魏 麗，鄧興梅，蔣建軍，剡根強(qiáng)，馬 勛，王鵬雁

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子832003）

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）為革蘭陽性短桿菌，引起人和動(dòng)物的李氏桿菌病。它可穿越人和動(dòng)物腸屏障、血胎屏障及血腦屏障，在臨床上引起腦膜炎、腦膜腦炎、敗血癥及孕畜（婦）流產(chǎn)等疾病，感染后臨床表現(xiàn)為腦膜腦炎、敗血癥和流產(chǎn)等癥狀［1］，被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為四大食源性致病菌之一［2-3］。

LM 為兼性胞內(nèi)寄生菌，可黏附、侵襲宿主細(xì)胞，并具有在胞內(nèi)增殖的特性，InlB為其所特有的內(nèi)化素，由inlA、B 基因 編碼，inlB 基因全長為1 893 bp，其中編碼InlB 的最大開放閱讀框?yàn)?50bp［4］，包含630個(gè)氨基酸。其結(jié)構(gòu)從N 端到C 端分別為信號(hào)肽序列、LRR 重復(fù)區(qū)、IR 重復(fù)區(qū)、B 重復(fù)區(qū)和GW 重復(fù)區(qū)［5］。GW 可介導(dǎo)InlB與細(xì)胞脂磷壁酸的相互作用，LRR 和B重復(fù)區(qū)也參與InlB與靶細(xì)胞的相互作用［6］，如肝細(xì)胞生長因子受體（Met）在LRR的凹陷部與InlB結(jié)合等。LM 建立感染的前提是通過InlA、InlB 和p60 蛋白等的黏附作用進(jìn)入宿主細(xì)胞［7］，即其導(dǎo)致感染性疾病癥狀的嚴(yán)重程度部分上依賴于內(nèi)化素蛋白入侵上皮細(xì)胞的能力［8］。內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成血腦屏障的主要結(jié)構(gòu)，病原體侵入毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞可能是其穿越血腦屏障的一種重要方式，如大腸埃希菌（引起細(xì)菌性腦炎型）通過血腦屏障侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。LM90菌株是新疆致綿羊腦炎分離株，感染導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀較為明顯，本研究通過同源重組構(gòu)建inlB 基因缺失株（LM90-△inlB），對(duì)缺失株的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為探討LM 的毒力因子InlB在致病力和穿越血腦屏障過程中的具體作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 新疆致綿羊腦炎分離株單增李斯特菌LM90，由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存，血清型為4b 型；pKSV7穿梭質(zhì)粒，浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院分子微生物與食品安全實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；pMD19-T，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑Taqplus DNA 聚合酶、dNTP Mix，上海東盛公司產(chǎn)品；pfuTaq酶，康為公司產(chǎn)品；DNA 回收試劑盒，諾維森公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒，天根公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶（EcoR Ⅰ、HindⅢ），寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；青霉素G、氨卡青霉素和氯霉素、溶菌酶，Promega 公司產(chǎn)品；BHI培養(yǎng)基，BD 公司產(chǎn)品；鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（MBMEC），廣州吉妮歐生物科技有限公司產(chǎn)品；高糖DMEM，Hyclone公司產(chǎn)品；FBS，Gibco 公司產(chǎn)品。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8 周齡健康昆明系小鼠由石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.4 引物 表1為本試驗(yàn)中用到引物，由北京華大基因公司合成。其中，90-inlB-a、90-inlB-b用于擴(kuò)增上游同源臂；90-inlB-c、90-inlB-d用于擴(kuò)增下游同源臂；90-inlB-JC-a、90-inlB-JC-b 用于缺失株的鑒定；hly-1、hly-2用于4b血清型LM 特異性鑒定。

