關(guān) 團(tuán)，張 輝，王 震，孫志華，劉 娟，韓玉霞，王文華，江雅麗，陳創(chuàng)夫

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832003）

布魯菌?。˙rucellosis）簡稱布病，是由布魯菌（Brucella）引起的全世界范圍內(nèi)的人獸共患傳染?。?］。布魯菌是一種無芽胞革蘭陰性球桿菌，在微需氧環(huán)境下即可生存，是一種部分耐酸性細(xì)菌，沒有天然的質(zhì)體，無莢膜，會(huì)導(dǎo)致天然宿主持續(xù)感染的網(wǎng)狀系統(tǒng)疾病。該病主要特點(diǎn)是出現(xiàn)“波狀熱”，關(guān)節(jié)炎，心內(nèi)膜炎以及人腦膜炎和動(dòng)物的流產(chǎn)，如果治療不及時(shí)會(huì)發(fā)展為慢性感染［2］。目前接種疫苗是預(yù)防布魯菌傳播的最有效途徑，然而布魯菌的保護(hù)性抗原分子并不明確，細(xì)胞、體液免疫應(yīng)答低，相關(guān)研究至今仍無突破性進(jìn)展。近年來，具有抗原保護(hù)作用的布魯菌診斷抗原成為該菌的研究熱點(diǎn)，因此布魯菌外膜蛋白備受關(guān)注，其中 Ompl0、Omp19、Omp25、Omp31和bp26均為強(qiáng)免疫原性蛋白，并具有保守的DNA 序列［3］。在某些疫苗株中弱化或缺失bp26基因，對(duì)于鑒別自然感染和疫苗免疫具有重要的現(xiàn)實(shí)意義［4］。

二氫硫辛酰胺脫氫酶（DLDH）又稱二氫硫辛酸脫氫酶或硫辛酰胺脫氫酶，屬黃素蛋白氧化還原家族［5］，是組成3種α丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的必需組成成分［6］。其主要分布在動(dòng)物、植物或微生物的線粒體中，細(xì)胞質(zhì)膜上也部分存在該酶［7］。研究表明，二氫硫辛酰胺脫氫酶參與生物體的新陳代謝，并在代謝途徑中發(fā)揮重要功能，而且，二氫硫辛酰胺脫氫酶的生物學(xué)功能在不斷被發(fā)現(xiàn)［8-9］。據(jù)報(bào)道，在大腸埃希菌中，二氫硫辛酰胺脫氫酶參與了甘氨酸的降解，是降解體系的重要組成部分，具有依賴蛋白質(zhì)和輔酶Q 轉(zhuǎn)運(yùn)乳糖和麥芽糖的作用［10］。在Neisseria meningitidis中，二氫硫辛酰胺脫氫酶是免疫性表面抗原。張靜等［11］研究表明二氫硫辛酰胺脫氫酶可能與豬鏈球菌的黏附相關(guān)，已有大量研究報(bào)道表明在其他細(xì)菌中該酶作用在胞內(nèi)或質(zhì)膜上。關(guān)于布魯菌二氫硫辛酰胺脫氫酶的研究，僅見布魯菌BMEI 0145基因編碼二氫硫辛酰胺脫氫酶。本研究通過PCR 方法擴(kuò)增并表達(dá)羊種布魯氏菌043 株BMEI0145，為進(jìn)一步揭示二氫硫辛酰胺脫氫酶在布魯菌侵染宿主過程中的致病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸埃希菌（E.coli）DH5α和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；羊種布魯菌043分離株、pET-28a（＋）載體，由石河子大學(xué)新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、XhoⅠ，TaqDNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶、DNA Marker、蛋白Marker、pMD18-T 載體，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗羊IgG-HRP、蛋白Marker，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；IPTG，Merck 公司產(chǎn)品；布魯菌胰酶蛋白大豆培養(yǎng)基（TSA、TSB），BD 公司產(chǎn)品；布魯菌陽性血清，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank登錄的布魯菌（NC-003317）BMEI 0145基因序列和載體pMD18-T、pET-28a 的多克隆位點(diǎn)（multiple cloning site，MCS），應(yīng)用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物P1／P2，擴(kuò)增BMEI 0145 基因完整的ORF 閱讀框序列，下劃線部分分別為BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)（表1），引物的合成及序列的測(cè)定由北京華大基因公司完成。

