李嚴(yán)嚴(yán)，姜穎

肝星型細(xì)胞分離方法和功能研究進(jìn)展

李嚴(yán)嚴(yán)1,2，姜穎1

1 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所 北京蛋白質(zhì)組研究中心 蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點實驗室，北京 102206 2 清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100086

肝星型細(xì)胞 (Hepatic stellate cells, HSCs)，又叫儲脂細(xì)胞 (Fat-storing cells, FSCs) 或脂肪細(xì)胞(lipocytes)，是肝臟固有的非實質(zhì)細(xì)胞類型之一，存在于狄氏腔內(nèi)，以脂滴的形式儲存人體維生素A總量的50%–80%。原代HSCs分離方法，目前主要集中于密度梯度離心法結(jié)合離心淘洗、HSCs高側(cè)向角的流式分選法、紫外激發(fā)的自發(fā)熒光或特異性抗體標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)等，將為HSCs生理和病理研究提供堅實的基礎(chǔ)。近年來，HSCs的研究蓬勃發(fā)展，合作領(lǐng)域不斷拓寬。生理狀態(tài)下，HSCs處于靜息狀態(tài)，合成細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM) 并維持其穩(wěn)態(tài)，同時廣泛攝取和儲存維生素A，并具有調(diào)節(jié)肝細(xì)胞再生的功能；而病理狀態(tài)下，HSCs在肝損傷和持續(xù)性刺激條件下被激活，增殖活性明顯增強(qiáng)，脂滴減少或消失，ECM合成也明顯增加，具有收縮性，同時分泌多種促炎因子和粘附分子，并向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變，表明HSCs的活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。有關(guān)HSCs的分離和功能研究一直是肝臟細(xì)胞學(xué)和肝臟病理學(xué)研究的熱點之一。文中我們將系統(tǒng)總結(jié)和探討HSCs的分離方法和改進(jìn)策略，及其功能研究進(jìn)展和具有潛在價值的研究方向。

肝星型細(xì)胞，分離方法，肝臟生理功能，肝纖維化，肝再生，肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)

肝星型細(xì)胞 (Hepatic stellate cells, HSCs)，只占正常肝臟總體積的約1.4%和肝臟總細(xì)胞數(shù)的5%–8%，而且大部分位于肝小葉中心位置，即肝竇和實質(zhì)細(xì)胞之間的狄氏腔內(nèi)，極少數(shù)位于門靜脈周[1]。傳統(tǒng)的HSCs分離技術(shù)主要集中于結(jié)合膠原酶的肝臟原位灌流和體外消化，進(jìn)而通過密度梯度離心和離心淘洗等手段獲取相對純凈的HSCs[2]。HSCs的新分離技術(shù)[3]，特別是基于自發(fā)熒光和表面抗體的HSCs流式細(xì)胞分選技術(shù)，為我們提供了更多的機(jī)會加深對健康和疾病狀況下HSCs生物學(xué)功能的理解。

繼不斷完善的分離和鑒定方法出現(xiàn)后，HSCs在肝損傷和纖維化中的作用越來越明顯，證據(jù)也越來越充分，吸引了肝臟生理學(xué)家和病理學(xué)家的注意[4]。肝損傷后激活靜息期HSCs，轉(zhuǎn)化為增殖、收縮和纖維發(fā)生的肌成纖維細(xì)胞特性，大大促進(jìn)了肝纖維化進(jìn)程和逆轉(zhuǎn)機(jī)制的理解。該模式不僅在肝損傷，而且在肝臟發(fā)育、再生、異質(zhì)性反應(yīng)、中間代謝和免疫調(diào)節(jié)等都已經(jīng)取得了相當(dāng)廣泛的認(rèn)識。同樣有趣的是，HSCs顯著的可塑性不僅具有可變的中間纖維表型，也是其功能的重要體現(xiàn)。HSCs也可被視為連接復(fù)雜的肝內(nèi)環(huán)境的紐帶，嚴(yán)格調(diào)控自分泌和旁分泌的交互作用，快速響應(yīng)細(xì)胞外基質(zhì)的變化，以及精確應(yīng)答肝臟生長和修復(fù)的代謝需求[5]。對該細(xì)胞類型的深入研究將會得到更多的驚喜，揭開HSCs神秘的面紗，最終將有利于我們對肝臟生理功能的理解和肝臟疾病的診斷和治療。

1 HSCs分離方法進(jìn)展

肝臟非實質(zhì)細(xì)胞種類多樣，功能復(fù)雜，與肝臟發(fā)育及肝臟疾病密切相關(guān)。分離純化肝臟非實質(zhì)細(xì)胞類群的工作由來已久。1982年，研究者首次從大鼠中成功分離HSCs[6]，隨后逐漸建立了多種改進(jìn)的HSCs分離方法，并拓展到其他模型上，如小鼠、豬和人肝樣本，分離得到的HSCs純度、活性和得率也越來越高[7]。下面，主要總結(jié)幾種廣泛應(yīng)用的HSCs分離和純化方法。

