張 濤，徐 娟，楊鳳梅，秦曉峰，程根宏，和占龍＊

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院／北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所系統(tǒng)醫(yī)學(xué)中心，北京100005；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院／北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明650118）

流行性感冒（簡稱流感）是由流感病毒（Influenza virus，IFV）引起的一種急性呼吸道傳染病，嚴(yán)重危害人類健康和生命［1-4］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在流感病毒研究中是非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，選擇合適的動(dòng)物模型及正確規(guī)范的操作對(duì)于病毒實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果的科學(xué)性和準(zhǔn)確性尤為關(guān)鍵［5-7］。

雪貂（ferret）是目前最為敏感的IFV 感染動(dòng)物模型，很容易感染人流感病毒，形成與人類相似的流感癥狀，經(jīng)過鼻內(nèi)接種感染后會(huì)出現(xiàn)體溫升高，并出現(xiàn)如打噴嚏、流涕、活動(dòng)度降低等呼吸道癥狀。能夠檢測相關(guān)臨床參數(shù)，如溫度，脈搏，呼吸頻率，獲得相對(duì)大量的血清用于血清學(xué)和抗原特性研究。目前已廣泛用于流感病毒機(jī)制、傳播和疫苗評(píng)價(jià)等多方面研究［8-10］。國內(nèi)目前有建立雪貂流感病毒模型的研究，但對(duì)于雪貂的具體實(shí)驗(yàn)操作尚無報(bào)道［11-12］。我們通過實(shí)驗(yàn)過程中獲得的經(jīng)驗(yàn)并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)雪貂在流感研究中的常規(guī)操作進(jìn)行探索性研究，探討建立標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)操作程序，為研究提供規(guī)范的操作方法，保證獲得客觀準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)果。

1 材料

1.1 動(dòng)物

雪貂，來源于有動(dòng)物飼養(yǎng)繁殖許可證單位，年齡6月齡～8月齡，體重在800g～1 200g。性別選擇無固定要求，盡量選擇同性別雪貂。注意：①需有供應(yīng)商提供流感病毒抗體陰性（如H1N1，H3N2和B型流感病毒等）檢測報(bào)告，或者試驗(yàn)單位對(duì)提供動(dòng)物進(jìn)行相應(yīng)檢測達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求；②購買的雪貂需進(jìn)行7d～15d隔離觀察，進(jìn)行體溫的測量和相關(guān)流感病毒抗體的檢測，滿足試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方可開展實(shí)驗(yàn)研究。

1.2 儀器和設(shè)備

昆明動(dòng)物生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供；生物安全柜，USA Thermo公司產(chǎn)品；獨(dú)立通風(fēng)負(fù)壓（溫度20 ℃，濕度50%～60%，壓差10Pa～15Pa）生物隔離籠具，蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司產(chǎn)品；電子天平，Germany Sartorius公司產(chǎn)品；電子體溫計(jì)，Japan Omron公司產(chǎn)品。

研究中人員防護(hù)嚴(yán)格按照國家農(nóng)業(yè)部和衛(wèi)生部頒布的病原微生物實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范執(zhí)行。

2 實(shí)驗(yàn)程序

2.1 雪貂的抓取和固定

操作者一只手抓住雪貂的頸背部，將其四肢懸空進(jìn)行固定（圖1），另一只手托住雪貂的臀部和四肢（圖2），大多數(shù)雪貂在這種保定姿勢下會(huì)比較放松和配合，另一名操作者可輕撫雪貂腹部和背部，降低雪貂的緊張情緒。雪貂具有鋒利的牙齒，如果沒有正確的抓取和有效的防護(hù)，能夠?qū)Σ僮髡邘硪欢ㄎｋU(xiǎn)，用厚皮革、紡綸或金屬網(wǎng)手套操作進(jìn)行保護(hù)和防止受到動(dòng)物的攻擊。