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primers and sequences

1.2.2 目的基因的克隆與純化 以100 ℃熱滅活45min的羊種布魯菌043分離株為模板，PCR 方法擴(kuò)增BMEI0145基因片段。采用20μL PCR反應(yīng)體系：2×TaqMaster Mix（內(nèi)含TaqDNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2及反應(yīng)緩沖液和藍(lán)色染料）10 μL，上游引物P1（25μmol／L）0.2μL，下游引物P2（25μmol／L）0.2μL，模板2μL，補(bǔ)水至20μL；PCR反應(yīng)條件：95℃5min；94 ℃40s，63℃40s，72℃2 min 10s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃7min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行10g／L瓊脂糖凝膠電泳分析，使用瓊脂糖凝膠DNA 回收純化試劑盒純化回收目的基因，按產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 重組質(zhì)粒pMD18-T-BMEI 0145的構(gòu)建與測(cè)序 將純化的PCR 產(chǎn)物與pMD18-T 載體在16 ℃條件下連接過夜，轉(zhuǎn)化E.coliDH 5α感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于氨芐青霉素抗性的LB 固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)16h，挑取生長良好的單克隆菌落，菌液PCR 篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒并進(jìn)行BamHⅠ／XhoⅠ雙酶切鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pMD18-T-BMEI 0145。

1.2.4 重組表達(dá)載體pET-28a-BMEI 0145的構(gòu)建與鑒定 使用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pMD18-T-BMEI 0145和表達(dá)載體pET-28a，37 ℃酶切4h；經(jīng)10g／L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收BMEI 0145基因片段和pET-28a酶切產(chǎn)物。將回收的BMEI 0145目的基因與表達(dá)載體pET-28a于16 ℃過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH 5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于卡那霉素抗性的LB 培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12h～18h，挑取生長良好的單菌落進(jìn)行陽性篩選，對(duì)篩選的菌落進(jìn)行PCR 和雙酶切篩選鑒定陽性克隆，對(duì)鑒定正確的重組質(zhì)粒送華大公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pET-28a-BMEI 0145。將pET-28a-BMEI 0145質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL 21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布于卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h～18h，挑取生長良好的單菌落，篩選陽性克隆。

1.2.5 重組蛋白His-BMEI 0145的誘導(dǎo)表達(dá) 將陽性克隆接種到含有卡那霉素抗性（100 mg／L）的LB 液體培養(yǎng)基 中，37 ℃、200r／min搖菌過夜。吸取200μL菌液接種到20mL 含卡那抗性的LB 液體培養(yǎng)基中，37℃、180r／min培養(yǎng)至OD 600nm 為0.4～0.6，加入終濃度為1.0mmol／L的IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，分別于0、2、4、6、8h取樣。同時(shí)設(shè)空載體和未加IPTG 誘導(dǎo)的重組菌作為對(duì)照。

1.2.6 重組蛋白His-BMEI 0145的Western blot分析 將收集的菌液，12 000r／min離心2min后棄上清，加入80μL去離子水和20μL 5×上樣緩沖液懸浮菌體，煮沸10 min，進(jìn)行120g／L SDS-APGE電泳。使用考馬斯亮藍(lán)染色鑒定BMEI 0145蛋白的表達(dá)。使用半干式電轉(zhuǎn)印儀，將SDS-PAGE 凝膠上的蛋白樣品轉(zhuǎn)印到0.45μm NC 膜上（200 mA，60min）；用Western blot膜封閉液封閉1h；TBST洗滌3次，每次10min；加入1∶500稀釋的布魯菌陽性血清，37 ℃孵育1h；TBST 洗滌3次，每次10 min；加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗羊IgG，孵育1h；TBST 洗滌3次，每次10 min；加入DAB底物顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)；顯色完成后使用水終止。

2 結(jié)果

2.1 BMEI 0145基因的擴(kuò)增、克隆及酶切鑒定

用P1／P2引物擴(kuò)增BMEI0145基因，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到約1404bp的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。將其克隆到pMD18-T 載體中，轉(zhuǎn)化E.coliDH 5α，提取克隆質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ／XhoⅠ雙酶切鑒定（圖2），并對(duì)陽性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析，表明本試驗(yàn)獲得的BMEI 0145基因片段的長度及序列與布魯菌BMEI 0145基因一致。

圖1 BMEI 0145基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplication results of BMEI 0145gene

圖2 pMD18-T-BMEI 0145雙酶切鑒定Fig.2 The enzyme digestion identification of recombinant plasmid PMD18-T-BMEI 0145

2.2 pET-28a-BMEI 0145原核重組表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pET-28a 質(zhì)粒和pMD18-T-BMEI 0145質(zhì)粒，并回收pET-28a載 體片段和BMEI 0145基因片段，將回收片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH 5α感受態(tài)細(xì)胞。篩選陽性重組菌，提取質(zhì)粒；重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切得到1 404bp 的目的條帶和5369bp的pET-28a 載體片段（圖3）。結(jié)果表明pET-28a-BMEI 0145原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE檢測(cè)