1.1 密度梯度離心法結(jié)合離心淘洗法

密度梯度離心法主要基于不同類型細(xì)胞的密度不同而分離，因為HSCs富含脂滴，其密度最低，通常浮在梯度介質(zhì)的最上層，這樣就比較容易和其他細(xì)胞分離。但僅僅依靠密度梯度離心得到的HSCs純度較低，離心淘洗法則可進(jìn)一步富集HSCs，其中不同細(xì)胞可根據(jù)各自在重力場中沉降系數(shù)的不同實現(xiàn)分離[2]。該過程的關(guān)鍵是肝臟消化和密度梯度離心。目前廣泛采用的是改進(jìn)的Seglen 膠原酶兩步原位灌流法對小鼠肝臟進(jìn)行原位灌流，接著離體分散并消化肝臟組織，差速離心獲得肝臟的非實質(zhì)細(xì)胞群體后，利用Stractan?[8]、Nycodenz?[9]、PercollTM[10]和OptiPrepTM[11]等不同類型的密度梯度介質(zhì)進(jìn)行密度梯度離心分離純化HSCs，通常HSCs富集的密度范圍是1.025–1.035 g/mL。這些密度梯度液的結(jié)構(gòu)都不同，但都具有低滲透性和化學(xué)惰性，對細(xì)胞無毒。細(xì)胞分離后，采用HSCs經(jīng)典的標(biāo)記物，如Desmin、Vimentin、N-CAM或GFAP等檢測HSCs的分離純度，細(xì)胞培養(yǎng)或臺盼藍(lán)染色確定細(xì)胞活性[12]。

除了該方法本身外，還有多種因素影響HSCs的得率和純度，如實驗動物本身的遺傳背景、性別、年齡和營養(yǎng)狀況，以及為達(dá)到實驗?zāi)康牡奶厥馓幚淼萚2]。一個重要的前提條件是HSCs富含脂滴以降低該細(xì)胞的密度，使得HSCs密度與其他細(xì)胞差異更大，分離得到的HSCs純度更高。有研究嘗試富含維生素A飲食喂養(yǎng)實驗動物以提高HSCs的得率，同時選擇大齡實驗動物也可以在一定程度上提高得率[2]。為提高HSCs純度，也有研究者嘗試選擇性去除肝臟內(nèi)的其他非實質(zhì)細(xì)胞群，如給動物模型注射二氯亞甲基二磷酸鹽可選擇性對枯否細(xì)胞有毒性，因此可去除枯否細(xì)胞對HSCs的污染[13]，但其副作用可能對實驗本身產(chǎn)生干擾。

該法獲得的細(xì)胞可能含有一些雜質(zhì)細(xì)胞群和亞細(xì)胞顆粒，造成HSCs的污染。由于該法對操作者的要求較高，而且樣本的差異等因素導(dǎo)致不同批次的實驗結(jié)果差異較大，穩(wěn)定性不好，影響后續(xù)實驗結(jié)果的可靠性，因此需要結(jié)合高性能的儀器提高HSCs的純度。

1.2 結(jié)合HSCs細(xì)胞形態(tài)特性的流式細(xì)胞術(shù)分選法

HSCs是肝內(nèi)主要非實質(zhì)細(xì)胞群中細(xì)胞形態(tài)最小的一類，因而在沒有特異性抗體標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)分選時，HSCs具有前向角小而側(cè)向角大的特點，在流式圖中呈現(xiàn)特異性的細(xì)胞群，因而實現(xiàn)HSCs的分選，接著可以采用特異性染色的免疫細(xì)胞化學(xué)法 (如Desmin、GFAP等) 或光鏡和透射電鏡檢測HSCs純度。有研究報道，傳統(tǒng)的密度梯度離心后得到的HSCs細(xì)胞群純度約50%–70%，經(jīng)過高側(cè)向角的流式分選后細(xì)胞純度超過96%[12]。

1.3 自發(fā)熒光的流式細(xì)胞術(shù)分選法

最近的一些研究是基于HSCs富含維生素A的特性實現(xiàn)細(xì)胞分選，即剛分離的HSCs胞漿中含有大量的脂滴，并因大量的維生素A在紫外光的激發(fā)下自發(fā)藍(lán)綠色熒光。為檢測HSCs的自發(fā)熒光并收集這群細(xì)胞，該方法需要配備355 nm激發(fā)光的流式細(xì)胞儀實現(xiàn)HSCs的分選，因而對儀器的要求較高。有研究采用經(jīng)典的膠原酶灌流法消化肝臟后進(jìn)行密度梯度離心富集非實質(zhì)細(xì)胞，然后結(jié)合HSCs自發(fā)熒光的流式分選獲得高純度的HSCs[14]。

還有一個需要考慮的問題是，由于HSCs每個細(xì)胞的脂滴含量不同，因而其自發(fā)熒光呈現(xiàn)一定的彌散性，與陰性細(xì)胞的分群不太明顯，還有部分弱陽性細(xì)胞群，導(dǎo)致該細(xì)胞分選時的得率較低，而且獲得的細(xì)胞只是HSCs中含有較多脂滴的一類，這樣造成了一定的細(xì)胞選擇偏性。

1.4 抗體標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)分選法

目前，抗體標(biāo)記HSCs的流式細(xì)胞術(shù)分選純化的HSCs還比較少，主要是因為沒有公認(rèn)的適合HSCs流式分選的細(xì)胞表面標(biāo)記物[15]。有研究采用GFAP標(biāo)記HSCs進(jìn)行流式分選，再采用Desmin等免疫標(biāo)記檢測分選純度，但沒有推廣。

