孫雪峰，張要齊，許賢會，黨麗梅，劉 丹，李會芳，劉一霖，李引乾＊

（1.河南惠通天下動物藥業(yè)有限公司，河南鄭州450000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100）

阿維菌素（avermectin，AVM）是阿維鏈霉菌發(fā)酵的天然產(chǎn)物，主要成分為avermectin B1，國外又稱愛比菌素（abamectin）。獸用阿維菌素是由我國首先研究開發(fā)的，由于價格低于伊維菌素，很快在我國得到推廣應(yīng)用［1-3］。阿維菌素是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有廣譜的殺線蟲和外寄生蟲作用，已廣泛用于家畜寄生蟲病的治療，其劑型有預(yù)混劑、片劑、糊劑、口服液、注射劑和澆潑劑，這些制劑可以不同程度的滿足不同種類動物和不同飼養(yǎng)方式下的用藥需求［4-6］。阿維菌素具有高效、廣譜、低殘留和對人畜及環(huán)境安全等特點(diǎn)，是一種重要的綠色生態(tài)型農(nóng)畜兩用新型抗生素［7-8］。脂質(zhì)體是一種新型的載藥系統(tǒng)，由于脂質(zhì)體具有靶向性、淋巴定向性、緩釋作用、降低藥物毒性和提高穩(wěn)定性等特性，已經(jīng)成為目前各種藥物緩釋和控釋制劑等研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)［9-10］。目前國內(nèi)外已經(jīng)研制出了許多藥物的脂質(zhì)體劑型并應(yīng)用到了臨床實(shí)踐中。

阿維菌素由于分子質(zhì)量大，極難氣化，所以無法使用氣相色譜分析，目前的檢測方法有HPLC 方法和免疫分析方法［11］。本文應(yīng)用HPLC法對阿維菌素納米脂質(zhì)體（avermectin nanometre liposomes，AVMNL）在山羊體內(nèi)的藥動學(xué)研究，旨在評價其體內(nèi)釋藥規(guī)律，為阿維菌素長效控釋劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備 LCQ-ADUANFAGE 高效液相色譜儀為美國FINNGAN 公司產(chǎn)品；Ausphere ODS-2色譜柱為美國安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；BS 210S型電子分析天平為德國賽多利斯（sartorius）股份公司產(chǎn)品；QL-901 Vortex漩渦振蕩器為其林貝爾儀器制造公司產(chǎn)品；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱為上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠產(chǎn)品；DRAGON-MED 10μL ～100 μL微量移液器、DRAGON-MED 100μL～1 000μL微量移液器為大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 試劑 阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品、阿維菌素（B1a含量為94.08%，B1含量為97.72%）為河北威遠(yuǎn)動物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號：2012043100；阿維菌素納米脂質(zhì)體（10g／L）為西北農(nóng)林科技大學(xué)藥理研究室試制，批號：20130427；乙酸乙酯、甲醇、色譜純，為天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品（批號：20130105）。

1.1.3 試驗(yàn)用動物 用健康山羊5 只（3 只公羊，2只母羊），體重30kg～38kg，試驗(yàn)前常規(guī)飼養(yǎng)7d，臨床檢查健康者，即為試驗(yàn)羊。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件的確定

1.2.1.1 檢測波長的選擇 對阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行全波長掃描，以其最大吸收波長作為阿維菌素的測定波長［12］。

1.2.1.2 色譜分析條件選擇 色譜柱選擇Welchrom-C18柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相為乙腈-甲醇-水（53∶35∶12，V／V／V），流速為1.0mL／min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為20μL。

1.2.2 生物樣品預(yù)處理

1.2.2.1 血清的分離 在山羊頸靜脈采血4.5mL，置于10mL 離心管中，加入檸檬酸鈉抗凝劑0.5mL，6 000r／min條件下離心10min，分離上清液備用。

1.2.2.2 血清樣品的處理 參照文獻(xiàn)［13-14］取血清樣品1.0mL置于5 mL 離心管，加入乙酸乙酯1.0mL，漩渦混勻5 min，6 000r／min 條件下離心15min，取上清液備用。在下層液中再加入乙酸乙酯0.5mL，按同上操作共3次（乙酸乙酯1.0、0.5、0.5mL）。6 000r／min條件下離心15 min，合并上層液，將上清液在50 ℃水浴N2流吹干。殘留物加0.5mL甲醇溶解，漩渦混合5min，用0.22μm 濾膜過濾后，進(jìn)樣測定。

