCR的優(yōu)勢之一。為了評價所建立的雙重PCR從臨床樣品進行直接檢測的可行性，對共計26份來自于患病山羊的鼻腔拭子進行了檢測。結果顯示，其中山羊支原體山羊肺炎亞種的檢出率為23.1%，而多殺性巴氏桿菌的檢測出率為26.9%，并且有3份樣品中同時包括上述兩種病原。這說明本研究建立的PCR方法可以用于臨床樣品的檢測，不僅可以檢測出感染單一病原的動物，而且對混合感染2種病原的動物同樣可以進行有效檢測。另一方面，檢測結果也表明，由山羊支原體山羊肺炎亞種和多殺性巴氏桿菌與其他呼吸道細菌混合感染的情況普通存在，因此在預防和用藥時應給予足夠的重視。但本研究中對臨床樣品的檢測旨在評價該方法對臨床樣品中兩種病原的檢測能力，由于樣品數量有限，無法全面反映兩種病原感染的流行病學特征。

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