為克服這一缺陷，還有采用負(fù)選分離HSCs?？紤]到肝內(nèi)細(xì)胞類型的有限性，以及經(jīng)過一定的初分離后得到非實質(zhì)細(xì)胞群，密度梯度離心后得到的細(xì)胞群只有淋巴細(xì)胞、枯否細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和HSCs，其他類型的細(xì)胞幾乎可以忽略不計。淋巴細(xì)胞公認(rèn)的細(xì)胞表面標(biāo)記物是CD3 (T淋巴細(xì)胞特異) 和CD19 (B淋巴細(xì)胞特異)，枯否細(xì)胞公認(rèn)的細(xì)胞表面標(biāo)記物是F4/80，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞公認(rèn)的細(xì)胞表面標(biāo)記物是CD146。因此，整體細(xì)胞群標(biāo)記以上所有的抗體后篩選的陽性細(xì)胞群就是除HSCs外的細(xì)胞，選擇陰性目的細(xì)胞群就是HSCs，這樣可以排除掉前3種細(xì)胞的干擾，分選得到純凈的HSCs[3]。同時，如果采用不同的熒光標(biāo)記，這也為我們提供了一個同時分選不同類型細(xì)胞的策略。

相比于傳統(tǒng)的密度梯度離心，流式分選HSCs有幾個明顯的優(yōu)勢：首先，HSCs純度得到了極大的提高，結(jié)合HSCs細(xì)胞特異性的分選和負(fù)選策略，有效排除了其他類型非實質(zhì)細(xì)胞對后續(xù)實驗的干擾，如淋巴細(xì)胞、枯否細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞等。其次，不同的細(xì)胞群特異性標(biāo)記不同的熒光抗體，可以同時進(jìn)行多通道分離，這樣利于全面綜合比較同一批次動物模型肝臟不同細(xì)胞群的生物特性。最后，該分選方法的適用對象更廣泛，相比于手工分選的密度梯度離心法對實驗對象的嚴(yán)格要求，該方法適用于年幼動物和一些較難分離得到HSCs的動物模型 (如肝損傷模型和基因敲除模型)，因此可用于HSCs在病理過程中的作用分析。當(dāng)然，流式分選的一個主要問題是細(xì)胞分選速率較慢，細(xì)胞損耗較大，得到的HSCs較少，因而得加大樣本量，已得到足夠的細(xì)胞，用于后續(xù)實驗。

總之，在本實驗室廣泛嘗試和比較的基礎(chǔ)上，傳統(tǒng)的密度梯度離心結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分離純化HSCs，可以獲得高純度的HSCs，大大促進(jìn)了HSCs的生物學(xué)研究。當(dāng)然，尋找HSCs特異性細(xì)胞表面標(biāo)記物的工作仍在繼續(xù)，如果找到這樣的特異性標(biāo)記物，就可以簡化現(xiàn)有的HSCs分選過程，建立新的一步分選方法，顯著減少細(xì)胞分選時間，提高HSCs得率。

2 HSCs功能研究進(jìn)展

2.1 HSCs生理功能研究進(jìn)展

HSCs，作為肝臟特異性的間質(zhì)細(xì)胞，在肝臟生理過程中發(fā)揮著重要的作用。HSCs負(fù)責(zé)基底膜、ECM、細(xì)胞因子和趨化因子等眾多生物活性分子的合成，維生素A和類維生素A的儲存和代謝等。HSCs的主要功能如圖1所示，這里重點討論了HSCs在類維生素A代謝和生長因子和細(xì)胞因子合成中的作用。

2.1.1 HSCs在類維生素A代謝中的作用

生理條件下，HSCs的胞漿中主要以富含視黃酯的脂滴形式儲存著人體50%–80%的維生素A，該細(xì)胞同時參與調(diào)控維生素A的轉(zhuǎn)運和存儲[16]。為保持體內(nèi)正常的視黃酸濃度，類維生素A代謝是至關(guān)重要的。研究表明[17]，胞漿中的類維生素A結(jié)合蛋白參與調(diào)控自由類維生素A的濃度，同時將類維生素A與結(jié)合蛋白的復(fù)合體轉(zhuǎn)運至關(guān)鍵酶部位進(jìn)行代謝。例如，視黃醇結(jié)合蛋白(Cellular retinol-binding protein, CRBP) 參與視黃醇吸收、視黃醇酯化和維生素A調(diào)動。與不同化學(xué)特性和異構(gòu)形式的類維生素A結(jié)合的結(jié)合蛋白也有多種類型，位于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外，表明類維生素A可能結(jié)合在細(xì)胞膜上或與胞內(nèi)特定的結(jié)合蛋白結(jié)合，如反式視黃醇與血清中RBP結(jié)合 (又稱為RBP4)，而胞內(nèi)反式視黃醇及其氧化物反式視黃醛與CRBP的3種異構(gòu)體之一結(jié)合 (又分別稱為RBP1、RBP2和RBP3)。同時，特定的類維生素A結(jié)合蛋白在運輸、代謝和調(diào)控特定類維生素A的行為時具有獨特的功能[18]。然而，維生素A從HSCs釋放至血漿中的機(jī)制仍存在較大爭議。從肝臟中分離的原代HSCs檢測到RBP mRNA的表達(dá)；蛋白質(zhì)印跡 (Western blotting) 分析，培養(yǎng)的HSCs分泌RBP，并且向其中加入3H標(biāo)記的視黃酯后檢測到了放射性的視黃醇-RBP復(fù)合物[19]。進(jìn)一步研究表明[20]，外源性RBP加入HSCs培養(yǎng)基后，視黃醇的分泌量增加。這些數(shù)據(jù)表明體內(nèi)HSCs直接調(diào)動視黃醇至血液，不需要介質(zhì)的傳遞，其他組織的星型細(xì)胞可能存在同樣的機(jī)制。然而，負(fù)責(zé)從HSCs中動員視黃醇的分子機(jī)制尚未詳細(xì)闡明。