圖1 雪貂的固定和抓取Fig.1 Holding and grabing of ferret

圖2 雪貂的抓取和麻醉Fig.2 The grabing and anesthesia of ferret

2.2 雪貂的麻醉

麻醉劑的配方和用量如表1所示［13］，使用配制的麻醉劑為舒泰50和速眠新Ⅱ，將舒泰50和速眠新Ⅱ按照1∶5 的體積比進(jìn)行混合，每只雪貂使用0.05mL／kg～0.08mL／kg體重的麻醉劑量。操作者按照上述方式抓取雪貂將其仰臥，麻醉人員用700mL／L酒精在雪貂大腿內(nèi)側(cè)（麻醉注射區(qū)域見圖2）消毒，將麻醉劑注入到大腿肌肉組織中。每只雪貂注射0.08 mL 麻醉劑，觀察雪貂眼睛活動(dòng)、四肢的松弛來確定是否完全麻醉。為了避免交叉感染，每次需操作和麻醉1只雪貂。注意：①雪貂取血或處死時(shí)需進(jìn)行深度麻醉，采取注射麻醉方法，保證對(duì)雪貂的操作具有足夠的時(shí)間，同時(shí)需嚴(yán)格控制麻醉劑量，盡量減少過度麻醉對(duì)雪貂和試驗(yàn)驗(yàn)帶來的影響；②麻醉劑需要專人負(fù)責(zé)管理，提前配制好足夠使用的麻醉劑，麻醉操作至少需要2 人～3 人配合進(jìn)行。經(jīng)驗(yàn)：①由于個(gè)體差異，同體重雪貂在該劑量下也出現(xiàn)耐受情況，如雪貂仍未麻醉，適當(dāng)增加麻醉劑，等待2min～3 min即可；②研究統(tǒng)計(jì)顯示雪貂在該劑量下維持麻醉時(shí)間約為45min～90min，該劑量能保證對(duì)雪貂有效的麻醉，同時(shí)不會(huì)產(chǎn)生過度麻醉導(dǎo)致雪貂長時(shí)間不能蘇醒。

2.3 雪貂的采血和血清分離

對(duì)雪貂使用前腔靜脈采血，一次采血不能超過10%的動(dòng)物血液量［13］。在研究中我們采用易操作、成功率較高的心臟采血（圖3）。將雪貂按上述方式抓取和麻醉，仰臥平放在生物安全柜內(nèi)的操作盤中，使用電推剪將雪貂從脖子下沿胸骨剃剪干凈，用手探明心臟搏動(dòng)最強(qiáng)部位，通常在胸骨左緣的正中，位于倒數(shù)第二、三肋骨中間。采血部位用700 mL／L酒精擦拭消毒，使用1 mL 一次性注射器垂直緩慢刺入心臟，緩慢拔針并回抽，直到血開始填充注射器，收集所需血量后，拔出針頭，使用消毒脫脂棉輕壓注射部位止血。小心將血液轉(zhuǎn)移到血清分離管，室溫靜止30min以上，10 000r／min離心5min，分離血清轉(zhuǎn)至另一干凈離心管中，-20 ℃保存。經(jīng)驗(yàn)：①實(shí)際操作顯示雪貂前腔靜脈血管較細(xì)，頸部皮膚較疏松，針頭容易滑落，沒有經(jīng)過大量練習(xí)操作前腔靜脈采血不易成功，由于雪貂較貴，一般實(shí)驗(yàn)室難以大量練習(xí)；②研究顯示雪貂每周一次心臟采血0.5 mL～0.6mL，連續(xù)采血不超過2月，對(duì)雪貂健康狀況和體征指標(biāo)無明顯影響。

表1 麻醉劑配方和用量Table 1 The formulation and dosage of anesthetics

圖3 雪貂的心臟采血Fig.3 Heart blood collection in ferret

2.4 雪貂的接種和鼻洗液收集

雪貂在清醒狀態(tài)能夠通過打噴嚏排斥接種，雪貂在輕度麻醉后鼻內(nèi)接種，病毒能夠完全被攝入［13］。在我們的研究中提前準(zhǔn)備所需的足夠病毒量（通常準(zhǔn)備1個(gè)～2 個(gè)額外的劑量），將病毒液放在冰袋或碎冰上，使其保持低溫狀態(tài)。使用1 mL移液器吸取500μL病毒液，將雪貂按上述方式固定和麻醉，將一側(cè)鼻孔向上，使用移液器緩慢逐滴滴入鼻腔接種250μL 病毒液，借助雪貂的呼吸，病毒可以快速的被完全被吸入，更換另一側(cè)鼻孔接種250 μL病毒液（圖4）。研究顯示，雪貂單側(cè)鼻腔接種500μL 病毒液，也能夠完全吸入。雪貂鼻洗液收集過程中，使用1.5 mL 離心管，每管提前準(zhǔn)備好0.5mL～1mL含5 000單位雙抗／mL pH7.2的無菌PBS，將雪貂固定好，頭下尾上，頭部側(cè)置，鼻孔下方放置無菌平皿（圖5），將洗液緩慢從一個(gè)鼻孔注入，洗液會(huì)順著鼻腔或從另一個(gè)鼻孔流出，平皿收集。收集的鼻洗液盡快放置于-80 ℃冰箱保存，待檢測。由于雪貂對(duì)于鼻部刺激較為敏感，接種和鼻洗液收集時(shí)頭部需要較好的固定。經(jīng)驗(yàn)：一般最終收集的鼻洗液體積為洗液體積的70%～80%，需提前準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)需要的相應(yīng)體積洗脫液。

