魏 麗,鄧興梅,蔣建軍,剡根強(qiáng),馬 勛,王鵬雁
(石河子大學(xué)動物科技學(xué)院,新疆石河子832003)
單增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)為革蘭陽性短桿菌,引起人和動物的李氏桿菌病。它可穿越人和動物腸屏障、血胎屏障及血腦屏障,在臨床上引起腦膜炎、腦膜腦炎、敗血癥及孕畜(婦)流產(chǎn)等疾病,感染后臨床表現(xiàn)為腦膜腦炎、敗血癥和流產(chǎn)等癥狀[1],被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為四大食源性致病菌之一[2-3]。
LM 為兼性胞內(nèi)寄生菌,可黏附、侵襲宿主細(xì)胞,并具有在胞內(nèi)增殖的特性,InlB為其所特有的內(nèi)化素,由inlA、B 基因 編碼,inlB 基因全長為1 893 bp,其中編碼InlB 的最大開放閱讀框?yàn)?50bp[4],包含630個氨基酸。其結(jié)構(gòu)從N 端到C 端分別為信號肽序列、LRR 重復(fù)區(qū)、IR 重復(fù)區(qū)、B 重復(fù)區(qū)和GW 重復(fù)區(qū)[5]。GW 可介導(dǎo)InlB與細(xì)胞脂磷壁酸的相互作用,LRR 和B重復(fù)區(qū)也參與InlB與靶細(xì)胞的相互作用[6],如肝細(xì)胞生長因子受體(Met)在LRR的凹陷部與InlB結(jié)合等。LM 建立感染的前提是通過InlA、InlB 和p60 蛋白等的黏附作用進(jìn)入宿主細(xì)胞[7],即其導(dǎo)致感染性疾病癥狀的嚴(yán)重程度部分上依賴于內(nèi)化素蛋白入侵上皮細(xì)胞的能力[8]。內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成血腦屏障的主要結(jié)構(gòu),病原體侵入毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞可能是其穿越血腦屏障的一種重要方式,如大腸埃希菌(引起細(xì)菌性腦炎型)通過血腦屏障侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。LM90菌株是新疆致綿羊腦炎分離株,感染導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀較為明顯,本研究通過同源重組構(gòu)建inlB 基因缺失株(LM90-△inlB),對缺失株的生物學(xué)特性進(jìn)行研究,為探討LM 的毒力因子InlB在致病力和穿越血腦屏障過程中的具體作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
1.1.1 菌株和質(zhì)粒 新疆致綿羊腦炎分離株單增李斯特菌LM90,由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存,血清型為4b 型;pKSV7穿梭質(zhì)粒,浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院分子微生物與食品安全實(shí)驗(yàn)室饋贈;pMD19-T,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。
1.1.2 主要試劑Taqplus DNA 聚合酶、dNTP Mix,上海東盛公司產(chǎn)品;pfuTaq酶,康為公司產(chǎn)品;DNA 回收試劑盒,諾維森公司產(chǎn)品;質(zhì)粒提取試劑盒,天根公司產(chǎn)品;限制性內(nèi)切酶(EcoR Ⅰ、HindⅢ),寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;青霉素G、氨卡青霉素和氯霉素、溶菌酶,Promega 公司產(chǎn)品;BHI培養(yǎng)基,BD 公司產(chǎn)品;鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(MBMEC),廣州吉妮歐生物科技有限公司產(chǎn)品;高糖DMEM,Hyclone公司產(chǎn)品;FBS,Gibco 公司產(chǎn)品。
1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物 8 周齡健康昆明系小鼠由石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。
1.1.4 引物 表1為本試驗(yàn)中用到引物,由北京華大基因公司合成。其中,90-inlB-a、90-inlB-b用于擴(kuò)增上游同源臂;90-inlB-c、90-inlB-d用于擴(kuò)增下游同源臂;90-inlB-JC-a、90-inlB-JC-b 用于缺失株的鑒定;hly-1、hly-2用于4b血清型LM 特異性鑒定。
表1 PCR 引物及擴(kuò)增片段大小Table 1 PCR primers and sizes of products
1.2.1 inlB基因缺失株LM90-△inlB的構(gòu)建