類維生素A調(diào)控HSCs活化的生物學(xué)功能仍是未知的，而且現(xiàn)有的研究表明類維生素A對HSCs的作用和促纖維生成是相互矛盾的[21-22]。在體外培養(yǎng)條件下，視黃醇和視黃酸抑制HSCs的增殖，而視黃酸的效果是視黃醇的1 000倍[23]。與此相反，視黃酸的兩種代謝產(chǎn)物卻通過上調(diào)纖溶酶原激活劑促進(jìn)纖維發(fā)生，這又反過來誘導(dǎo)TGF-β的合成和激活[24]。另一項大鼠膽管結(jié)扎的肝纖維化模型研究表明，TGF-β合成的增加歸因于HSCs中視黃酸的減少[25]。

2.1.2 HSCs合成生長因子和細(xì)胞因子的作用

HSCs是肝臟中細(xì)胞因子的重要來源。這些細(xì)胞因子結(jié)合到膜受體上啟動的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程是正常和受損肝臟中細(xì)胞與細(xì)胞相互作用的主要形式。HSCs不僅能分泌生長因子，而且能做出相應(yīng)的響應(yīng)[26]。其中，兩個重要的表皮生長因子[27]，TGF-ɑ和EGF，在肝細(xì)胞增殖過程中起著重要的作用，同時也刺激HSCs的分裂，這樣形成了一個HSCs活化的自分泌環(huán)。HSCs合成的HGF也是一種重要的肝細(xì)胞有絲分裂原[28]。血小板衍生生長因子PDGF是目前最有效的HSCs有絲分裂原[29]。肝損傷時，HSCs合成PDGF和PDGFR的量顯著上調(diào)，增強(qiáng)HSCs的增殖能力。另一個例子是酸性成纖維因子aFGF[30]。PDGFR[31]是第一個在HSCs中鑒定到的膜受體。活化的PDGFR招募信號分子Ras，進(jìn)而激活ERK/MAPK通路。而且，PI3K和STAT-1也參與HSCs中的PDGF信號級聯(lián)通路。PDGFR也用于開發(fā)直接以HSCs為治療目標(biāo)的靶向試劑。

有證據(jù)表明，HSCs可能是維持肝組織結(jié)構(gòu)中ECM穩(wěn)態(tài)的最重要的細(xì)胞[32]。ECM在調(diào)節(jié)相互接觸的細(xì)胞行為方面發(fā)揮著復(fù)雜的作用，影響細(xì)胞的形態(tài)、發(fā)育、遷移、增殖和功能。有研究表明[33]，ECM調(diào)節(jié)HSCs合成膠原的類型，HSCs對細(xì)胞因子的響應(yīng)，以及HSCs的形態(tài)、增殖和功能。正常情況下，HSCs是合成和降解ECM的速率處于動態(tài)平衡中，因而不會產(chǎn)生ECM的沉積。

圖1 HSCs的生理和病理功能[34-35]Fig. 1 Physiological and pathological functions of HSCs (From Atzori et al[34], Yin et al[35]).

圖2 HSCs活化過程和效應(yīng)以及逆轉(zhuǎn)方向示意圖[5]Fig. 2 Diagram of HSCs activation, effect and reversion (From Friedman[5]).

2.2 HSCs病理功能研究進(jìn)展

HSCs，肝臟非實質(zhì)細(xì)胞中的一種，儲存脂肪和類維生素A，合成膠原蛋白和細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)等，同時分泌一些細(xì)胞因子和其他介質(zhì)，在肝纖維化發(fā)生發(fā)展和肝再生過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。實驗性肝損傷后，HSCs大量增殖，而去除損傷因素后，HSCs數(shù)量也漸漸恢復(fù)正常。闡明HSCs如何響應(yīng)肝損傷以及損傷后的修復(fù)過程是理解肝纖維化等其他疾病的關(guān)鍵。特別是，HSCs活化作為肝纖維化的一個關(guān)鍵事件為解析肝損傷響應(yīng)提供了一個重要框架。以下主要集中探討肝纖維化和肝再生過程中HSCs的作用。

2.2.1 HSCs在肝纖維化過程中的作用

肝纖維化是由多種持續(xù)性損傷因素導(dǎo)致的急性或慢性肝病的組織學(xué)變化，多種細(xì)胞、刺激因素和活性因子等復(fù)雜作用的結(jié)果。越來越多的研究表明[36]，HSCs活化并向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變以及活化的HSCs引起的一系列生物學(xué)效應(yīng)是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。HSCs活化[37]主要包括兩個階段：起始階段和永生階段。如果肝損傷因素消退后，肝纖維化可能減輕，甚至消退，此時活化的HSCs發(fā)生細(xì)胞凋亡，或逆轉(zhuǎn)至靜息狀態(tài)的表型，這個過程稱為修復(fù)階段。起始階段，又稱為促炎階段，指的是早期細(xì)胞響應(yīng)細(xì)胞因子和其他刺激的基因表達(dá)和表型的變化。起始主要由旁分泌刺激引起，主要是周圍細(xì)胞外基質(zhì)的變化，以及暴露在脂質(zhì)過氧化物和受損肝實質(zhì)細(xì)胞釋放的產(chǎn)物下。永生階段主要由于這些刺激維持活化的表型并產(chǎn)生纖維化，其中涉及自分泌以及旁分泌循環(huán)，包含多個獨立的響應(yīng)包括維生素A丟失、增殖、收縮性、纖維生成、基質(zhì)降解和炎性細(xì)胞浸潤等。HSCs活化的過程和效應(yīng)通路以及逆轉(zhuǎn)方向如圖2所示。HSCs活化最熟知的早期標(biāo)志是類維生素A脂滴的消失，H S C s向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，但該事件是HSCs活化的起因還是結(jié)果尚未闡明。關(guān)于隨后的類維生素A介導(dǎo)的細(xì)胞信號下調(diào)的問題，進(jìn)一步的研究應(yīng)該集中于是否會出現(xiàn)類維生素A消失和纖維增生和炎癥細(xì)胞因子過表達(dá)這兩者的負(fù)相關(guān)效應(yīng)。

