高瑞娟，張 凱，呂嘉敏，黃永興，羅開健

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642）

空腸彎曲菌和沙門菌是引起細(xì)菌性食物中毒的常見致病菌，常污染肉、乳和禽等動物性食品。污染的食品引起腹瀉、嘔吐等急性腸胃炎癥狀，嚴(yán)重的可引起死亡［1］。據(jù)我國和世界各國的統(tǒng)計資料證明，沙門菌引發(fā)的食物中毒在細(xì)菌性食物中毒中占據(jù)首位［2-3］，現(xiàn)已成為食品公共衛(wèi)生方面的重要問題。據(jù)報道，流行病學(xué)調(diào)查表明，空腸彎曲菌作為腸炎的病因僅次于沙門菌和志賀菌，在很多地區(qū)甚至有超過沙門菌而居首位的趨勢，因而有研究報道稱空腸彎曲菌是“下一個沙門菌”［4］。此外，空腸彎曲菌的感染與人的格林-巴利綜合征等具有自身免疫特性的疾病有關(guān)［5-6］。世界衛(wèi)生組織（WHO）已將該病列為最常見的食源性傳染病之一。

空腸彎曲菌和沙門菌感染的初期癥狀非常類似，這對區(qū)分兩種疾病造成了一定的困難。對空腸彎曲菌和沙門菌的檢測，傳統(tǒng)的鑒定方法包括增菌、生理生化鑒定、血清學(xué)鑒定等，但是所需檢驗時間長，而且病原菌在食品樣品中存在的數(shù)量相對較少，使用常規(guī)選擇性平板上挑取可疑菌落的方法也可能會造成陽性菌株的漏檢?？漳c彎曲菌屬于微需氧菌，對培養(yǎng)基及培養(yǎng)氣體環(huán)境要求都比較嚴(yán)格，而且細(xì)菌的分離培養(yǎng)費時費力，當(dāng)感染或污染的量較少時，從樣品中分離出空腸彎曲菌就更加困難［7-9］。據(jù)報道，空腸彎曲菌的致病劑量很小，400個～500個菌體就可引發(fā)腸道感染［10］。因此，建立高靈敏度和高特異度的檢測方法是提高空腸彎曲菌檢測水平的重要措施。并且在一些特定條件下，空腸彎曲菌還存在著一種“存在但不可培養(yǎng)”的狀態(tài)［11-12］，這更是傳統(tǒng)分離培養(yǎng)檢測方法無法克服的難題。因此，在檢驗檢疫工作中急需一種靈敏的快速檢測方法。一些檢測方法如PCR、ELISA 都有較高的假陽性結(jié)果出現(xiàn)，所以，PCR 和ELISA 得出的結(jié)果都不能作為最終的檢測依據(jù)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，熒光定量PCR 技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原微生物檢測［13］。本研究采用熒光定量PCR 技術(shù)，建立了同時檢測空腸彎曲菌和沙門菌的雙重實時熒光定量PCR 方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種空腸彎曲菌（ATCC33291、NCTC11168）、金黃色葡萄球ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922，美國菌種保藏中心提供；鵝源結(jié)腸彎曲 菌 SCCC005、沙門菌（SCSE034、SCSE011、SCSE079）、志賀菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌，均為本實驗室分離并保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，布氏肉湯，LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，LB 營養(yǎng)肉湯，青島海博有限責(zé)任公司產(chǎn)品；新鮮脫纖維綿羊血，廣州蕊特生物技術(shù)公司產(chǎn)品；Real Master Mix試劑盒，北京天根公司產(chǎn)品；熒光定量PCR 八連管平蓋，美國AXYGEN 公司產(chǎn)品；ABI7500熒光定量PCR 儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌DNA 模板的制備 將1.1.1中所列12種菌株活化后接種于增菌液中，37 ℃（空腸彎曲菌42 ℃微需氧條件下培養(yǎng)）培養(yǎng)24h，無菌操作吸取1mL 培養(yǎng)液，參考黃金林等［14］報道的方法利用水煮法提取細(xì)菌基因組DNA，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物和探針的設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI公布的空腸彎曲菌的保守基因hipO 和沙門菌的保守基因invA 序列，利用Primer Premier 5.0和DNA Star軟件設(shè)計引物和TaqMan探針，分別使用FAM、JOE作為探針報告基團(tuán)，TAMRA 作為探針淬滅基團(tuán)。引物和探針序列見表1，由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物和探針序列Table 1 Sequences of primes and probes

1.2.3 雙重實時熒光定量PCR 體系的建立 先對每種病原菌做單體系定性反應(yīng)，在此基礎(chǔ)上對雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)的引物、探針濃度和Tm 值進(jìn)行優(yōu)化，建立最佳反應(yīng)體系。

1.2.4 特異性試驗 取1.2.1的12種標(biāo)準(zhǔn)菌株及分離菌株細(xì)菌的DNA，應(yīng)用以上建立的雙重實時熒光定量PCR反應(yīng)驗證方法的特異性。

