高瑞娟,張 凱,呂嘉敏,黃永興,羅開(kāi)健
(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州510642)
空腸彎曲菌和沙門菌是引起細(xì)菌性食物中毒的常見(jiàn)致病菌,常污染肉、乳和禽等動(dòng)物性食品。污染的食品引起腹瀉、嘔吐等急性腸胃炎癥狀,嚴(yán)重的可引起死亡[1]。據(jù)我國(guó)和世界各國(guó)的統(tǒng)計(jì)資料證明,沙門菌引發(fā)的食物中毒在細(xì)菌性食物中毒中占據(jù)首位[2-3],現(xiàn)已成為食品公共衛(wèi)生方面的重要問(wèn)題。據(jù)報(bào)道,流行病學(xué)調(diào)查表明,空腸彎曲菌作為腸炎的病因僅次于沙門菌和志賀菌,在很多地區(qū)甚至有超過(guò)沙門菌而居首位的趨勢(shì),因而有研究報(bào)道稱空腸彎曲菌是“下一個(gè)沙門菌”[4]。此外,空腸彎曲菌的感染與人的格林-巴利綜合征等具有自身免疫特性的疾病有關(guān)[5-6]。世界衛(wèi)生組織(WHO)已將該病列為最常見(jiàn)的食源性傳染病之一。
空腸彎曲菌和沙門菌感染的初期癥狀非常類似,這對(duì)區(qū)分兩種疾病造成了一定的困難。對(duì)空腸彎曲菌和沙門菌的檢測(cè),傳統(tǒng)的鑒定方法包括增菌、生理生化鑒定、血清學(xué)鑒定等,但是所需檢驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng),而且病原菌在食品樣品中存在的數(shù)量相對(duì)較少,使用常規(guī)選擇性平板上挑取可疑菌落的方法也可能會(huì)造成陽(yáng)性菌株的漏檢??漳c彎曲菌屬于微需氧菌,對(duì)培養(yǎng)基及培養(yǎng)氣體環(huán)境要求都比較嚴(yán)格,而且細(xì)菌的分離培養(yǎng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力,當(dāng)感染或污染的量較少時(shí),從樣品中分離出空腸彎曲菌就更加困難[7-9]。據(jù)報(bào)道,空腸彎曲菌的致病劑量很小,400個(gè)~500個(gè)菌體就可引發(fā)腸道感染[10]。因此,建立高靈敏度和高特異度的檢測(cè)方法是提高空腸彎曲菌檢測(cè)水平的重要措施。并且在一些特定條件下,空腸彎曲菌還存在著一種“存在但不可培養(yǎng)”的狀態(tài)[11-12],這更是傳統(tǒng)分離培養(yǎng)檢測(cè)方法無(wú)法克服的難題。因此,在檢驗(yàn)檢疫工作中急需一種靈敏的快速檢測(cè)方法。一些檢測(cè)方法如PCR、ELISA 都有較高的假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn),所以,PCR 和ELISA 得出的結(jié)果都不能作為最終的檢測(cè)依據(jù)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展,熒光定量PCR 技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原微生物檢測(cè)[13]。本研究采用熒光定量PCR 技術(shù),建立了同時(shí)檢測(cè)空腸彎曲菌和沙門菌的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法。
1.1.1 菌種空腸彎曲菌(ATCC33291、NCTC11168)、金黃色葡萄球ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922,美國(guó)菌種保藏中心提供;鵝源結(jié)腸彎曲 菌 SCCC005、沙門菌(SCSE034、SCSE011、SCSE079)、志賀菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌,均為本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。
1.1.2 主要試劑和儀器 哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基,布氏肉湯,LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,LB 營(yíng)養(yǎng)肉湯,青島海博有限責(zé)任公司產(chǎn)品;新鮮脫纖維綿羊血,廣州蕊特生物技術(shù)公司產(chǎn)品;Real Master Mix試劑盒,北京天根公司產(chǎn)品;熒光定量PCR 八連管平蓋,美國(guó)AXYGEN 公司產(chǎn)品;ABI7500熒光定量PCR 儀,美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品。
1.2.1 細(xì)菌DNA 模板的制備 將1.1.1中所列12種菌株活化后接種于增菌液中,37 ℃(空腸彎曲菌42 ℃微需氧條件下培養(yǎng))培養(yǎng)24h,無(wú)菌操作吸取1mL 培養(yǎng)液,參考黃金林等[14]報(bào)道的方法利用水煮法提取細(xì)菌基因組DNA,置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 引物和探針的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI公布的空腸彎曲菌的保守基因hipO 和沙門菌的保守基因invA 序列,利用Primer Premier 5.0和DNA Star軟件設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針,分別使用FAM、JOE作為探針報(bào)告基團(tuán),TAMRA 作為探針淬滅基團(tuán)。引物和探針序列見(jiàn)表1,由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。
表1 引物和探針序列Table 1 Sequences of primes and probes
1.2.3 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 體系的建立 先對(duì)每種病原菌做單體系定性反應(yīng),在此基礎(chǔ)上對(duì)雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)的引物、探針濃度和Tm 值進(jìn)行優(yōu)化,建立最佳反應(yīng)體系。