表1 PCR 引物及擴(kuò)增片段大小Table 1 PCR primers and sizes of products

1.2 方法

1.2.1 inlB基因缺失株LM90-△inlB的構(gòu)建

1.2.1.1 inlB 基因缺失片段的獲得和穿梭重組質(zhì)粒的構(gòu)建 煮沸法提取LM90的基因組DNA，以其為模板，用高保真pfu酶及引物90-inlB-a和90-inlB-b擴(kuò)增得到inlB上游同源臂，用引物90-inlB-c和90-inlB-d擴(kuò)增得到inlB 下游同源臂。再以上下臂為模板進(jìn)行第一步融合后，用引物90-inlB-a 和90-inlB-d通過基因重疊延伸PCR 的方法獲得inlB 目的基因缺失盒△inlB。

膠回收△inlB 后連接到pMD19-T，命名為T-△inlB，然后轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH 5α 中。菌液PCR 篩選陽性克隆，并提取T-△inlB 質(zhì)粒進(jìn)行酶切。鑒定后，送華大基因測序驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確的T-△inlB重組質(zhì)粒，用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后，回收△inlB 目的片段，同時(shí)用EcoR Ⅰ和HindⅢ雙酶切穿梭質(zhì)粒pKSV7，最后用T4 連接酶將△inlB片段和酶切后的pKSV7載體片段連接，即將△inlB 亞克隆于pKSV7，獲得重組的穿梭質(zhì)粒pKSV7-△inlB。

1.2.1.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備 參照文獻(xiàn)［10］單增李斯特菌感受態(tài)細(xì)胞制備方法進(jìn)行。

1.2.1.3 電轉(zhuǎn)化和同源重組 將構(gòu)建好的穿梭質(zhì)粒pKSV7-△inlB通過電轉(zhuǎn)的方法（2.5kV，5 ms）轉(zhuǎn)入LM90感受態(tài)細(xì)胞中，30 ℃培養(yǎng)48h后，篩選并獲得陽性克隆。將陽性克隆在41 ℃和10μg／mL氯霉素的雙重壓力下進(jìn)行傳代培養(yǎng)，約18代后，將末代細(xì)菌培養(yǎng)物劃線接種到氯霉素抗性平板上，41℃過夜培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落。用90-inlB-JC-a和90-inlB-JC-b引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，篩選出不含inlB 基因的氯霉素抗性的缺失株。再將其置于30 ℃無氯霉素抗性BHI培養(yǎng)基傳28 代左右后鋪板（無抗BHI），30℃過夜，進(jìn)行抗氯霉素和不抗氯霉素篩選。獲得無氯霉素抗性的缺失株，即確認(rèn)為LM90-△inlB缺失株。

1.2.1.4 缺失株LM90-△inlB 的鑒定及遺傳穩(wěn)定性測定 用檢測引物90-inlB-JC-a和90-inlB-JC-b進(jìn)行PCR 擴(kuò)增鑒定，親本株預(yù)期片段為1 500bp，缺失株預(yù)期擴(kuò)增片段為750bp；同時(shí)將該菌接種于氯霉素抗性和非抗性BHI中，進(jìn)行確定是否不含氯霉素抗性。將上述得到的重組缺失菌株在無氯霉素37℃條件下傳代培養(yǎng)20代，同時(shí)用菌液PCR 進(jìn)行鑒定，以檢測重組株LM90-△inlB 是否發(fā)生重組不完全，并確定重組菌具有遺傳穩(wěn)定性。

1.2.2 LM90 和LM90-△inlB 的LD50測定將LM90和LM90-△inlB均于37℃，180r／min搖床培養(yǎng)至OD 595≈0.40時(shí)，分別離心收集細(xì)菌，用PBS清洗2遍后再將細(xì)菌懸浮液進(jìn)行梯度稀釋。將試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為5 組，每組5只，進(jìn)行腹腔注射，接種量0.2 mL／只；對(duì)照組腹腔注射滅菌PBS，0.2 mL／只。連續(xù)觀察10d，用寇氏法計(jì)算LD50。