圖4 雪貂的鼻內(nèi)接種Fig.4 Intranasal inoculation in ferret

圖5 雪貂鼻洗液收集Fig.5 Nasal wash collection in ferret

2.5 雪貂的體溫體重測量和臨床癥狀觀察

雪貂體溫體重的測量均在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，由于動(dòng)物體溫和體重在1d內(nèi)存在一定的波動(dòng)，需要在每天的同一時(shí)刻進(jìn)行測量。體重的測量時(shí)將雪貂從籠具內(nèi)取出放于電子秤上保持讀數(shù)靜止3s以上進(jìn)行記錄（精確度0.01kg）。我們對(duì)于不同組別體重記錄結(jié)果顯示季節(jié)性H1N1亞型流感病毒的感染對(duì)于雪貂體重的影響并不明顯（P＞0.05）。

雪貂體溫測量時(shí)通過雪貂皮下植入芯片，利用芯片讀數(shù)讀取動(dòng)物體溫?cái)?shù)值［13］。在我們的實(shí)驗(yàn)中，將甘油潤滑后的電子體溫計(jì)插入雪貂直腸，保持體溫計(jì)讀數(shù)5s～10s無變化進(jìn)行記錄（圖6）。經(jīng)驗(yàn)：①使用電子體溫計(jì)檢測操作簡便快捷、數(shù)值穩(wěn)定、記錄準(zhǔn)確，對(duì)雪貂無影響；②結(jié)果顯示，雪貂接種流感病毒后1d～2d體溫會(huì)升高，隨后恢復(fù)正常。雪貂的正常溫度范圍是37.8 ℃～40 ℃，平均溫度是38.8 ℃。

雪貂感染流感病毒后的臨床癥狀評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)在國際上使用較多的是表2，主要觀察雪貂鼻部癥狀和活動(dòng)能力［13-14］，在試驗(yàn)中，通過在體重體溫測量時(shí)近距離觀察鼻部癥狀及在籠具內(nèi)長時(shí)間觀察活動(dòng)度。經(jīng)驗(yàn)：①根據(jù)我們的觀察和多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道顯示，季節(jié)性流感病毒感染雪貂后，多數(shù)雪貂的臨床癥狀并不明顯［14］，我們從鼻部癥狀觀察多數(shù)雪貂感染后會(huì)出現(xiàn)鼻鏡干燥，不斷用舌頭舔鼻現(xiàn)象，部分雪貂觀察到流涕，較少的能夠觀察到打噴嚏。由于雪貂本身特性致其鼻部抽吸及活躍度指標(biāo)使其不易觀察和判斷；②在研究中，我們認(rèn)為雪貂鼻鏡干燥和使用舌頭舔鼻頻率也能夠作為流感病毒感染癥狀之一，納入臨床癥狀評(píng)價(jià)體系。

圖6 雪貂的體溫測量Fig.6 Temperature measurement in ferret

表2 雪貂感染后臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Clinical sign scoring standrd in ferret

2.6 雪貂的處死和組織收集

雪貂在剖檢、取樣前必需執(zhí)行安樂死。雪貂首先需被注射麻醉后，通過心臟穿刺注射安樂死EuthanasiaⅢ溶液（每毫升包含的活性成分為390mg戊巴比妥鈉和50 mg苯妥英鈉）［13］。在安樂死前，麻醉后的雪貂可以通過心臟穿刺收集大量血液。我們?cè)谘芯恐惺褂?.4mL 劑量麻藥注射雪貂大腿肌肉，雪貂1min～2min內(nèi)迅速深度麻醉，使用20mL或50 mL 注射器，心臟穿刺大量采血50 mL～60mL（圖2）。研究顯示，雪貂注射相應(yīng)劑量麻醉劑后，1min～2min內(nèi)雪貂能夠迅速死亡，不需再注射安樂死溶液。正確收集雪貂的組織樣本對(duì)于分析非常重要，需使用單獨(dú)的器械收集不同組織樣品，不同動(dòng)物／組織之間用酒精消毒（將要收集的組織所需要器具放在含700 mL／L 酒精燒杯中消毒，每個(gè)組織單獨(dú)放入一個(gè)燒杯中）。用無菌紗布輕拭檫凈血液和組織，將采集組織放入預(yù)先稱重和標(biāo)記清晰的收集管內(nèi)并盡快凍存。對(duì)于雪貂組織先收集理論上病毒含量低的組織，如腦、心、肝脾腎組織在肺和鼻甲骨之前進(jìn)行，使高病毒含量器官造成的污染降低到最小。我們的研究主要檢測肺部和鼻甲骨病毒含量，文獻(xiàn)顯示鼻甲骨病毒含量多高于肺部，因此先收集肺部組織［13］。700 mL／L 酒精將胸部區(qū)域消毒，用剪刀將肋部皮膚切除，干凈剪刀剪開胸部，鑷子夾起使其遠(yuǎn)離胸腔（圖7，圖8）。打開胸腔，用剪刀和干凈鑷子移除肺部和心臟將其放在干凈的平皿上。使用手術(shù)剪切除部分左下或右下肺葉，放入預(yù)先稱重和標(biāo)記的收集管中，放入-80 ℃凍存待用。鼻甲骨收集按照文獻(xiàn)［13］進(jìn)行操作，使用解剖刀切除鼻子頂部軟骨和軟組織，將刮匙插入每一個(gè)鼻孔，挖出鼻甲放入標(biāo)記好的15mL 試管中，盡快凍存于-80℃待用。其他組織的收集也需避免樣本間的交叉污染及器具的消毒。如果組織需要固定進(jìn)行病理學(xué)研究，采集的樣本應(yīng)小于1cm 厚，以便有足夠的福爾馬林滲透。組織放入固定液之前用PBS輕輕漂洗或用紗布輕拭除凈多余的血，固定劑的量至少是采集組織體積（V／V）的15 倍～20倍，室溫放置1 周后方可進(jìn)行試驗(yàn)。注意：①我們?cè)谘芯恐胁僮鞯脑瓌t是盡量避免交叉污染，按病毒滴度從低到高進(jìn)行收集。先收集陰性對(duì)照組雪貂，依次收集高滴度感染組雪貂；②用于病毒滴度和組織病理學(xué)試驗(yàn)樣本需來自同一動(dòng)物。