1.2.5 靈敏度試驗 取沙門菌LB 增菌液按10倍梯度稀釋菌液，涂板，37 ℃培養(yǎng)24h后進(jìn)行平板計數(shù)，重復(fù)2次，取平均值推算出原液中含的細(xì)菌數(shù)，計數(shù)原始菌液濃度。取空腸彎曲菌布氏肉湯培養(yǎng)液，按上述沙門菌稀釋的方法稀釋后涂哥倫比亞血平板，42 ℃微需氧條件下培養(yǎng)24h后，進(jìn)行菌落計數(shù)，重復(fù)2次。將已經(jīng)測定濃度的沙門菌、空腸彎曲菌分別進(jìn)行10倍梯度稀釋，取相應(yīng)細(xì)菌濃度區(qū)間為100mol／L～106mol／L稀釋的DNA 模板，做3個重復(fù)的雙重實時熒光定量PCR反應(yīng)。

1.2.6 實際樣品檢測 采用雙重實時熒光定量PCR 方法和國家標(biāo)準(zhǔn)方法同時對隨機采集的40份冷凍雞肉類樣品進(jìn)行檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 雙重實時熒光定量PCR反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化

對引物和探針濃度及反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最佳擴增條件確定為：95 ℃2 min；95 ℃20s，60 ℃1 min，進(jìn)行45個循環(huán)。最佳反應(yīng)體系20μL：2.5×Real Master Mix（含內(nèi)參染料）8μL，上、下游引物：10μmol／L 各為1μL，探針10μmol／L 分別為0.3 μL（空腸彎曲菌）、0.7μL（沙門菌），20×probe enhancer solution 1μL，模板DNA 2μL，加超純水補足至20μL。

2.2 特異性試驗結(jié)果

雙重實時熒光定量PCR 特異性試驗結(jié)果見圖1。對2份空腸彎曲菌、3份沙門菌均產(chǎn)生明顯的擴增曲線，顯示陽性結(jié)果；同時對其他7種菌株及去離子水空白對照均不能產(chǎn)生擴增曲線，顯示陰性結(jié)果。

圖1 雙重實時熒光定量PCR 特異性擴增曲線Fig.1 Specificity amplification curves of the duplex real-time PCR

2.3 靈敏度試驗結(jié)果

最終測定的空腸彎曲菌、沙門菌原液濃度分別為1.0×107CFU／mL、2.3×106CFU／mL。靈敏度試驗結(jié)果如圖2、圖3 所示。雙重實時熒光定量PCR 靈敏度試驗結(jié)果顯示，空腸彎曲菌檢測限可達(dá)10CFU／mL，沙門菌檢測限達(dá)230CFU／mL。

2.4 實際樣品檢測結(jié)果

采用雙重實時熒光定量PCR 方法和國家標(biāo)準(zhǔn)方法對隨機采集的40份冷凍雞肉類樣品進(jìn)行同時檢測，結(jié)果顯示8份陽性，其余32份全部陰性。采用雙重實時熒光定量PCR 方法檢出3 份樣品為空腸彎曲菌陽性，5份樣品為沙門菌陽性；采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢出3份樣品為空腸彎曲菌陽性，5份樣品為沙門菌陽性。兩種檢測方法檢測結(jié)果一致，檢測結(jié)果如表2所示。

圖2 雙重實時熒光定量PCR檢測空腸彎曲菌靈敏性結(jié)果Fig.2 The sensitivity results of the duplex real-time PCR for detecting Campylobacter jejunum

圖3 雙重實時熒光定量PCR檢測沙門菌靈敏性結(jié)果Fig.3 The sensitivity results of the duplex real-time PCR for detecting Salmonella

表2 樣品檢測結(jié)果Table 2 Sample test results

3 討論

隨著食品安全要求的不斷提高，快速檢測食品微生物在食品安全中的重要性愈加明顯?？漳c彎曲菌和沙門菌是世界范圍內(nèi)食品污染的主要病原菌之一［15］。如何快速檢測食品中空腸彎曲菌和沙門菌，縮短檢測時間，提高檢測靈敏度，減少錯檢、漏檢是食品病原微生物檢測的重點。

實時熒光定量PCR 融合了PCR 的靈敏性和光譜技術(shù)定量精確的優(yōu)點，特異性強，靈敏度高，操作簡單快速，整個擴增和產(chǎn)物分析過程均在密封單管內(nèi)完成，不需電泳和紫外或染色觀察，并通過微機控制，實現(xiàn)了對PCR 擴增產(chǎn)物進(jìn)行實時動態(tài)檢測和自動分析結(jié)果。該技術(shù)從根本上解決了PCR 擴增產(chǎn)物污染的問題，提高了檢測的準(zhǔn)確性。雖然采用SYBR 染料法也可達(dá)到雙重?zé)晒舛康哪康?，但SYBR Green染料會與非特異性雙鏈DNA 結(jié)合，產(chǎn)生假陽性，干擾實驗的準(zhǔn)確性，特別是分析表達(dá)量不高的基因時，這類情況尤其突出。而探針法除了引物序列的特異性之外，還有探針序列的特異性，可從兩個方面保證所擴增基因的特異性。故本研究建立了基于TaqMan探針的空腸彎曲菌和沙門菌雙重實時熒光定量PCR檢測方法。

本研究結(jié)果顯示該方法特異性強、靈敏度高。實際樣品檢測中，我們發(fā)現(xiàn)本研究建立的檢測方法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測結(jié)果一致。本研究建立的空腸彎曲菌和沙門菌TaqMan探針雙重實時熒光定量PCR檢測方法，具有操作簡單、特異性強和靈敏度高等優(yōu)點，有較強的實際應(yīng)用價值和良好的應(yīng)用前景，值得在進(jìn)一步研究完善后建立標(biāo)準(zhǔn)化檢測流程以利于推廣應(yīng)用。

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