1.2.3 LM90 和LM90-△inlB 小鼠肝、脾、腦細(xì)菌計(jì)數(shù) 將試驗(yàn)小鼠分成兩組，每組8只。將LM90和LM90-△inlB，37 ℃，180r／min 搖床培養(yǎng)16h至OD595≈0.3，腹腔注射，接種量為0.2 mL／只。注射菌液后分別在24、48、72h時(shí)各取2只，在無菌條件下摘取肝、脾、腦，研磨均勻后，梯度稀釋，然后涂布至BHI固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)24h，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。同時(shí)將組織直接接種于BHI液體進(jìn)行培養(yǎng)，用于PCR檢測。

1.2.4 親本株LM90和缺失株LM90-△inlB 耐酸耐堿生長曲線測定 分別挑取LM90 和LM90-△inlB單個(gè)菌落于BHI過夜培養(yǎng)（約16h）至穩(wěn)定期OD595≈0.4，取100μL 至5mL BHI（不同pH）培養(yǎng)基做50 倍稀釋。每孔加入200μL 菌液至96孔板，設(shè)3 個(gè)平行。置酶標(biāo)儀中，OD595 連續(xù)讀數(shù)12h。

1.2.5 溶血試驗(yàn) LM90親本株與缺失株分別在兔全血或綿羊全血BHI瓊脂平板上劃線培養(yǎng)觀察其溶血特性。

1.2.6 MBMEC黏附、侵襲和增殖試驗(yàn)

1.2.6.1 對(duì)MBMEC 黏附測定 于12 孔板中傳代培養(yǎng)鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（MBMEC），37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2，至單層細(xì)胞為80%（細(xì)胞的密度為5×105／mL）左右，將過夜培養(yǎng)的LM90和LM90-△inlB稀釋為約107，每孔0.5mL。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h后，用PBS洗2遍，加入1 mL／L 的TritonX-100裂解15min。裂解后10倍系列稀釋，BHI固體培養(yǎng)基上，37 ℃條件下培養(yǎng)24h，進(jìn)行細(xì)菌平板計(jì)數(shù)。

1.2.6.2 對(duì)MBMEC 侵襲測定 用以上相同方法感染細(xì)胞1h，PBS洗2遍，更換為100μg／mL 慶大霉素的DMEM 培養(yǎng)液以殺死胞外細(xì)菌。1h 后經(jīng)PBS清洗2遍，按上述方法裂解細(xì)胞，BHI平板法培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

1.2.6.3 在MBMEC 中增殖測定 按1.2.6.2方法，再向各孔中加入1mL含10μg／mL慶大霉素的DMEM 培養(yǎng)液，放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以加入含100μg／mL慶大霉素的DMEM 培養(yǎng)液為時(shí)間起點(diǎn)（t＝0），分別在t＝2、4、6、8、12、24h，共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)吸出培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，裂解，計(jì)數(shù)。每次每組不少于3個(gè)平行，該試驗(yàn)要重復(fù)3次，最后取平均值。

2 結(jié)果

2.1 inlB基因缺失片段的融合

PCR擴(kuò)增后用10g／L瓊脂糖凝膠電泳，分別獲得長度為339bp和415bp的特異性上、下臂片段，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。重疊延伸PCR，電泳得到長為754bp的片段，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2）。測序和雙酶切結(jié)果表明，成功缺失了inlB基因（圖3）。

圖1 上下游同源臂擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The upstream and downstream homologous arms amplified by PCR

2.2 重組穿梭質(zhì)粒pKSV-△inlB鑒定

PCR 及雙酶切鑒定結(jié)果表明，重組穿梭質(zhì)粒pKSV-△inlB構(gòu)建成功（圖4）。

2.3 缺失株LM90-△inlB的鑒定

電轉(zhuǎn)后得到的陽性轉(zhuǎn)化子同時(shí)可擴(kuò)增出約750 bp和1 500bp的片段；41 ℃和氯霉素抗性傳代后篩選出只有1條750bp的片段，且有氯霉素抗性，再30 ℃?zhèn)鞔?8 代后，可獲得無氯霉素抗性和不含inlB基因（即只有1條750bp片段）的細(xì)菌，表明已經(jīng)成功構(gòu)建了LM-△inlB缺失株（圖5）。