1.2.1.1 inlB 基因缺失片段的獲得和穿梭重組質(zhì)粒的構(gòu)建 煮沸法提取LM90的基因組DNA,以其為模板,用高保真pfu酶及引物90-inlB-a和90-inlB-b擴(kuò)增得到inlB上游同源臂,用引物90-inlB-c和90-inlB-d擴(kuò)增得到inlB 下游同源臂。再以上下臂為模板進(jìn)行第一步融合后,用引物90-inlB-a 和90-inlB-d通過基因重疊延伸PCR 的方法獲得inlB 目的基因缺失盒△inlB。
膠回收△inlB 后連接到pMD19-T,命名為T-△inlB,然后轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH 5α 中。菌液PCR 篩選陽性克隆,并提取T-△inlB 質(zhì)粒進(jìn)行酶切。鑒定后,送華大基因測序驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確的T-△inlB重組質(zhì)粒,用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后,回收△inlB 目的片段,同時用EcoR Ⅰ和HindⅢ雙酶切穿梭質(zhì)粒pKSV7,最后用T4 連接酶將△inlB片段和酶切后的pKSV7載體片段連接,即將△inlB 亞克隆于pKSV7,獲得重組的穿梭質(zhì)粒pKSV7-△inlB。
1.2.1.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備 參照文獻(xiàn)[10]單增李斯特菌感受態(tài)細(xì)胞制備方法進(jìn)行。
1.2.1.3 電轉(zhuǎn)化和同源重組 將構(gòu)建好的穿梭質(zhì)粒pKSV7-△inlB通過電轉(zhuǎn)的方法(2.5kV,5 ms)轉(zhuǎn)入LM90感受態(tài)細(xì)胞中,30 ℃培養(yǎng)48h后,篩選并獲得陽性克隆。將陽性克隆在41 ℃和10μg/mL氯霉素的雙重壓力下進(jìn)行傳代培養(yǎng),約18代后,將末代細(xì)菌培養(yǎng)物劃線接種到氯霉素抗性平板上,41℃過夜培養(yǎng),挑取單個菌落。用90-inlB-JC-a和90-inlB-JC-b引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,篩選出不含inlB 基因的氯霉素抗性的缺失株。再將其置于30 ℃無氯霉素抗性BHI培養(yǎng)基傳28 代左右后鋪板(無抗BHI),30℃過夜,進(jìn)行抗氯霉素和不抗氯霉素篩選。獲得無氯霉素抗性的缺失株,即確認(rèn)為LM90-△inlB缺失株。
1.2.1.4 缺失株LM90-△inlB 的鑒定及遺傳穩(wěn)定性測定 用檢測引物90-inlB-JC-a和90-inlB-JC-b進(jìn)行PCR 擴(kuò)增鑒定,親本株預(yù)期片段為1 500bp,缺失株預(yù)期擴(kuò)增片段為750bp;同時將該菌接種于氯霉素抗性和非抗性BHI中,進(jìn)行確定是否不含氯霉素抗性。將上述得到的重組缺失菌株在無氯霉素37℃條件下傳代培養(yǎng)20代,同時用菌液PCR 進(jìn)行鑒定,以檢測重組株LM90-△inlB 是否發(fā)生重組不完全,并確定重組菌具有遺傳穩(wěn)定性。
1.2.2 LM90 和LM90-△inlB 的LD50測定將LM90和LM90-△inlB均于37℃,180r/min搖床培養(yǎng)至OD 595≈0.40時,分別離心收集細(xì)菌,用PBS清洗2遍后再將細(xì)菌懸浮液進(jìn)行梯度稀釋。將試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為5 組,每組5只,進(jìn)行腹腔注射,接種量0.2 mL/只;對照組腹腔注射滅菌PBS,0.2 mL/只。連續(xù)觀察10d,用寇氏法計算LD50。
1.2.3 LM90 和LM90-△inlB 小鼠肝、脾、腦細(xì)菌計數(shù) 將試驗(yàn)小鼠分成兩組,每組8只。將LM90和LM90-△inlB,37 ℃,180r/min 搖床培養(yǎng)16h至OD595≈0.3,腹腔注射,接種量為0.2 mL/只。注射菌液后分別在24、48、72h時各取2只,在無菌條件下摘取肝、脾、腦,研磨均勻后,梯度稀釋,然后涂布至BHI固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)24h,進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)。同時將組織直接接種于BHI液體進(jìn)行培養(yǎng),用于PCR檢測。
1.2.4 親本株LM90和缺失株LM90-△inlB 耐酸耐堿生長曲線測定 分別挑取LM90 和LM90-△inlB單個菌落于BHI過夜培養(yǎng)(約16h)至穩(wěn)定期OD595≈0.4,取100μL 至5mL BHI(不同pH)培養(yǎng)基做50 倍稀釋。每孔加入200μL 菌液至96孔板,設(shè)3 個平行。置酶標(biāo)儀中,OD595 連續(xù)讀數(shù)12h。
1.2.5 溶血試驗(yàn) LM90親本株與缺失株分別在兔全血或綿羊全血BHI瓊脂平板上劃線培養(yǎng)觀察其溶血特性。
1.2.6 MBMEC黏附、侵襲和增殖試驗(yàn)