靜息期的HSCs不會發(fā)生有絲分裂，而活化后HSCs開始增殖。多種生長因子和細(xì)胞因子對HSCs有促增殖作用，其中血小板衍生生長因子PDGF是最強(qiáng)的促分裂素，而且在這階段PDGFR的表達(dá)也誘導(dǎo)增強(qiáng)。PDGF與HSCs受體PDGFR結(jié)合后，激活酪氨酸激酶和3-磷酸肌醇，促進(jìn)HSCs增殖和遷移，并誘導(dǎo)TGF-β的表達(dá)[38]。

雖然HSCs的收縮功能在正常情況下對肝血流調(diào)節(jié)的作用仍不清楚，但卻是肝纖維化時肝內(nèi)門靜脈高壓的主要決定因素[39]。HSCs顯著收縮性的主要刺激因素是內(nèi)皮素ET-1[40]。ET-1經(jīng)自分泌和旁分泌途徑作用于活化的HSCs受體ETBR和ETAR，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的鈣釋放并引起細(xì)胞外的鈣離子經(jīng)二氫吡啶非敏感性鈣通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起鈣的增加，因而發(fā)生細(xì)胞收縮和增生。肝損傷后，HSCs中ET-1的表達(dá)量顯著增加而NO的合成減少，HSCs收縮性增強(qiáng)，導(dǎo)致肝內(nèi)門靜脈壓升高。而且，ET-1促進(jìn)培養(yǎng)早期的HSCs增殖，但抑制HSCs的完全活化。有趣的是，HSCs同樣也能合成NO[41]，作為ET-1的生理拮抗劑，NO可能在肝損傷時維持微循環(huán)發(fā)揮一定的作用。以HSCs收縮性為靶向的策略為治療肝內(nèi)門靜脈高壓提供了一個新的視角。

活化的HSCs開始增殖并合成大量的Ⅰ型膠原，還有ECM、金屬蛋白酶MMP及其抑制物，尤其是Ⅳ型膠原酶、TIMP-1等，還能大量表達(dá)各種炎性因子、趨化因子和細(xì)胞因子等，進(jìn)而引起ECM沉積并誘發(fā)肝竇毛細(xì)血管化及小葉纖維化[4]。在活化的HSCs分泌的大量細(xì)胞因子中，TGF-β1[42]作為最強(qiáng)的促膠原生成因子最可能代表對肝纖維化過程中膠原過量合成和積累的影響。TGF-β1結(jié)合到細(xì)胞表面特定受體(TGFRⅠ和TGFRⅡ)上，然后通過Smad家族的胞內(nèi)介質(zhì)將信號傳遞至核，誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄。從目前的研究來看，TGF-β1信號通路的調(diào)控和抑制可能是抗纖維化療法的可行性方案[43]?；罨腍SCs合成并分泌TIMP-1[44]，抑制MMPs的功能，從而抑制膠原降解，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展，因此TIMPs與MMPs調(diào)控機(jī)制的異?？赡苁悄z原沉積和促纖維化的原因。

同時，細(xì)胞因子表達(dá)量的升高或活性的增強(qiáng)也是HSCs持續(xù)性活化很重要的因素[34]。HSCs自身釋放的細(xì)胞因子放大了炎癥和促纖維化的組織反應(yīng)，基質(zhì)蛋白酶也可能加速正?；|(zhì)的替代過程，形成一個典型疤痕組織。同時，其他類型細(xì)胞旁分泌的作用也功不可沒?？莘窦?xì)胞的浸潤和激活有助于HSCs的活化，枯否細(xì)胞刺激基質(zhì)合成，細(xì)胞增殖，以及通過細(xì)胞因子和活性氧中間體或脂質(zhì)過氧化物的作用促進(jìn)HSCs釋放類維生素A。早期損傷時，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞合成細(xì)胞纖連蛋白，刺激HSCs的活化，而且該細(xì)胞也可能參與激活TGF-β成為促纖維生成的形式。血小板[45]也會合成PDGF，TGF-β和EGF，維持HSCs的活化狀態(tài)。而且，肝損傷時肝實質(zhì)細(xì)胞的大量壞死會產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化物，促進(jìn)HSCs的膠原合成，也通過Fas途徑促炎和促纖維發(fā)生[46]。

但是，肝纖維化過程還有其他顯著的動態(tài)變化，如炎性細(xì)胞的浸潤、炎癥因子的調(diào)節(jié)等，因此需綜合考慮多種因素對肝纖維化發(fā)生發(fā)展的影響，進(jìn)而找到抗纖維化的解決辦法。體外塑料培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的HSCs可自發(fā)活化，與體內(nèi)肝損傷后的活化過程相似，可以作為體外肝纖維化模型，用于探討肝纖維化的形成機(jī)制、細(xì)胞間的相互關(guān)系及抗肝纖維化藥物的篩選[47]。以HSCs為靶向的肝纖維化治療策略[48]主要包括：①直接抑制HSCs的活化；②抑制HSCs的增殖和表型轉(zhuǎn)變，以及炎癥反應(yīng)；③促進(jìn)活化的HSCs凋亡或逆轉(zhuǎn)至靜息狀態(tài)；④消除持續(xù)性損傷因素，改變HSCs活化事件中顯著性的表型，如促進(jìn)基質(zhì)蛋白酶類的表達(dá)以減少ECM的過度沉積，恢復(fù)HSCs的儲脂狀態(tài)，降低門靜脈壓等。