圖7 雪貂的胸腔剖檢Fig.7 The anatomy of thoracic cavity of ferret

圖8 雪貂的胸腔打開Fig.8 Opening the thoracic cavity of ferret

3 討論

作為流感病毒研究常用的動(dòng)物模型，雪貂和小鼠相比體型較大，易于監(jiān)測體溫、脈搏和呼吸頻率，感染病毒能夠出現(xiàn)和人類似的流涕、咳嗽等臨床癥狀，在觀察和檢測上具有較大的優(yōu)勢［15-19］，已廣泛用于流感病毒傳播、致病機(jī)理、疫苗開發(fā)和藥物評(píng)價(jià)的各個(gè)方面［20-22］。雖然國外對(duì)流感病毒的雪貂試驗(yàn)操作有詳細(xì)的報(bào)道，但實(shí)際操作和觀察中仍有許多需要注意的方面。國內(nèi)相關(guān)的研究報(bào)道較少，且主要集中在模型制備上［11-12］，沒有涉及雪貂麻醉、采血和剖檢及樣品收集等詳細(xì)操作。由于雪貂對(duì)病毒易感，且價(jià)格昂貴、體型較大，進(jìn)一步加大了后續(xù)研究者的試驗(yàn)難度。本研究針對(duì)其他報(bào)道中沒有涉及但對(duì)試驗(yàn)結(jié)果具有重要影響的環(huán)節(jié)，如在麻醉劑選擇、劑量和麻醉后蘇醒時(shí)間、不同途徑采血方式的比較及對(duì)雪貂影響、感染后臨床癥狀觀察及如何剖檢和收集樣品方面進(jìn)行詳細(xì)介紹并結(jié)合實(shí)際經(jīng)驗(yàn)提出可行的操作方案，對(duì)于其他研究者具有重要的指導(dǎo)和參考價(jià)值。此外，在流感病毒的雪貂試驗(yàn)中如何有效的避免感染是一個(gè)非常關(guān)鍵的問題。由于雪貂較大且易感，在不同動(dòng)物之間，及對(duì)環(huán)境和操作人員容易造成感染，因此操作人員必須進(jìn)行正確規(guī)范的操作，盡量減少污染和感染的危險(xiǎn)，確保人員的安全和研究結(jié)果的客觀準(zhǔn)確。此外，操作者需要在工作中提高避免感染和污染的意識(shí)，對(duì)于試驗(yàn)細(xì)節(jié)需要在工作中綜合考慮，如清理糞便、更換飲水飼料等飼喂工作以及體溫、體重測量，采血和剖檢等試驗(yàn)操作時(shí)均應(yīng)首先處理空白對(duì)照組，其次為低劑量感染組，最后是高劑量感染組。盡量避免飲水，飼料以及器材等帶來相互污染的可能。同時(shí)不同劑量組間和組內(nèi)個(gè)體間也需要充分的消毒，包括籠具和儀器的消毒，也包括操作人員自身的消毒?？傊?，按照本研究報(bào)道的操作步驟，提前設(shè)計(jì)并充分考慮影響試驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和因素，能夠有效降低在試驗(yàn)的誤差和污染，在獲得客觀、準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)果的同時(shí)有效提高研究的效率。

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