李 慶，張 雪，余昌萍，汪 娟，余晶晶，張盛周

(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物環(huán)境與生態(tài)安全省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241000)

虎紋蛙(Rana rugulosa)隸屬兩棲綱(Amphibia)、無尾目(Anura)、蛙科(Ranidae)，在我國分布較廣，長江以南各省均有較多分布，俗名田雞、水雞等，體型大、肉味鮮美，歷來是人們喜愛的美味佳肴，在市場上很受歡迎，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值［1］。近年來，由于過度捕殺和生態(tài)環(huán)境的惡化，虎紋蛙數(shù)量正急劇減少，有的地區(qū)漸危甚至瀕危，已列為國家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物。為保護(hù)野生動(dòng)物資源，同時(shí)滿足人們的生活需求，近年來虎紋蛙的人工養(yǎng)殖已越來越受到重視［2，3］。

消化酶的活力是反映動(dòng)物消化機(jī)能的一項(xiàng)重要指標(biāo)，研究消化酶的活力及其影響因素可了解動(dòng)物對(duì)食物不同成分的消化能力，進(jìn)而為確定動(dòng)物飼料成分與配料比，優(yōu)化養(yǎng)殖條件，提高養(yǎng)殖效率提供理論指導(dǎo)。目前，對(duì)低等脊椎動(dòng)物消化酶的研究主要集中在經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖型魚類［4-11］和爬行類［12-14］，近年來對(duì)兩棲類消化酶的研究報(bào)道也逐漸增多［15-21］。本實(shí)驗(yàn)室曾對(duì)虎紋蛙消化道蛋白酶活力進(jìn)行過研究［21］，虎紋蛙屬肉食性，實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)虎紋蛙消化道亦有較高的淀粉酶和脂肪酶活力，本文特對(duì)此進(jìn)行報(bào)道，為虎紋蛙的人工養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鮮活的虎紋蛙成體購自蕪湖市鏡湖區(qū)黃山西路菜市場，重150 g～200 g。將虎紋蛙雙毀髓處死，解剖，迅速取出完整消化道，去除其表面雜物，用4℃預(yù)冷的0.65%的生理鹽水快速洗凈，按食道、胃、前腸、中腸和后腸取材，用吸水紙輕輕吸干，稱重。

1.2 酶液的制備

依據(jù)所稱組織的質(zhì)量克數(shù)，食道、胃加入5倍質(zhì)量的4℃預(yù)冷蒸餾水;其它部位加入10倍質(zhì)量的4℃預(yù)冷蒸餾水，在冰水浴中充分勻漿，搗成糜狀，以4000 r/min冷凍離心10 min，取上清液即為粗酶液。保存于4℃冰箱中，8 h內(nèi)分析完畢;或 －20℃下保存，72 h內(nèi)分析完畢。

1.3 淀粉酶和脂肪酶活力的測定

1.3.1 淀粉酶和脂肪酶在消化道中的活力分布消化道剪開后，立即用精密pH試紙測得各部位消化液的pH值作為其生理pH值。實(shí)驗(yàn)測得虎紋蛙食道、胃、前腸、中腸和后腸的生理pH值依次為:6.0－ 7.5、2.0－6.5、7.0 －8.5、7.5－8.5 和 7.0－8.5。參照各部位的生理pH值，分別在pH值為5.0、5.0、8.0、8.0 和 8.0，溫度為 30 ℃ 條件下，測定食道、胃、前腸、中腸和后腸的淀粉酶和脂肪酶活力。

1.3.2 淀粉酶活力的測定 采用3，5-二硝基水楊酸比色法［20］，略有改動(dòng)。實(shí)驗(yàn)組取0.665 mL待測粗酶液于各試管，再分別加入相應(yīng)pH值的緩沖液0.665 mL，混勻，將實(shí)驗(yàn)組置于30℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱5 min～10 min;對(duì)照組用相應(yīng)量的蒸餾水取代粗酶液，其余條件一致。再向?qū)嶒?yàn)組和對(duì)照組試管中加入已預(yù)熱的2%的淀粉溶液0.670 mL，搖勻，于30℃水浴反應(yīng)40 min后再加入2 mL的3，5-二硝基水楊酸，搖勻。立即放入100℃沸水中顯色5 min，使酶失活并終止反應(yīng)，流水冷卻后稀釋10倍，7200型分光光度計(jì)，490 nm波長條件下比色，測吸光值。以30℃下每分鐘水解淀粉產(chǎn)生1 mg麥芽糖作為一個(gè)酶活力單位。