綜上所述，HSCs活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，ECM沉積是肝纖維化形成最直接的原因，所有以HSCs為中心的探究都是為尋找肝纖維化的治療策略。盡管目前對HSCs的研究已取得很大的進(jìn)展，但仍有很多問題有待深入，例如：1) 維生素A在HSCs活化中起著什么樣的作用，以及如何發(fā)揮這種作用；2) 不同損傷因素誘導(dǎo)的肝纖維化的差異形成的原因；3) 肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中不同類型細(xì)胞的相互作用及其分子機(jī)制；4) 肝纖維化的基因治療；5) 肝纖維化逆轉(zhuǎn)的調(diào)控因素；6) 以HSCs為靶細(xì)胞的肝纖維化治療方法；7) 特異性阻斷劑或激活劑的安全性和有效性臨床研究等。最有前景的抗纖維化藥物主要類型是細(xì)胞因子調(diào)節(jié)劑、血管收縮劑和抗氧化劑等，期望有效緩解甚至攻克肝纖維化。

2.2.2 HSCs在肝再生過程中的作用

活化的HSCs會合成血管新生因子，分泌調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞和肝實質(zhì)細(xì)胞增殖的因子，以及重塑ECM，進(jìn)而協(xié)助肝再生[49]。一些研究結(jié)果表明，在祖細(xì)胞介導(dǎo)的肝再生過程中，HSCs可能通過表皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生肝實質(zhì)細(xì)胞[50]。為證實HSCs參與肝再生，在對乙酰氨基酚和2AAF/PH分別誘導(dǎo)的肝損傷模型中，使用膠霉毒素[51]和L-半胱氨酸[52]抑制活化的HSCs后，肝實質(zhì)細(xì)胞和卵圓細(xì)胞的正常再生反應(yīng)都受到了抑制。而且，CCl4誘導(dǎo)損傷的Foxf1+/-小鼠HSCs的活性明顯下降，以及再生周期中肝實質(zhì)細(xì)胞的壞死情況更加嚴(yán)重[53]。這說明HSCs調(diào)控其他肝臟細(xì)胞的功能，其活性狀態(tài)對肝再生過程有著重要影響。然而，活化的HSCs調(diào)節(jié)肝再生的機(jī)制仍然有待進(jìn)一步探討，HSCs不同亞型的相對重要性可能取決于肝臟受損的類型。

活化的HSCs合成一系列的細(xì)胞因子和趨化因子，這些因子直接增強(qiáng)肝祖細(xì)胞和肝實質(zhì)細(xì)胞的增殖能力或通過肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞間接促進(jìn)肝再生。在大鼠2AAF/PH肝損傷模型的肝再生早期階段收集培養(yǎng)HSCs的條件型培養(yǎng)基檢測發(fā)現(xiàn)，HGF高表達(dá)并且促進(jìn)卵圓細(xì)胞的增殖[54]。HSCs合成HGF的一個潛在介質(zhì)是神經(jīng)營養(yǎng)因子受體P75NTR，其主要在纖維化肝損傷的人HSCs中表達(dá)。體外實驗證實，P75NTR缺陷型小鼠的HSCs不能分化為肌成纖維細(xì)胞，而且在纖溶酶原缺陷型 (Plg-/-) 小鼠中，纖維素沉積誘導(dǎo)肝損傷。因此，在P75NTR缺陷型小鼠和Plg雙敲小鼠模型中，HGF的合成和肝實質(zhì)細(xì)胞增殖受損。體外研究表明[55]，P75NTR缺陷型HSCs中Rho的持續(xù)激活可以恢復(fù)HSCs的分化能力。因此，這些結(jié)果共同支持一個模型，即在肝再生過程中，P75NTR通過Rho促進(jìn)HSCs活化，而且活化的HSCs分泌HGF進(jìn)而刺激肝實質(zhì)細(xì)胞增殖。

活化的HSCs是基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑的主要來源[56]，主要參與ECM重塑。細(xì)胞因子的合成和ECM重塑很可能是相伴隨的，因為ECM能隔離生物活性分子。因此，除了直接分泌細(xì)胞因子，活化的HSCs還可能通過從ECM中剪切或釋放細(xì)胞因子進(jìn)而調(diào)節(jié)其功能。

肝再生是一個多步驟的復(fù)雜過程，其中包括肝生長的起始和終止。當(dāng)肝臟達(dá)到生物體所需的質(zhì)量時會停止再生。最著名的肝細(xì)胞抗增殖因子是TGF-β，而HSCs是合成TGF-β的主要細(xì)胞類型之一[57]。那么，HSCs是如何調(diào)控肝再生的起始和終止的呢？可能的一個解釋是“HGF-TGF-β1平衡理論”：如前所述，肝再生早期階段HSCs高表達(dá)HGF，該分裂素可能超過了TGF-β1的抗增殖效應(yīng)；而在肝再生終端階段，HSCs合成并分泌高水平的TGF-β1進(jìn)而，抑制肝實質(zhì)細(xì)胞的增殖，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究證實，在原代培養(yǎng)的小鼠HSCs中，5-羥色胺能通過5-羥色胺2B (5-HT2B) 受體提高TGF-β1的表達(dá)主要，而在PH、BDL和CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型中，抑制5-HT2B能促進(jìn)肝實質(zhì)細(xì)胞的增殖[58]。因此，HSCs可能通過改變肝再生過程中的細(xì)胞因子表達(dá)譜調(diào)節(jié)肝再生的起始和終止。

