高瑞娟，張 凱，呂嘉敏，黃永興，羅開(kāi)健

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642）

空腸彎曲菌和沙門菌是引起細(xì)菌性食物中毒的常見(jiàn)致病菌，常污染肉、乳和禽等動(dòng)物性食品。污染的食品引起腹瀉、嘔吐等急性腸胃炎癥狀，嚴(yán)重的可引起死亡［1］。據(jù)我國(guó)和世界各國(guó)的統(tǒng)計(jì)資料證明，沙門菌引發(fā)的食物中毒在細(xì)菌性食物中毒中占據(jù)首位［2-3］，現(xiàn)已成為食品公共衛(wèi)生方面的重要問(wèn)題。據(jù)報(bào)道，流行病學(xué)調(diào)查表明，空腸彎曲菌作為腸炎的病因僅次于沙門菌和志賀菌，在很多地區(qū)甚至有超過(guò)沙門菌而居首位的趨勢(shì)，因而有研究報(bào)道稱空腸彎曲菌是“下一個(gè)沙門菌”［4］。此外，空腸彎曲菌的感染與人的格林-巴利綜合征等具有自身免疫特性的疾病有關(guān)［5-6］。世界衛(wèi)生組織（WHO）已將該病列為最常見(jiàn)的食源性傳染病之一。

空腸彎曲菌和沙門菌感染的初期癥狀非常類似，這對(duì)區(qū)分兩種疾病造成了一定的困難。對(duì)空腸彎曲菌和沙門菌的檢測(cè)，傳統(tǒng)的鑒定方法包括增菌、生理生化鑒定、血清學(xué)鑒定等，但是所需檢驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，而且病原菌在食品樣品中存在的數(shù)量相對(duì)較少，使用常規(guī)選擇性平板上挑取可疑菌落的方法也可能會(huì)造成陽(yáng)性菌株的漏檢?？漳c彎曲菌屬于微需氧菌，對(duì)培養(yǎng)基及培養(yǎng)氣體環(huán)境要求都比較嚴(yán)格，而且細(xì)菌的分離培養(yǎng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，當(dāng)感染或污染的量較少時(shí)，從樣品中分離出空腸彎曲菌就更加困難［7-9］。據(jù)報(bào)道，空腸彎曲菌的致病劑量很小，400個(gè)～500個(gè)菌體就可引發(fā)腸道感染［10］。因此，建立高靈敏度和高特異度的檢測(cè)方法是提高空腸彎曲菌檢測(cè)水平的重要措施。并且在一些特定條件下，空腸彎曲菌還存在著一種“存在但不可培養(yǎng)”的狀態(tài)［11-12］，這更是傳統(tǒng)分離培養(yǎng)檢測(cè)方法無(wú)法克服的難題。因此，在檢驗(yàn)檢疫工作中急需一種靈敏的快速檢測(cè)方法。一些檢測(cè)方法如PCR、ELISA 都有較高的假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)，所以，PCR 和ELISA 得出的結(jié)果都不能作為最終的檢測(cè)依據(jù)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，熒光定量PCR 技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原微生物檢測(cè)［13］。本研究采用熒光定量PCR 技術(shù)，建立了同時(shí)檢測(cè)空腸彎曲菌和沙門菌的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種空腸彎曲菌（ATCC33291、NCTC11168）、金黃色葡萄球ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922，美國(guó)菌種保藏中心提供；鵝源結(jié)腸彎曲 菌 SCCC005、沙門菌（SCSE034、SCSE011、SCSE079）、志賀菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌，均為本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，布氏肉湯，LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，LB 營(yíng)養(yǎng)肉湯，青島海博有限責(zé)任公司產(chǎn)品；新鮮脫纖維綿羊血，廣州蕊特生物技術(shù)公司產(chǎn)品；Real Master Mix試劑盒，北京天根公司產(chǎn)品；熒光定量PCR 八連管平蓋，美國(guó)AXYGEN 公司產(chǎn)品；ABI7500熒光定量PCR 儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌DNA 模板的制備 將1.1.1中所列12種菌株活化后接種于增菌液中，37 ℃（空腸彎曲菌42 ℃微需氧條件下培養(yǎng)）培養(yǎng)24h，無(wú)菌操作吸取1mL 培養(yǎng)液，參考黃金林等［14］報(bào)道的方法利用水煮法提取細(xì)菌基因組DNA，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物和探針的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI公布的空腸彎曲菌的保守基因hipO 和沙門菌的保守基因invA 序列，利用Primer Premier 5.0和DNA Star軟件設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，分別使用FAM、JOE作為探針報(bào)告基團(tuán)，TAMRA 作為探針淬滅基團(tuán)。引物和探針序列見(jiàn)表1，由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物和探針序列Table 1 Sequences of primes and probes

1.2.3 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 體系的建立 先對(duì)每種病原菌做單體系定性反應(yīng)，在此基礎(chǔ)上對(duì)雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)的引物、探針濃度和Tm 值進(jìn)行優(yōu)化，建立最佳反應(yīng)體系。

1.2.4 特異性試驗(yàn) 取1.2.1的12種標(biāo)準(zhǔn)菌株及分離菌株細(xì)菌的DNA，應(yīng)用以上建立的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)驗(yàn)證方法的特異性。