1.3.3 脂肪酶活力的測定 采用對(duì)硝基苯基丁酸(PNPB)法測脂肪酶活力［22］，略有改動(dòng)。實(shí)驗(yàn)組取相應(yīng)pH值的緩沖液970 μL于2 mL比色皿中，再加入20 μL待測粗酶液;對(duì)照組加入990 μL相應(yīng)pH值的緩沖液。再向?qū)嶒?yàn)組和對(duì)照組中加入溶解在乙腈中的50 mmol/L PNPB溶液10 μL，搖勻。立即放入30℃水浴反應(yīng)5 min后，用7200型分光光度計(jì)，410 nm波長條件下比色，測光吸收值。以30℃下每分鐘水解底物生成1 μmol對(duì)硝基苯酚(PNP)所需的酶量作為一個(gè)酶活力單位。

1.4 pH梯度的設(shè)置

利用不同pH值的緩沖液來配置實(shí)驗(yàn)中所需的各種 pH條件。實(shí)驗(yàn)中共使用4種緩沖液，pH1.5～2.2的緩沖液用 KCl-HCl配制;pH3.0 ～8.0 的緩沖液用Na2HPO4-檸檬酸配制;pH8.0～9.6的緩沖液用巴比妥鈉-鹽酸配制;pH10.0的緩沖液用甘氨酸-NaOH配制。胃消化酶活力測定所需的pH值范圍為1.5、2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、8.6、9.0 和9.6，共11個(gè)pH值梯度。腸消化酶活力測定所需的的 pH 值范圍為 4.0、5.0、6.0、7.0、7.4、8.0、9.0、9.6和10.0，共9個(gè) pH 值梯度。利用上述方法，在30℃條件下測定胃和腸淀粉酶和脂肪酶的最適pH值。

1.5 溫度梯度的設(shè)置

采用恒溫水浴鍋控制水溫，設(shè)置15℃、20℃、25 ℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃共11個(gè)溫度梯度，利用實(shí)驗(yàn)所得的最適pH值，選擇相應(yīng)的緩沖液按上述方法分別測定胃和腸淀粉酶和脂肪酶在不同溫度條件下的活力。

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 虎紋蛙消化道淀粉酶和脂肪酶的分布

2.1.1 淀粉酶在消化道中的活力分布 在各部位生理pH條件下，溫度為30℃時(shí)虎紋蛙消化道各部位淀粉酶的活力分布見圖1。由圖1可知，不同部位淀粉酶的活力由大到小依次是前腸＞中腸＞后腸＞食道＞胃，腸道各段淀粉酶活力顯著高于食道和胃(P＜0.05)，其中前腸的淀粉酶活力是食道的3.9倍，是胃的4.6倍。食道淀粉酶活力略微高于胃，但差異不顯著(P＞0.05)。前腸淀粉酶活力顯著大于后腸(P＜0.05)，但與中腸之間無顯著性差異(P＞0.05)。中腸的淀粉酶活力顯著高于后腸(P＜0.05)。

圖1 虎紋蛙消化道淀粉酶的活力分布Fig.1 The distribution of amylase in the digestive tract of Rana rugulosa

2.1.2 脂肪酶在消化道中的活力分布 虎紋蛙消化道各部位脂肪酶的活力分布見圖2。由圖2可知，不同部位脂肪酶的活力由大到小依次是中腸＞后腸＞前腸＞胃＞食道，腸道各段脂肪酶活力顯著高于食道和胃(P＜0.05)，其中中腸脂肪酶活力是食道的109.9倍，是胃的65.8倍。胃脂肪酶活力顯著高于食道(P＜0.05)。前腸、中腸和后腸之間的脂肪酶活力差異顯著(P＜0.05)。

2.2 pH對(duì)淀粉酶和脂肪酶活力的影響

圖2 虎紋蛙消化道脂肪酶的活力分布Fig.2 The distribution of lipase in the digestive tract of Rana rugulosa

2.2.1 pH對(duì)淀粉酶活力的影響 不同pH條件下，虎紋蛙胃和腸道淀粉酶的活力變化見圖3。由圖3可知，胃和腸道淀粉酶的最適pH值分別為8.6和7.0。胃淀粉酶活力與pH的關(guān)系曲線呈單峰型，pH對(duì)胃淀粉酶活力影響較大，pH值在1.5～7.0之間，淀粉酶的活力逐漸緩慢上升，在pH值大于7.0以后，淀粉酶活力顯著上升(P＜0.05)，到8.6時(shí)達(dá)到最大值，之后顯著下降(P＜0.05)。腸道淀粉酶活力與pH的關(guān)系曲線亦呈單峰型，pH值小于7.0時(shí)，酶活力逐漸上升，pH值為7.0時(shí)，達(dá)到最大值，之后先緩慢下降(P ＞0.05)，后急劇下降(P ＜0.05)。