1.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取阿維菌素對照品置容量瓶中，加甲醇溶解配置成1μg／mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取7支5 mL 潔凈離心管各加入1.0 mL山羊空白血清，再分別依次加入阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)液制備成2.0、5.0、10.0、25.0、100.0、150.0ng／mL 的血藥濃度，漩渦混勻，按照1.2.2.2項(xiàng)的方法處理樣品后，取20μL進(jìn)樣分析。記錄色譜峰面積，回歸計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.2.2.4 精密度測定 取空白血清3 份（每份各1.0mL），加入適量阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)液，制備成10.0、50.0、150.0 ng／mL的血藥濃度，漩渦混 勻，按1.2.2.2方法處理后，在1d內(nèi)重復(fù)測定3次，即得日內(nèi)精密度；將上述3種濃度的樣品在5d內(nèi)隔日重復(fù)測定3次，即得日間變異系數(shù)。

1.2.2.5 回收率的測定 取空白血清3 份（各1.0mL），加入適量阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)液，制備成10.0、50.0、150.0 ng／mL的血藥濃度，漩渦混 勻，按1.2.2.2方法處理后，重復(fù)測定含量3次，以添量法計(jì)算相對回收率。

1.2.2.6 給藥方法及采血 以1.2mg／kg的劑量給山羊頸部皮下注射阿維菌素納米脂質(zhì)體。給藥前頸靜脈采血4.5mL，加入檸檬酸鈉抗凝劑0.5mL作為空白對照，給藥后0.04、0.17、0.29、0.5、1、2、4、6、8、12、16、20、22、24、28、30d頸靜脈采血4.5mL，并分別加入抗凝劑0.5mL。按1.2.2.1的方法分離血清，置-20 ℃冰箱保存至測定。

1.2.2.7 血清中阿維菌素濃度的測定 將各時間點(diǎn)采取的血清樣品按1.2.2.2方法處理后，取20μL進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出血清中阿維菌素的濃度。

1.2.2.8 藥物動力學(xué)參數(shù)計(jì)算 逐只山羊擬合藥時曲線，方差分析優(yōu)選模型，計(jì)算動力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖

對阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)其在254nm 處有最大吸收，故選擇254nm 為阿維菌素的檢測波長。阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖（圖1），出峰時間為3.117min，且峰型較好。

圖1 阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖Fig.1 The HPLC chromatogram of avermectin standard

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

結(jié)果表明，血清中阿維菌素在2.0ng／mL～150.0ng／mL濃度范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系，y＝1 555.8x＋222 353，r＝0.999 1。以血藥濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of avermectin

2.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

血清中阿維菌素高、中、低3種濃度的日內(nèi)變異系數(shù)均小于5%，日間變異系數(shù)均小于10%，符合要求，結(jié)果見表1。

2.4 回收率試驗(yàn)結(jié)果

血清中阿維菌素高、中、低3種濃度的回收率均在90%～110%之間，符合要求，結(jié)果見表2。

表1 血清中阿維菌素的精密度測定結(jié)果Table 1 The precision of avermectin in serum

表2 血清中阿維菌素的回收率測定結(jié)果Table 2 The recovery rate of avermectin in serum

2.5 血藥濃度結(jié)果

山羊皮下注射阿維菌素納米脂質(zhì)體后不同時間的血藥濃度結(jié)果見表3

2.6 藥時曲線方程

對5只山羊皮下注射阿維菌素納米脂質(zhì)體的藥時曲線血藥數(shù)據(jù)均符合一室模型，藥時曲線見圖3。

2.7 藥動學(xué)參數(shù)

山羊皮下注射阿維菌素納米脂質(zhì)體后的主要藥物動力學(xué)參數(shù)見表4。

3 討論

高效液相色譜法具有很高的特異性、靈敏度及較快的檢測速度［15］。適用于大分子、高沸點(diǎn)和熱穩(wěn)定性差的化合物。由于動物及其產(chǎn)品成分較為復(fù)雜，干擾性雜質(zhì)較多，采用該法檢測時，應(yīng)謹(jǐn)慎預(yù)處理待測樣品，以提高測定的靈敏度與準(zhǔn)確性。處理樣品時，在50 ℃水溫中用氮?dú)饬鞔蹈伤钑r間較短，有利于阿維菌素的穩(wěn)定［16］。因?yàn)榘⒕S菌素極易溶于乙酸乙酯，在回收率測定試驗(yàn)中，其回收率高達(dá)95%以上，所以樣品預(yù)處理的方法可靠。結(jié)果顯示，吸收半衰期t1／2Ka＝0.24±0.03d，消除半衰期t1／2Ke＝6.74±0.80d，最高藥物濃度Cm＝60.76±5.62ng／mL，藥時曲線下面積AUC＝664.35±28.14（ng／mL）·d，達(dá)峰時間tp＝1.20±0.08d，藥效可維持30d以上。說明該藥物在山羊體內(nèi)到達(dá)全身循環(huán)的總藥量較高，而且能再山羊體內(nèi)維持較長時間的有效血藥濃度。