1.2.5 靈敏度試驗(yàn) 取沙門菌LB 增菌液按10倍梯度稀釋菌液，涂板，37 ℃培養(yǎng)24h后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，重復(fù)2次，取平均值推算出原液中含的細(xì)菌數(shù)，計(jì)數(shù)原始菌液濃度。取空腸彎曲菌布氏肉湯培養(yǎng)液，按上述沙門菌稀釋的方法稀釋后涂哥倫比亞血平板，42 ℃微需氧條件下培養(yǎng)24h后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，重復(fù)2次。將已經(jīng)測(cè)定濃度的沙門菌、空腸彎曲菌分別進(jìn)行10倍梯度稀釋，取相應(yīng)細(xì)菌濃度區(qū)間為100mol／L～106mol／L稀釋的DNA 模板，做3個(gè)重復(fù)的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。

1.2.6 實(shí)際樣品檢測(cè) 采用雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法同時(shí)對(duì)隨機(jī)采集的40份冷凍雞肉類樣品進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化

對(duì)引物和探針濃度及反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最佳擴(kuò)增條件確定為：95 ℃2 min；95 ℃20s，60 ℃1 min，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。最佳反應(yīng)體系20μL：2.5×Real Master Mix（含內(nèi)參染料）8μL，上、下游引物：10μmol／L 各為1μL，探針10μmol／L 分別為0.3 μL（空腸彎曲菌）、0.7μL（沙門菌），20×probe enhancer solution 1μL，模板DNA 2μL，加超純水補(bǔ)足至20μL。

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。對(duì)2份空腸彎曲菌、3份沙門菌均產(chǎn)生明顯的擴(kuò)增曲線，顯示陽(yáng)性結(jié)果；同時(shí)對(duì)其他7種菌株及去離子水空白對(duì)照均不能產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，顯示陰性結(jié)果。

圖1 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 特異性擴(kuò)增曲線Fig.1 Specificity amplification curves of the duplex real-time PCR

2.3 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

最終測(cè)定的空腸彎曲菌、沙門菌原液濃度分別為1.0×107CFU／mL、2.3×106CFU／mL。靈敏度試驗(yàn)結(jié)果如圖2、圖3 所示。雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果顯示，空腸彎曲菌檢測(cè)限可達(dá)10CFU／mL，沙門菌檢測(cè)限達(dá)230CFU／mL。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

采用雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)隨機(jī)采集的40份冷凍雞肉類樣品進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，結(jié)果顯示8份陽(yáng)性，其余32份全部陰性。采用雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法檢出3 份樣品為空腸彎曲菌陽(yáng)性，5份樣品為沙門菌陽(yáng)性；采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢出3份樣品為空腸彎曲菌陽(yáng)性，5份樣品為沙門菌陽(yáng)性。兩種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果一致，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

圖2 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)空腸彎曲菌靈敏性結(jié)果Fig.2 The sensitivity results of the duplex real-time PCR for detecting Campylobacter jejunum

圖3 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)沙門菌靈敏性結(jié)果Fig.3 The sensitivity results of the duplex real-time PCR for detecting Salmonella

表2 樣品檢測(cè)結(jié)果Table 2 Sample test results

3 討論

隨著食品安全要求的不斷提高，快速檢測(cè)食品微生物在食品安全中的重要性愈加明顯?？漳c彎曲菌和沙門菌是世界范圍內(nèi)食品污染的主要病原菌之一［15］。如何快速檢測(cè)食品中空腸彎曲菌和沙門菌，縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)靈敏度，減少錯(cuò)檢、漏檢是食品病原微生物檢測(cè)的重點(diǎn)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 融合了PCR 的靈敏性和光譜技術(shù)定量精確的優(yōu)點(diǎn)，特異性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單快速，整個(gè)擴(kuò)增和產(chǎn)物分析過(guò)程均在密封單管內(nèi)完成，不需電泳和紫外或染色觀察，并通過(guò)微機(jī)控制，實(shí)現(xiàn)了對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)和自動(dòng)分析結(jié)果。該技術(shù)從根本上解決了PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物污染的問(wèn)題，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。雖然采用SYBR 染料法也可達(dá)到雙重?zé)晒舛康哪康?，但SYBR Green染料會(huì)與非特異性雙鏈DNA 結(jié)合，產(chǎn)生假陽(yáng)性，干擾實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，特別是分析表達(dá)量不高的基因時(shí)，這類情況尤其突出。而探針?lè)ǔ艘镄蛄械奶禺愋灾?，還有探針序列的特異性，可從兩個(gè)方面保證所擴(kuò)增基因的特異性。故本研究建立了基于TaqMan探針的空腸彎曲菌和沙門菌雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。

本研究結(jié)果顯示該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高。實(shí)際樣品檢測(cè)中，我們發(fā)現(xiàn)本研究建立的檢測(cè)方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測(cè)結(jié)果一致。本研究建立的空腸彎曲菌和沙門菌TaqMan探針雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，具有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和良好的應(yīng)用前景，值得在進(jìn)一步研究完善后建立標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)流程以利于推廣應(yīng)用。

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