1.2.4 特異性試驗(yàn) 取1.2.1的12種標(biāo)準(zhǔn)菌株及分離菌株細(xì)菌的DNA,應(yīng)用以上建立的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)驗(yàn)證方法的特異性。
1.2.5 靈敏度試驗(yàn) 取沙門菌LB 增菌液按10倍梯度稀釋菌液,涂板,37 ℃培養(yǎng)24h后進(jìn)行平板計(jì)數(shù),重復(fù)2次,取平均值推算出原液中含的細(xì)菌數(shù),計(jì)數(shù)原始菌液濃度。取空腸彎曲菌布氏肉湯培養(yǎng)液,按上述沙門菌稀釋的方法稀釋后涂哥倫比亞血平板,42 ℃微需氧條件下培養(yǎng)24h后,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),重復(fù)2次。將已經(jīng)測(cè)定濃度的沙門菌、空腸彎曲菌分別進(jìn)行10倍梯度稀釋,取相應(yīng)細(xì)菌濃度區(qū)間為100mol/L~106mol/L稀釋的DNA 模板,做3個(gè)重復(fù)的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。
1.2.6 實(shí)際樣品檢測(cè) 采用雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法同時(shí)對(duì)隨機(jī)采集的40份冷凍雞肉類樣品進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。
對(duì)引物和探針濃度及反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,最佳擴(kuò)增條件確定為:95 ℃2 min;95 ℃20s,60 ℃1 min,進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。最佳反應(yīng)體系20μL:2.5×Real Master Mix(含內(nèi)參染料)8μL,上、下游引物:10μmol/L 各為1μL,探針10μmol/L 分別為0.3 μL(空腸彎曲菌)、0.7μL(沙門菌),20×probe enhancer solution 1μL,模板DNA 2μL,加超純水補(bǔ)足至20μL。
雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。對(duì)2份空腸彎曲菌、3份沙門菌均產(chǎn)生明顯的擴(kuò)增曲線,顯示陽(yáng)性結(jié)果;同時(shí)對(duì)其他7種菌株及去離子水空白對(duì)照均不能產(chǎn)生擴(kuò)增曲線,顯示陰性結(jié)果。
圖1 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 特異性擴(kuò)增曲線Fig.1 Specificity amplification curves of the duplex real-time PCR
最終測(cè)定的空腸彎曲菌、沙門菌原液濃度分別為1.0×107CFU/mL、2.3×106CFU/mL。靈敏度試驗(yàn)結(jié)果如圖2、圖3 所示。雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果顯示,空腸彎曲菌檢測(cè)限可達(dá)10CFU/mL,沙門菌檢測(cè)限達(dá)230CFU/mL。
采用雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)隨機(jī)采集的40份冷凍雞肉類樣品進(jìn)行同時(shí)檢測(cè),結(jié)果顯示8份陽(yáng)性,其余32份全部陰性。采用雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法檢出3 份樣品為空腸彎曲菌陽(yáng)性,5份樣品為沙門菌陽(yáng)性;采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢出3份樣品為空腸彎曲菌陽(yáng)性,5份樣品為沙門菌陽(yáng)性。兩種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果一致,檢測(cè)結(jié)果如表2所示。
圖2 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)空腸彎曲菌靈敏性結(jié)果Fig.2 The sensitivity results of the duplex real-time PCR for detecting Campylobacter jejunum
圖3 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)沙門菌靈敏性結(jié)果Fig.3 The sensitivity results of the duplex real-time PCR for detecting Salmonella
表2 樣品檢測(cè)結(jié)果Table 2 Sample test results
隨著食品安全要求的不斷提高,快速檢測(cè)食品微生物在食品安全中的重要性愈加明顯??漳c彎曲菌和沙門菌是世界范圍內(nèi)食品污染的主要病原菌之一[15]。如何快速檢測(cè)食品中空腸彎曲菌和沙門菌,縮短檢測(cè)時(shí)間,提高檢測(cè)靈敏度,減少錯(cuò)檢、漏檢是食品病原微生物檢測(cè)的重點(diǎn)。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR 融合了PCR 的靈敏性和光譜技術(shù)定量精確的優(yōu)點(diǎn),特異性強(qiáng),靈敏度高,操作簡(jiǎn)單快速,整個(gè)擴(kuò)增和產(chǎn)物分析過(guò)程均在密封單管內(nèi)完成,不需電泳和紫外或染色觀察,并通過(guò)微機(jī)控制,實(shí)現(xiàn)了對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)和自動(dòng)分析結(jié)果。該技術(shù)從根本上解決了PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物污染的問(wèn)題,提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。雖然采用SYBR 染料法也可達(dá)到雙重?zé)晒舛康哪康?,但SYBR Green染料會(huì)與非特異性雙鏈DNA 結(jié)合,產(chǎn)生假陽(yáng)性,干擾實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性,特別是分析表達(dá)量不高的基因時(shí),這類情況尤其突出。而探針?lè)ǔ艘镄蛄械奶禺愋灾?,還有探針序列的特異性,可從兩個(gè)方面保證所擴(kuò)增基因的特異性。故本研究建立了基于TaqMan探針的空腸彎曲菌和沙門菌雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。