1.2.6.1 對MBMEC 黏附測定 于12 孔板中傳代培養(yǎng)鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(MBMEC),37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2,至單層細(xì)胞為80%(細(xì)胞的密度為5×105/mL)左右,將過夜培養(yǎng)的LM90和LM90-△inlB稀釋為約107,每孔0.5mL。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h后,用PBS洗2遍,加入1 mL/L 的TritonX-100裂解15min。裂解后10倍系列稀釋,BHI固體培養(yǎng)基上,37 ℃條件下培養(yǎng)24h,進(jìn)行細(xì)菌平板計數(shù)。
1.2.6.2 對MBMEC 侵襲測定 用以上相同方法感染細(xì)胞1h,PBS洗2遍,更換為100μg/mL 慶大霉素的DMEM 培養(yǎng)液以殺死胞外細(xì)菌。1h 后經(jīng)PBS清洗2遍,按上述方法裂解細(xì)胞,BHI平板法培養(yǎng)計數(shù)。
1.2.6.3 在MBMEC 中增殖測定 按1.2.6.2方法,再向各孔中加入1mL含10μg/mL慶大霉素的DMEM 培養(yǎng)液,放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以加入含100μg/mL慶大霉素的DMEM 培養(yǎng)液為時間起點(diǎn)(t=0),分別在t=2、4、6、8、12、24h,共6個時間點(diǎn)吸出培養(yǎng)液,用PBS洗2遍,裂解,計數(shù)。每次每組不少于3個平行,該試驗(yàn)要重復(fù)3次,最后取平均值。
PCR擴(kuò)增后用10g/L瓊脂糖凝膠電泳,分別獲得長度為339bp和415bp的特異性上、下臂片段,與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。重疊延伸PCR,電泳得到長為754bp的片段,與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)。測序和雙酶切結(jié)果表明,成功缺失了inlB基因(圖3)。
圖1 上下游同源臂擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The upstream and downstream homologous arms amplified by PCR
PCR 及雙酶切鑒定結(jié)果表明,重組穿梭質(zhì)粒pKSV-△inlB構(gòu)建成功(圖4)。
電轉(zhuǎn)后得到的陽性轉(zhuǎn)化子同時可擴(kuò)增出約750 bp和1 500bp的片段;41 ℃和氯霉素抗性傳代后篩選出只有1條750bp的片段,且有氯霉素抗性,再30 ℃?zhèn)鞔?8 代后,可獲得無氯霉素抗性和不含inlB基因(即只有1條750bp片段)的細(xì)菌,表明已經(jīng)成功構(gòu)建了LM-△inlB缺失株(圖5)。
圖2 重疊延伸PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Overlap extention PCR amplification products of homologous arms
圖3 pMD19-T-△inlB雙酶切鑒定Fig.3 Identification of pMD19-T-△inlB by double enzyme digestion
圖4 pKSV7質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.4 Identification of pKSV7-△inlB by double enzyme digestion
圖5 重組菌PCR鑒定Fig.5 Identification of recombinant bacteria by PCR
LM90的LD50約為105.96CFU ;LM90-△inlB的LD50約為107.3CFU(表2)。結(jié)果表明,inlB基因的缺失使得LM的毒力明顯下降(P<0.05),提示InlB因子對LM 毒力具有重要的調(diào)控作用。
2組小鼠分別接種LM90、LM90-△inlB 后觀察,發(fā)現(xiàn)小鼠有明顯的精神萎靡,雙眼微閉,結(jié)膜潮紅和分泌物,活動遲緩等現(xiàn)象。病理剖檢發(fā)現(xiàn),接種LM90 的小鼠的肝臟和脾臟明顯腫大,而接種LM90-△inlB的小鼠的肝臟和脾臟有腫大但不如接種親本株的明顯。通過對兩組小鼠肝臟、脾臟和腦的細(xì)菌平板計數(shù)結(jié)果分析,接種LM90的小鼠在攻毒后24、48、72h 時肝臟載菌量高于接種LM90-△inlB組,但差異不顯著(P>0.05)。脾臟載菌量兩組間在各個時間點(diǎn)差異不明顯,且攻毒后24h的脾臟載菌量高于48h和72h 的載菌量。腦中沒有檢出細(xì)菌。同時PCR檢測,可以從肝臟和脾臟中擴(kuò)增出大小為743bp的特異性片段,在腦中沒有擴(kuò)增出相應(yīng)片段(圖6~圖8)。
表2 LM90 和L90-△inlB 對小鼠LD50的測定結(jié)果Table 2 LD50of LM90and LM90-△inlB in mice
圖6 肝臟細(xì)菌計數(shù)Fig.6 The bacterial count of liver