任何單一的動物模型都不可能完全模擬人類肝臟再生的所有相關(guān)方面，特別是還要考慮到介導(dǎo)肝再生的細(xì)胞和分子通路可能取決于肝臟受損類型而稍微有些改變。因此，未來有關(guān)HSCs調(diào)控肝再生過程的研究可能需要多種可用的動物模型來提供互補(bǔ)的啟示。嚙齒動物模型的優(yōu)勢在于能夠在體外分離、培養(yǎng)和激活HSCs，以便后續(xù)集中于肝再生分子機(jī)制的研究。另一方面，斑馬魚的活體成像技術(shù)非常適合研究肝再生過程中細(xì)胞間相互作用[59]。與嚙齒動物模型類似，部分肝切除或有毒化學(xué)物質(zhì)刺激也可以用來誘導(dǎo)斑馬魚的肝再生[60]。遺傳工具也可以用于開發(fā)肝再生模型，其中包括硝基還原酶/甲硝唑細(xì)胞消融系統(tǒng)[61]和線粒體導(dǎo)入基因的嗎啉基敲低[62]誘導(dǎo)肝實質(zhì)細(xì)胞死亡的模型。還一種可行的方法是在各種類型肝損傷的斑馬魚模型中進(jìn)行高通量的化學(xué)篩選，尋找肝再生過程中影響HSCs的藥物[63]。

隨著HSC研究的全面深入，HSC還參與多種肝病的發(fā)生發(fā)展過程并發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。例如，活化的HSCs可能導(dǎo)致酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪肝病和肝炎中的微血管血流失調(diào)[64]。HSC對肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移也有舉足輕重的作用。大多數(shù)的證據(jù)表明[35]，纖維化促進(jìn)肝癌，但在一些臨床背景中，纖維化和HCC可能在相同因素的刺激下同時發(fā)生，而不是一個促進(jìn)另一個。

2.3 HSCs蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展

越來越多的細(xì)胞和分子生物學(xué)水平的研究證據(jù)表明HSC在肝臟生理和病理狀態(tài)下都發(fā)揮重要的功能，而從基因組和蛋白質(zhì)組水平全面揭示HSC的功能則成為HSC研究的發(fā)展趨勢。因此，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展和不斷創(chuàng)新，HSC的蛋白質(zhì)組功能研究也越來越全面和深入。

HSC的蛋白質(zhì)組研究初期主要集中于不同狀態(tài)下HSC蛋白質(zhì)表達(dá)的差異分析，這有助于尋找參與或調(diào)控HSC活化的重要分子。2001年，Kristensen等[65]研究鑒定到大鼠HSC在靜息和活化兩種狀態(tài)下共150多種蛋白質(zhì)的表達(dá)，其中有43種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平顯著變化，這些數(shù)據(jù)為全面解析HSC活化與肝纖維化的關(guān)系提供了重要線索。同時，進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)一種與HSC活化相關(guān)的蛋白質(zhì)STAP，其在活化的HSC中高表達(dá)，靜息期HSC表達(dá)量少，同時在肝臟其他類型細(xì)胞中則不表達(dá)，提示STAP可能在HSC活化過程中起重要作用。分子功能研究證實，STAP是內(nèi)源性過氧化物酶，參與脂質(zhì)過氧化物的代謝，可能作為HSC活化的特異性標(biāo)志物。此后，以各種肝病動物模型為基礎(chǔ)，HSC的蛋白質(zhì)組研究蓬勃發(fā)展。Schwabe課題組[66]構(gòu)建了小鼠的CCl4注射和膽管結(jié)扎的肝損傷模型，與正常小鼠為對照，構(gòu)建了靜息狀態(tài)、體內(nèi)和體外活化狀態(tài)的HSC的蛋白質(zhì)差異表達(dá)譜，共鑒定到2 073個差異蛋白質(zhì)，其中1 161個蛋白質(zhì)顯著上調(diào)，而912個顯著下調(diào)。而且，體內(nèi)與體外活化的HSC的表達(dá)譜存在較大的差異，而CCl4注射和膽管結(jié)扎的肝損傷模型則沒有多大的差別，表明HSC在體內(nèi)和體外的活化形式是不同的，而損傷類型對HSC的活化沒有影響，揭示了體內(nèi)研究的必要性。同時，與枯否細(xì)胞共培養(yǎng)或內(nèi)毒素誘導(dǎo)的實驗證明HSC活化依賴于微環(huán)境中細(xì)胞因子的作用。后續(xù)的蛋白質(zhì)功能分析篩選出一些與促炎、抗凋亡等生物過程相關(guān)的分子進(jìn)行深入驗證，為深入研究HSC的活化機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。再者，HSC蛋白質(zhì)組研究鑒定到了多種狀態(tài)下的HSC蛋白質(zhì)，其數(shù)據(jù)的廣泛性使得構(gòu)建HSC細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)成為可能，有助于采用系統(tǒng)生物學(xué)的概念和工具從完整的信號通路和代謝途徑等方面解析HSC的功能[67]。在慢性肝病進(jìn)程中，顯著的特征之一是HSC活化后向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變，其中膠原蛋白的沉積形成疤痕組織。目前，系統(tǒng)生物學(xué)方法利用HSC的組學(xué)數(shù)據(jù)，構(gòu)建膠原蛋白的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而探究肝纖維化起始和發(fā)展過程中該信號介導(dǎo)的分子事件，尋找阻止纖維化發(fā)展的解決辦法。最后，HSC與肝臟其他類型細(xì)胞的相互作用在肝病發(fā)生發(fā)展中的作用也逐漸得到深入挖掘。Coulouarn等[68]通過肝實質(zhì)細(xì)胞和活化的HSC共培養(yǎng)證實兩者存在緊密的相互作用，導(dǎo)致功能性的基因網(wǎng)絡(luò)失調(diào)，而且這種雙向作用通過誘導(dǎo)HSC中VEGFA和MMP9的表達(dá)形成促血管生成的微環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞遷移，使肝纖維化逐漸發(fā)展為肝癌。