將鑒定正確的pET-28a-BMEI 0145重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性重組菌，后經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析結(jié)果表明，重組BMEI 0145蛋白分子質(zhì)量約為62ku（圖4），與理論值相符合，目的蛋白在4h時(shí)的表達(dá)量最高。

圖3 pET-28a-BMEI 0145雙酶切鑒定Fig.3 The enzyme digestion identification of recombinant plasmid pET-28a-BMEI 0145

圖4 重組蛋BMEI 0145的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant protein BMEI 0145

2.4 BMEI 0145基因表達(dá)產(chǎn)物Western blot分析

將重組蛋白轉(zhuǎn)至NC 膜，采用布魯菌陽性血清作為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗羊抗體為二抗進(jìn)行免疫印跡分析。Western blot結(jié)果表明誘導(dǎo)后在62ku的位置上有一條特異的反應(yīng)條帶，與理論分析值相符合（圖5）；表明重組蛋白與抗布魯菌抗體發(fā)生特異性反應(yīng)；說明重組的BMEI 0145蛋白與相應(yīng)天然蛋白具有相同的抗原性。

3 討論

布魯菌是兼性胞內(nèi)寄生菌，可引發(fā)全球范圍內(nèi)人和牲畜及野生哺乳動(dòng)物的感染，引起人獸共患慢性傳染病，也是當(dāng)前生物武器研究的熱點(diǎn)［12］。布魯菌引發(fā)的傳染性疾病和巨大的經(jīng)濟(jì)損失已經(jīng)引起全世界的關(guān)注。人一旦得了該病，目前尚無徹底根治的方法。目前預(yù)防和控制布魯菌病的主要手段仍然是接種減毒活疫苗，然而減毒活疫苗可能存在毒力回復(fù)、隱性感染以及返祖現(xiàn)象等危險(xiǎn)［13］。因此，研發(fā)新型的更安全的布魯菌疫苗已經(jīng)是當(dāng)前學(xué)者共同追求的方向。細(xì)菌黏附和入侵在細(xì)菌與宿主細(xì)胞相互作用中是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，而且是介導(dǎo)細(xì)菌感染的首要條件。與其他細(xì)胞內(nèi)寄生細(xì)菌一樣，布魯菌感染宿主細(xì)胞需經(jīng)過黏附、侵入、運(yùn)輸、復(fù)制、傳播等多個(gè)步驟。因此，研究布魯菌的黏附和入侵對(duì)揭示布魯菌致病機(jī)制有一定的幫助。

圖5 重組蛋白pET-28a-BMEI 0145的Western blot分析Fig.5 Western blot analysis of recombinant proteinpET-28a-BMEI 0145

二氫硫辛酰胺脫氫酶（DLDH）是黃素蛋白氧化還原家族的一種，是組成3種α丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的必需組成部分。其大部分存在于大多數(shù)生物的線粒體中，少部分存在于質(zhì)膜上。由于二氫硫辛酰胺脫氫酶在生物體代謝途徑中的重要作用，目前關(guān)于二氫硫辛酰胺脫氫酶的生物學(xué)功能不斷有新的發(fā)現(xiàn)。據(jù)報(bào)道，大腸埃希菌二氫硫辛酰胺脫氫酶是甘氨酸降解體系的組成部分，具有依賴蛋白質(zhì)和輔酶Q 轉(zhuǎn)運(yùn)乳糖和麥芽糖的作用，該酶在腦膜炎奈瑟菌中是免疫性表面抗原，張靜等研究表明二氫硫辛酰胺脫氫酶可能與豬鏈球菌的黏附相關(guān)。該酶均作用在胞內(nèi)或質(zhì)膜上，該酶分泌至胞外顯然有其特殊的生理功能。二氫硫辛酰胺脫氫酶廣泛存在于動(dòng)物器官、植物組織、原生動(dòng)物及多種微生物中［14］，在代謝途徑中發(fā)揮著重要的作用，對(duì)細(xì)菌的致病性存在重要的意義，但在人獸共患病原微生物尤其是布魯菌尚未報(bào)道。

由于二氫硫辛酰胺脫氫酶在豬鏈球菌中為膜蛋白，而多種細(xì)菌的膜蛋白已被證明參與細(xì)菌黏附宿主細(xì)胞的過程，如腦膜炎球菌以及某些致病性大腸埃希菌的黏附作用就是由外膜蛋白決定的［15-16］。同樣布魯菌Omp10等外膜蛋白已在相關(guān)的研究中進(jìn)行了報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)融合蛋白能夠被布魯菌感染陽性血清特異性識(shí)別，而載體蛋白與陽性血清并不能產(chǎn)生反應(yīng)，證明該蛋白具有良好的抗原性。當(dāng)然二氫硫辛酰胺脫氫酶在布魯菌致病機(jī)理中的具體功能，還需進(jìn)一步的研。

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