表3 山羊皮下注射阿維菌素納米脂質(zhì)體后不同時間的血藥濃度Table 3 Serum concentration of avermectin in goats after subcutaneous injection of avermectin nanometre liposomes ng／mL

圖3 阿維菌素納米脂質(zhì)體藥時曲線圖Fig.3 The blood concentration-time curve of AVMNL

表4 阿維菌素納米脂質(zhì)體在5只健康山羊體內(nèi)的藥物動力學(xué)參數(shù)Table 4 The pharmacokinetics parameters of avermectin nanometer liposomes in five healthy goats

廣譜抗寄生蟲藥在體內(nèi)的持效時間取決于其在動物體內(nèi)的吸收、分布和血液／組織之間的分配。藥物在體內(nèi)吸收、分布和血液／組織之間的分配方面的細(xì)微變化都可能導(dǎo)致藥物在寄生蟲寄生部位濃度和維持時間的較大改變，進(jìn)而改變藥物的抗蟲活力與持效時間［17］。阿維菌素是脂溶性較高，經(jīng)納米脂質(zhì)體包封后，可達(dá)到延緩吸收的效果，并且長時間維持有效的血藥濃度。潘保良等［18］研究表明，普通阿維菌素注射液的維持有效血藥濃度的時間不足21d，而本試驗(yàn)測定阿維菌素納米脂質(zhì)體維持藥效可達(dá)30 d以上，表明納米脂質(zhì)體作為一種新型獸用藥物制劑，AVMNL的緩釋效果已初步確定，但對該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、藥效、體內(nèi)各個組織的分布狀況尚需要繼續(xù)研究。

［1］陳杖榴.獸醫(yī)藥理學(xué)［M］.3 版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2009：313-314.

［2］秦改曉，徐文彥，艾曉輝，等.單劑量口灌阿維菌素在草魚體內(nèi)的藥動學(xué)及殘留研究［J］.淡水漁業(yè)，2012，42（4）：47-52.

［3］Zhu Wen-jun，Li Ming，Liu Ci，et al.Avermectin induced liver injury in pigeon：Mechanisms of apoptosis and oxidatative stress［J］.Ecotoxicology and Environmental Safety，2013，98：74-81.

［4］易金娥，袁 慧，袁莉蕓，等.阿維菌素微囊對大鼠急性和亞慢性毒性試驗(yàn)［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29（2）：27-30.

［5］Chen L J，Sun B H，Qu J P，et al.Avermectin induced inflammation damage in king pigeon brain［J］.Chemosphere，2013，93（10）：2528-2534.

［6］Su W K，Hou Z N，Liang X R.Separation of avermectin components from streptomyces avemitilis extraction using highspeed counter-current chromatography［J］.Chemical Industry＆Chemical Engineering Quarterly，2013，19，4：563-571.

［7］劉耀川，趙 剛，寧 靜，等.阿維菌素的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2012（1）：60-62.

［8］李 銘，馮 偉，李 術(shù).阿維菌素類藥物對非靶動物毒理學(xué)的研究進(jìn)展［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，44（12）：126-130.

［9］陸 彬.藥物新劑型與新技術(shù)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1998：123-125.

［10］Peter S，Stefan W，Caroline H，et al.Membbrane protein reconstitution into liposomes guided by dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy［J］.Biophys Chem，2013，184：37-43.

［11］何繼紅，申屠芬琴.阿維菌素類藥物殘留分析技術(shù)研究進(jìn)展［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（5）：98-100.

［12］中國獸藥典委員會編.中華人民共和國獸藥典［M］.2010：88-89.

［13］王敏儒，陳杖榴，馮淇輝.伊維菌素微球在家兔體內(nèi)的藥動學(xué)［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，31（2）：171-178.

［14］扈洪波，朱蓓蕾，李俊鎖.阿維菌素類驅(qū)蟲藥的藥代動力學(xué)研究［J］.中國獸醫(yī)雜志，1998，24（5）：51-53.

［15］陳 曦 王觀悅 徐宗香，等.黏菌素HPLC 分析方法的研究進(jìn)展［J］.中國畜牧獸醫(yī)文摘，2012，28（6）：39-40.

［16］任志紅，孟 慧.酮康唑微囊在兔體內(nèi)的藥動學(xué)研究［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，27（7）：796-798.

［17］Alvinerie M，Sutra J F，Galtier P，et al.Pharmacokinetics of eprinomectin in plasma and milk following topical administration to lactating airy cattle［J］.Res Vet Sci，1999，67：229-232.

［18］潘保良，王玉萬，汪 明.阿維菌素長效注射液（油懸劑）與普通注射液在綿羊體內(nèi)的藥代動力學(xué)比較研究［J］.中國獸藥雜志，2003，37（3）：18-21.