本研究結(jié)果顯示該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高。實(shí)際樣品檢測(cè)中,我們發(fā)現(xiàn)本研究建立的檢測(cè)方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測(cè)結(jié)果一致。本研究建立的空腸彎曲菌和沙門菌TaqMan探針雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法,具有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和良好的應(yīng)用前景,值得在進(jìn)一步研究完善后建立標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)流程以利于推廣應(yīng)用。
[1]何國(guó)慶,賈英民,丁立孝.食品微生物學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2002:224-229.
[2]Ogunsanya T,Uzoma K,Odugbemi T,et al.Observation on distribution ofShigellaspecies in Lagos:a report for the period 1985-1988[J].EurJ Epidemiol,1990,6(2):227-228.
[3]Singer S,Cook L,Maddox W,et al.Use of pooled samples for the detection ofSalmonellain feces by polymerase chain reaction[J].J Vet Diagn Invest,2006,18(4):319-325.
[4]Georgios K,Dang D B,Marianne L,et al.Development of a sensitive DNA microarray suitable for rapid detection ofCampylobacterspp[J].Molecul Cell Prob,2003,17:187-196.
[5]McCarthy N,Giesecke J,Weinberg E D,et al.Incidence of Guillain Barre syndrome following infection withCampylobacter jejuni[J].Am J Epidemiol,2001,153(6):610-614.
[6]翟海華,王 娟,王君偉,等.空腸彎曲菌的致病性及致病機(jī)制研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2013,34(12):164-169.
[7]Fukushima H,Katsube K,Hata Y,et al.Rapid separation and concentration of food-borne pathogens in food samples prior to quantification by viable-cell counting and real-time PCR[J].Appl Environ Microbiol,2007,73(1):92-100.
[8]Cheng B Y,Yuan J,Ke H H,et al.A real-time PCR assay for the detection and quantitation ofCampylobacter jejuniusing SYBR green and the light cycle[J].Yale J Biol Med,2004,77(5-6):125-132.
[9]Rudi K,Hoidal H K,Katla T,et al.Direct real-time PCR quantification ofCampylobacter jejuniin chicken fecal and cecal samples by integrated cell concentration and DNA purification[J].Appl Environ Microbiol,2004,70(2):790-797.
[10]Mandell C L,Douglas R G,Bennett J E.Principles and practice of infectious diseases[M].4th edition.New York:Churchill Livingstone,1995:2053-2060.
[11]Mckay A M.Viable but non-culturable forms of potentially pathogenic bacteria in water[J].Lett Appl Microbiol,1992,14:129-135.
[12]Medema G J,Schets F M,Van de Giessen A W,et al.Lack of colonization of 1day old chicks by viable,non-culturableCampylobacter jejuni[J].J Appl Bacteriol,1992,75:512-516.
[13]盧亦愚,嚴(yán)菊英,馮 燕,等.TaqMan熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)快速檢測(cè)麻疹病毒核酸[J].中國(guó)計(jì)劃免疫,2005,11(1):1-4.
[14]黃金林,焦新安,文其乙,等.應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)快速檢測(cè)沙門菌[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版,2002,23(3):4-7.
[15]胡 哲,王振國(guó),劉金華,等.利用PCR 技術(shù)檢測(cè)雞肉產(chǎn)品中的空腸彎曲桿菌[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,27(6):671-674.