蛋白質(zhì)組技術(shù)為全面揭示HSC的功能提供了契機(jī)，有望篩選出特異性的診斷標(biāo)志物，明確HSC參與肝病發(fā)生發(fā)展的分子事件和信號網(wǎng)絡(luò)，為肝臟疾病的診斷和治療提供新的思路。

3 展望

HSCs一直是細(xì)胞學(xué)和肝病學(xué)的重點研究對象之一，近幾十年來取得了重大進(jìn)展和突破。隨著研究的不斷深入和拓展，HSCs千變?nèi)f化的功能已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出任何人的想象，但是仍有很多關(guān)鍵問題懸而未決，有待深入探索，很難預(yù)測有關(guān)該細(xì)胞的研究還會出現(xiàn)什么意外的驚喜。例如，HSCs在肝臟發(fā)育和再生中的多能性和功能都值得細(xì)致探究，并有待開發(fā)更好的遺傳模型來證實HSCs的功能。有必要繼續(xù)闡明HSCs的免疫功能，特別是其對肝臟高免疫耐受功能的貢獻(xiàn)，以及其在病毒感染 (包括艾滋病)、抗宿主反應(yīng)和肝纖維發(fā)生中的重要作用。再者，有關(guān)HSCs和炎性細(xì)胞亞群之間微妙而復(fù)雜的相互作用的更多的證據(jù)也逐漸浮出水面。仍有待收集的證據(jù)和證實更多的假設(shè)來證明在體內(nèi)活化的HSCs能逆轉(zhuǎn)至靜息狀態(tài)，當(dāng)然這需要復(fù)雜的遺傳模型，也可以為細(xì)胞的顯著可塑性提供進(jìn)一步的證據(jù)。利用HSCs支持培養(yǎng)的肝細(xì)胞分化和體內(nèi)肝細(xì)胞的移植也是有巨大前景的新功能。基于這些發(fā)現(xiàn)，在肝輔助設(shè)備中利用HSCs值得進(jìn)一步的研究，可能會為晚期肝病患者創(chuàng)建新的治療方案?？梢钥隙ǖ氖?，在可預(yù)見的未來，HSCs將繼續(xù)吸引和激發(fā)肝臟生物學(xué)家、免疫學(xué)家和臨床醫(yī)生從事相關(guān)的研究。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Update on isolation and functional research of hepatic stellate cells

Yanyan Li1,2, and Ying Jiang1
1 State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center, Beijing Institution of Radiation Medicine, Beijing 102206, China 2 School of Life Science, Tsinghua University, Beijing 100086, China

Hepatic stellate cells (HSCs), also called Ito cells or lipocytes, are one of inherent liver nonparenchymal cell types located in the Dissé space between hepatocytes and sinusoidal endothelial cells, and account for up to 50%?80% of vitamin A in the form of lipid drops. The methods of primary HSCs isolation mainly focus on density gradient centrifugation combined with centrifugal elutriation, side scatter-activated cell sorting, UV-excited autofluorescence or antibody-based flow cytometry, etc., and will provide solid foundation for the research on physiological and pathological HSCs function. The research of this vitamin A-storing cells has developed and expanded vigorously. In physiological conditions, HSCs are quiescent and play pivotal roles in the synthesis of extracellular matrix (ECM) to maintain its stability with broad uptake and storage of vitamin A, and also regulate liver regeneration. But in pathological conditions, HSCs are activated by constant stimulations or liver injury, then with activated proliferation, reduced lipid drops, and increased ECM synthesis. Morphology of these cells also changes from the star-shaped stellate cells to that of fibroblasts or myofibroblasts with obvious contractibility and secretion of cytokines and chemokines including a variety of proinflammatory factors and adhesion molecules, suggesting that the activation of HSCs is one of the key events in the development of liver fibrosis. Study on the isolation and function of HSCs is always one of the hot topics for liver biology. In this review, we systematically summarize and discuss the recent advances in our understanding of the isolation methods and improvements of HSCs, and functional research of HSCs biology in health and disease, as well as potential directions.

Hepatic stellate cells (HSCs), isolation method, liver physiology, liver fibrosis, liver regeneration, liver proteomics

March 22, 2014; Accepted: June 4, 2014

Ying Jiang. Tel: +86-10-80705299; E-mail: jiangying304@hotmail.com

李嚴(yán)嚴(yán), 姜穎. 肝星型細(xì)胞分離方法和功能研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報, 2014, 30(7): 1059–1072.

Li YY, Jiang Y. Update on isolation and functional research of hepatic stellate cells. Chin J Biotech, 2014, 30(7): 1059–1072.

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 81123001).

國家自然科學(xué)基金 (No. 81123001) 資助。

時間：2014-06-27 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140174.html