圖3 pH對(duì)淀粉酶活力的影響Fig.3 Effects of pH on the activities of amylase

2.2.2 pH對(duì)脂肪酶活力的影響 不同pH條件下，虎紋蛙胃和腸道脂肪酶的活力變化見圖4。由圖4可知，胃和腸道脂肪酶的最適pH值均為9.0。胃和腸道脂肪酶活力與pH的關(guān)系曲線均為雙峰型，pH值對(duì)脂肪酶活力影響較大。當(dāng)pH值為4.0時(shí)，胃脂肪酶活力有一個(gè)較小的峰值，接著在pH值為9.0時(shí)又出現(xiàn)一個(gè)較大的峰值，此時(shí)的酶活力約為pH值為4.0時(shí)的10.1倍。當(dāng)pH值為5.0時(shí)，腸道脂肪酶活力有一個(gè)較小的峰值，接著在pH值為9.0時(shí)又出現(xiàn)一個(gè)較大的峰值，此時(shí)的酶活力約為pH值為5.0時(shí)的9.0 倍。

圖4 pH對(duì)脂肪酶活力的影響Fig.4 Effects of pH on the activities of lipase

2.3 溫度對(duì)淀粉酶和脂肪酶活力的影響

2.3.1 溫度對(duì)淀粉酶活力的影響 不同溫度條件下，虎紋蛙胃和腸道淀粉酶的活力變化見圖5。由圖5可知，胃和腸道淀粉酶活力與溫度的關(guān)系曲線均為單峰型，最適溫度分別為35℃和40℃。溫度范圍在15～35℃時(shí)，胃淀粉酶活力逐漸上升，溫度為35℃時(shí)達(dá)到最大值，之后顯著下降(P＜0.05)，溫度為50℃時(shí)的酶活力僅為最大酶活力的30%左右。腸道淀粉酶活力隨溫度上升變化較大，溫度從15℃上升為40℃時(shí)，腸道淀粉酶活力約上升了3倍，溫度為40℃時(shí)達(dá)到最大值，之后緩慢下降。

圖5 溫度對(duì)淀粉酶活力的影響Fig.5 Effects of temperature on the activities of amylase

2.3.2 溫度對(duì)脂肪酶活力的影響 不同溫度條件下，虎紋蛙胃和腸道脂肪酶的活力變化見圖6。由圖6可知，胃和腸道脂肪酶活力與溫度的關(guān)系曲線均為單峰型，最適溫度分別為50℃和55℃。胃脂肪酶活力在溫度范圍15～50℃內(nèi)逐漸上升，在50℃時(shí)達(dá)到最大值，之后顯著下降(P＜0.05)，溫度為65℃時(shí)的酶活力只有最大酶活力的11%左右。腸道脂肪酶活力在溫度小于55℃時(shí)，脂肪酶活力逐漸上升，當(dāng)溫度為55℃時(shí)，酶活力達(dá)到最大值，之后顯著下降(P ＜0.05)。

圖6 溫度對(duì)脂肪酶活力的影響Fig.6 Effects of temperature on the activities of lipase

3 討論

3.1 虎紋蛙消化酶的分布

動(dòng)物的食性往往與其消化酶組成密切相關(guān)。蛙類多屬肉食性動(dòng)物，主要以消化蛋白質(zhì)和脂肪為主，但本研究顯示虎紋蛙消化道具淀粉酶活力，這提示在配制虎紋蛙飼料時(shí)可適當(dāng)添加淀粉成分。不同消化酶在虎紋蛙消化道中的活力分布差異較大。淀粉酶活力主要分布在腸道，以前腸較高，中腸和后腸依次次之，這與牛蛙［20］和黑斑蛙［15］淀粉酶活力主要分布在中腸有所不同，但與某些魚類如大菱鲆［5］、洞庭鲇魚［9］等相似。脂肪酶活力亦主要分布于腸道，特別是中腸，這與牛蛙［20］有所不同，但與黑斑蛙［16］和棘腹蛙［17］，有胃魚類中的中華鱘［10］和黑鯛［11］，爬行類動(dòng)物中的中華鱉［13］等相一致?；⒓y蛙胃中具有較高的蛋白酶活力［21］，顯示蛋白質(zhì)的消化主要集中在胃中;本實(shí)驗(yàn)測得其淀粉酶和脂肪酶主要分布于腸道，顯示淀粉和脂肪的消化主要在腸道中進(jìn)行。蛙類通常將食物不加咀嚼就吞入胃中，根據(jù)虎紋蛙的這種消化特點(diǎn)和攝食習(xí)性，在配制飼料時(shí)，可以通過制作以蛋白質(zhì)為主的外層包裹適當(dāng)?shù)牡矸酆椭境煞值膹?fù)合飼料，以提高虎紋蛙的消化效率，以及飼料的利用率，降低養(yǎng)殖成本。