圖2 重疊延伸PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Overlap extention PCR amplification products of homologous arms

圖3 pMD19-T-△inlB雙酶切鑒定Fig.3 Identification of pMD19-T-△inlB by double enzyme digestion

圖4 pKSV7質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.4 Identification of pKSV7-△inlB by double enzyme digestion

圖5 重組菌PCR鑒定Fig.5 Identification of recombinant bacteria by PCR

2.4 LM90和LM90-△inlB LD50的測定

LM90的LD50約為105.96CFU ；LM90-△inlB的LD50約為107.3CFU（表2）。結(jié)果表明，inlB基因的缺失使得LM的毒力明顯下降（P＜0.05），提示InlB因子對(duì)LM 毒力具有重要的調(diào)控作用。

2.5 小鼠肝臟、脾臟和腦的細(xì)菌計(jì)數(shù)

2組小鼠分別接種LM90、LM90-△inlB 后觀察，發(fā)現(xiàn)小鼠有明顯的精神萎靡，雙眼微閉，結(jié)膜潮紅和分泌物，活動(dòng)遲緩等現(xiàn)象。病理剖檢發(fā)現(xiàn)，接種LM90 的小鼠的肝臟和脾臟明顯腫大，而接種LM90-△inlB的小鼠的肝臟和脾臟有腫大但不如接種親本株的明顯。通過對(duì)兩組小鼠肝臟、脾臟和腦的細(xì)菌平板計(jì)數(shù)結(jié)果分析，接種LM90的小鼠在攻毒后24、48、72h 時(shí)肝臟載菌量高于接種LM90-△inlB組，但差異不顯著（P＞0.05）。脾臟載菌量兩組間在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異不明顯，且攻毒后24h的脾臟載菌量高于48h和72h 的載菌量。腦中沒有檢出細(xì)菌。同時(shí)PCR檢測，可以從肝臟和脾臟中擴(kuò)增出大小為743bp的特異性片段，在腦中沒有擴(kuò)增出相應(yīng)片段（圖6～圖8）。

表2 LM90 和L90-△inlB 對(duì)小鼠LD50的測定結(jié)果Table 2 LD50of LM90and LM90-△inlB in mice

圖6 肝臟細(xì)菌計(jì)數(shù)Fig.6 The bacterial count of liver

圖7 脾臟細(xì)菌計(jì)數(shù)Fig.7 The bacterial count of speen

2.6 LM90和LM90-△inlB體外耐酸耐堿試驗(yàn)

pH＝3時(shí)不生長，pH＝5時(shí)兩株菌生長狀態(tài)基本相同，在pH＝7時(shí)6h后差異顯著（P＜0.05），pH＝9時(shí)4h后差異顯著（P＜0.05），即inlB缺失株耐酸性沒有改變，而耐堿能力強(qiáng)于親本株（圖9）。

2.7 溶血試驗(yàn)

親本株與缺失株無論在兔全血或綿羊全血BHI瓊脂平板上均呈β溶血，說明對(duì)細(xì)菌的溶血特性沒有影響。

圖8 小鼠感染后組織臟器細(xì)菌擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.8 LM products amplified by PCR in tissues of infected mice

2.8 對(duì)鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、侵襲及在其內(nèi)增殖的測定結(jié)果

LM90和LM90-△inlB對(duì)鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附率有差異，但差異不顯著（圖10）；而對(duì)MB-MEC的侵襲率則LM90（0.014 8%）顯著高于LM90-△inlB（0.009 183%）（P＜0.05）（圖11）；細(xì)菌胞內(nèi)增殖試驗(yàn)中，則在每個(gè)時(shí)間段LM90-△inlB菌量顯著低于LM90（P＜0.01），其CFU 相差一個(gè)數(shù)量級(jí)，但在胞內(nèi)增殖趨勢大致相同（圖12）。