圖7 脾臟細(xì)菌計數(shù)Fig.7 The bacterial count of speen
pH=3時不生長,pH=5時兩株菌生長狀態(tài)基本相同,在pH=7時6h后差異顯著(P<0.05),pH=9時4h后差異顯著(P<0.05),即inlB缺失株耐酸性沒有改變,而耐堿能力強(qiáng)于親本株(圖9)。
親本株與缺失株無論在兔全血或綿羊全血BHI瓊脂平板上均呈β溶血,說明對細(xì)菌的溶血特性沒有影響。
圖8 小鼠感染后組織臟器細(xì)菌擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.8 LM products amplified by PCR in tissues of infected mice
LM90和LM90-△inlB對鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附率有差異,但差異不顯著(圖10);而對MB-MEC的侵襲率則LM90(0.014 8%)顯著高于LM90-△inlB(0.009 183%)(P<0.05)(圖11);細(xì)菌胞內(nèi)增殖試驗(yàn)中,則在每個時間段LM90-△inlB菌量顯著低于LM90(P<0.01),其CFU 相差一個數(shù)量級,但在胞內(nèi)增殖趨勢大致相同(圖12)。
圖9 LM90和LM90-△inlB在不同pH 的BHI培養(yǎng)基中生長特性Fig.9 Growth characteristics of LM90and LM90-△inlB on BHI culture medium with different pH
圖10 LM90和LM90-△inlB對MBMEC黏附率Fig.10 Adhension of LM90and LM90-△inlB with MBMEC
圖11 LM90和LM90-△inlB對MBMEC侵襲率Fig.11 Invasion rates of LM90and LM90-△inlB to MBMEC
圖12 LM90和LM90-△inlB在MBMEC內(nèi)不同時間段增殖Fig.12 The intracellular growth of LM90and LM90-△inlB in MBMEC at different time
本試驗(yàn)應(yīng)用重疊延伸PCR(SOE-PCR)技術(shù)和同源重組原理,通過電轉(zhuǎn)化法,成功構(gòu)建LM90菌株inlB基因缺失株,試驗(yàn)過程中,為確保電轉(zhuǎn)電壓(溶劑離子濃度為最?。?,質(zhì)粒洗脫和HEPES液的配置需用無菌去離子水(R=1.8Ω),且HEPES液pH=7;加入溶菌酶作用20min,洗脫后細(xì)菌明顯減少,需濃縮后分裝,以保證感受態(tài)細(xì)胞的濃度;電轉(zhuǎn)化時,LM 感受態(tài)細(xì)胞最好是現(xiàn)配現(xiàn)用,超過5 個月則不可用。電轉(zhuǎn)陽性突變株在41℃和氯霉素雙重壓力下傳代過程中,極易出現(xiàn)重組不完全,所以需用檢測引物多次檢測,確保為基因已缺失的單菌落才可進(jìn)行質(zhì)粒丟失,避免回復(fù)重組,一般傳18代左右,會出現(xiàn)只有一條短帶,而無長帶。由于重組質(zhì)粒丟失不完全可能會出現(xiàn)缺失株的毒力反強(qiáng),所以在30℃?zhèn)鞔?,需多次傳代并反?fù)鋪板,挑菌,篩選,才可確定無氯霉素抗性。
對LM90-△inlB 進(jìn)行生物學(xué)特性研究時,其LD50比LM90高出1個數(shù)量級以上,即缺失inlB 后LM 毒力明顯下降,與文獻(xiàn)報道inl基因缺失可使LM 對小鼠的LD50明顯增加相符[10],從而進(jìn)一步證實(shí)了inlB在LM 致病力中有重要作用。單純研究一株菌缺失株(或親本株)的耐酸耐堿性,說明臨床綿羊腦炎分離株LM90耐堿不耐酸,則佐證LM90與標(biāo)準(zhǔn)株具有相同的特性[11]。在肝脾載菌試驗(yàn)中,肝臟LM90載菌量高于LM90-△inlB,而脾臟兩株菌載菌量在各時間點(diǎn)相近,推測可能由于inlB在肝、脾臟有不同受體Met和C1q 所致[12]。LM90-△inlB對MBMEC 侵襲率與胞內(nèi)增殖都顯著低于野生株,表明InlB 在LM 侵襲MBMEC 中發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)結(jié)果與Bergmann等缺失inlB將完全不能侵襲HBMEC的結(jié)論存在差異,推測可能是由于LM內(nèi)化素與宿主細(xì)胞相互作用的受體不同所致[13-14]。
本研究成功構(gòu)建了新疆致綿羊腦炎分離株LM90的inlB 基因缺失株LM90-△inlB,并對缺失株的LD50、細(xì)菌在小鼠體內(nèi)增殖、體外生長、溶血性及對鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲、黏附及在MB-MEC中的增殖試驗(yàn)等生物學(xué)特性進(jìn)行了研究,在一定程度上證明了inlB 對LM 毒力有一定的調(diào)節(jié)作用,為闡明LM 毒力因子的致病機(jī)理提供了科學(xué)依據(jù)。
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