3.2 pH對(duì)消化酶活力的影響

大多數(shù)酶的活力受pH的影響極為顯著，通常只有在一定的 pH范圍內(nèi)才能表現(xiàn)出其活力，在一定pH值下，酶促反應(yīng)速度有最大值。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，虎紋蛙胃和腸道淀粉酶的最適pH值分別為8.6和7.0，其中腸道淀粉酶的最適pH值在腸內(nèi)的生理pH范圍內(nèi)，而胃淀粉酶的最適pH值遠(yuǎn)超出胃內(nèi)實(shí)測的 pH 范圍(2.0 －6.5)，這與牛蛙［20］和黑斑蛙［15］的胃淀粉酶類似，可見，蛙類胃內(nèi)的 pH環(huán)境均不適合淀粉酶活力的發(fā)揮?；⒓y蛙胃和腸道淀粉酶的最適 pH 值均在中性偏堿性的范圍內(nèi)，比魚類［4，8，9，20］稍高，但與兩棲類中的牛蛙［20］和黑斑蛙［15］，爬行類中的中華鱉［14］基本一致。虎紋蛙胃和腸道脂肪酶活力受 pH影響較大，均呈明顯的雙峰型，最適pH值均9.0。胃脂肪酶最適 pH 值與牛蛙的 2.2［20］、黑斑蛙的 5.0［16］以及棘腹蛙的 5.0［17］，有較大的差異，顯示明顯的物種特異性?；⒓y蛙腸道脂肪酶最適pH值為 9.0，接近其生理pH，與黑眶蟾蜍等蛙類［15，17，18，20］、魚類［5，9，11］以及中華鱉［13］等相似。

虎紋蛙胃蛋白酶的最適pH值為1.5，略低于胃內(nèi)的生理pH［21］。動(dòng)物胃內(nèi)pH值變化較大，主要由于食物刺激胃壁分泌胃液、胃酸等物質(zhì)引起。蛙類主要以吞食的方式進(jìn)食，將食物不經(jīng)咀嚼便整個(gè)吞下，塊狀的食物增加了對(duì)胃壁的刺激，促進(jìn)了胃酸的分泌，降低胃內(nèi)pH值，這時(shí)有利于蛋白酶活力的發(fā)揮而對(duì)淀粉酶和脂肪酶活力的發(fā)揮不利;但當(dāng)經(jīng)過胃初步消化后的食物進(jìn)入腸道后，食物中的淀粉和脂肪成分可在腸道中消化，這進(jìn)一步表明制作多層復(fù)合飼料有利于提高其消化效率。

3.3 溫度對(duì)消化酶活力的影響

虎紋蛙屬變溫動(dòng)物，其消化道內(nèi)的溫度一般隨著棲息環(huán)境溫度的改變而改變。本實(shí)驗(yàn)測得虎紋蛙胃和腸道淀粉酶最適溫度分別為35℃和40℃，脂肪酶最適溫度分別為50℃和55℃，我們之前的研究顯示虎紋蛙胃和腸道蛋白酶的最適溫度均為50℃［21］。虎紋蛙蛋白酶和脂肪酶最適溫度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其棲息的環(huán)境溫度，也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其生理極限溫度，這一現(xiàn)象與黑眶蟾蜍等兩棲類類似［15，17，18，20］，在魚類亦普遍存在［8］。淀粉酶的最適溫度接近最適生長溫度，與其他兩棲類動(dòng)物基本一致。消化酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，其活性易受溫度的影響，這就決定了酶促反應(yīng)對(duì)溫度具有高度敏感性。溫度升高，一方面，增加酶活力使酶促反應(yīng)速率加快;另一方面，加速酶的失活使酶促反應(yīng)速率降低。溫度對(duì)酶促反應(yīng)的雙重作用，決定了酶的最適溫度隨反應(yīng)時(shí)間延長而下降。離體條件下測定的消化酶最適溫度可反映消化酶的熱穩(wěn)定性和溫度對(duì)酶活力的影響規(guī)律?；⒓y蛙消化道淀粉酶的熱穩(wěn)定性明顯比脂肪酶和蛋白酶差。根據(jù)這一特性，在虎紋蛙人工養(yǎng)殖的過程中，當(dāng)環(huán)境溫度升高時(shí)，可考慮適當(dāng)減少飼料中淀粉成分的配比，增加脂肪和蛋白質(zhì)成分。

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