圖9 LM90和LM90-△inlB在不同pH 的BHI培養(yǎng)基中生長特性Fig.9 Growth characteristics of LM90and LM90-△inlB on BHI culture medium with different pH

圖10 LM90和LM90-△inlB對(duì)MBMEC黏附率Fig.10 Adhension of LM90and LM90-△inlB with MBMEC

圖11 LM90和LM90-△inlB對(duì)MBMEC侵襲率Fig.11 Invasion rates of LM90and LM90-△inlB to MBMEC

圖12 LM90和LM90-△inlB在MBMEC內(nèi)不同時(shí)間段增殖Fig.12 The intracellular growth of LM90and LM90-△inlB in MBMEC at different time

3 討論

本試驗(yàn)應(yīng)用重疊延伸PCR（SOE-PCR）技術(shù)和同源重組原理，通過電轉(zhuǎn)化法，成功構(gòu)建LM90菌株inlB基因缺失株，試驗(yàn)過程中，為確保電轉(zhuǎn)電壓（溶劑離子濃度為最?。|(zhì)粒洗脫和HEPES液的配置需用無菌去離子水（R＝1.8Ω），且HEPES液pH＝7；加入溶菌酶作用20min，洗脫后細(xì)菌明顯減少，需濃縮后分裝，以保證感受態(tài)細(xì)胞的濃度；電轉(zhuǎn)化時(shí)，LM 感受態(tài)細(xì)胞最好是現(xiàn)配現(xiàn)用，超過5 個(gè)月則不可用。電轉(zhuǎn)陽性突變株在41℃和氯霉素雙重壓力下傳代過程中，極易出現(xiàn)重組不完全，所以需用檢測引物多次檢測，確保為基因已缺失的單菌落才可進(jìn)行質(zhì)粒丟失，避免回復(fù)重組，一般傳18代左右，會(huì)出現(xiàn)只有一條短帶，而無長帶。由于重組質(zhì)粒丟失不完全可能會(huì)出現(xiàn)缺失株的毒力反強(qiáng)，所以在30℃?zhèn)鞔?，需多次傳代并反?fù)鋪板，挑菌，篩選，才可確定無氯霉素抗性。

對(duì)LM90-△inlB 進(jìn)行生物學(xué)特性研究時(shí)，其LD50比LM90高出1個(gè)數(shù)量級(jí)以上，即缺失inlB 后LM 毒力明顯下降，與文獻(xiàn)報(bào)道inl基因缺失可使LM 對(duì)小鼠的LD50明顯增加相符［10］，從而進(jìn)一步證實(shí)了inlB在LM 致病力中有重要作用。單純研究一株菌缺失株（或親本株）的耐酸耐堿性，說明臨床綿羊腦炎分離株LM90耐堿不耐酸，則佐證LM90與標(biāo)準(zhǔn)株具有相同的特性［11］。在肝脾載菌試驗(yàn)中，肝臟LM90載菌量高于LM90-△inlB，而脾臟兩株菌載菌量在各時(shí)間點(diǎn)相近，推測可能由于inlB在肝、脾臟有不同受體Met和C1q 所致［12］。LM90-△inlB對(duì)MBMEC 侵襲率與胞內(nèi)增殖都顯著低于野生株，表明InlB 在LM 侵襲MBMEC 中發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)結(jié)果與Bergmann等缺失inlB將完全不能侵襲HBMEC的結(jié)論存在差異，推測可能是由于LM內(nèi)化素與宿主細(xì)胞相互作用的受體不同所致［13-14］。

本研究成功構(gòu)建了新疆致綿羊腦炎分離株LM90的inlB 基因缺失株LM90-△inlB，并對(duì)缺失株的LD50、細(xì)菌在小鼠體內(nèi)增殖、體外生長、溶血性及對(duì)鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲、黏附及在MB-MEC中的增殖試驗(yàn)等生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，在一定程度上證明了inlB 對(duì)LM 毒力有一定的調(diào)節(jié)作用，為闡明LM 毒力因子的致病機(jī)理提供了科學(xué)依據(jù)。

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