肖文君，胡 帥，曾 榮，常洪平，袁聰穎，王 萍，張 騁，陸秀濤，郭新紅*

(1.湖南大學(xué)生物學(xué)院 植物功能基因組學(xué)與發(fā)育調(diào)控湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410082;2.湖南大學(xué)金融與統(tǒng)計學(xué)院，湖南 長沙 410079)

高絲氨酸激酶(Homoserine kinase)、半乳糖激酶(Galactokinase)、甲羥戊酸激酶(Mevalonate kinase)和磷酸甲羥戊酸激酶(Phosphomevalonate kinase)均為GHMP激酶超家族的代表性成員。該家族成員參與一些重要的新陳代謝過程，如醣酵解、氨基酸生物合成和甾醇生物合成等［1-5］。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，高絲氨酸激酶(EC2.7.1.39，HSK)由位于2號染色體上的AT2G17265單基因編碼而成，催化L-高絲氨酸磷酸化，參與甲硫氨酸和蘇氨酸的生物合成。此外，該基因還可介導(dǎo)一種因高絲氨酸在葉綠體中積累而觸發(fā)的新型植物抗病形式［6］。這種抗性形式不同于已知的免疫反應(yīng)，但其分子機制還有待研究。擬南芥中的HSK與在細(xì)菌、真菌體內(nèi)合成的HSK發(fā)生同源，雖然它們序列相似性較低，但三維結(jié)構(gòu)非常類似［7］。目前，關(guān)于GHMP激酶超家族成員HSK的分子結(jié)構(gòu)與同源建模方面的研究尚未見報道。在本文中，筆者利用生物信息學(xué)方法，從分子水平對高絲氨酸激酶的基本特性和三維結(jié)構(gòu)進行研究，為進一步解析HSK的作用機理和高級結(jié)構(gòu)提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

在擬南芥信息資源網(wǎng)站(http://www.arabidopsis.org/)上查找高絲氨酸激酶HSK信息，并以FASTA格式下載其蛋白質(zhì)序列，登錄號為AT2G1726;于PDB網(wǎng)站查找HSK晶體結(jié)構(gòu)信息，以FASTA格式下載IFWL.A晶體的序列信息，以ENT或PBD格式下載晶體結(jié)構(gòu)文件。

1.2 HSK一級結(jié)構(gòu)分析

利用DNAMAN軟件分析HSK的分子質(zhì)量、等電點及氨基酸組成;使用ProtParam工具預(yù)測不穩(wěn)定系數(shù)(II)、脂肪族系數(shù)(AI)和半衰期;使用ProtScale程序進行疏水性分析。

1.3 HSK二級結(jié)構(gòu)分析

利用NPS程序分析HSK的二級結(jié)構(gòu)域;使用SignalP3.0程序預(yù)測信號肽結(jié)構(gòu);使用TMpred程序預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域;使用Epestfind程序預(yù)測PEST結(jié)構(gòu);使用PSORT程序預(yù)測HSK的亞細(xì)胞定位。

1.4 HSK三級結(jié)構(gòu)分析

利用SWISS-MODEL進行同源建模，用Chimera(V1.8.1)軟件進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化并顯示分子三維結(jié)構(gòu)，使用Molprobity4及ERRAT(V 2.0)對建模結(jié)果進行結(jié)構(gòu)質(zhì)量評估。

2 結(jié)果與分析

2.1 HSK一級結(jié)構(gòu)分析

HSK由370個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量為38521.4，預(yù)測等電點 pI=8.48，呈弱堿性。HSK由20種L-氨基酸構(gòu)成，其中甘氨酸(Ala)的含量最高，達(dá)到12.97%，色氨酸(Trp)與酪氨酸(Tyr)含量最低，分別只占0.54%和0.81%;非極性氨基酸占51.61%，酸性氨基酸占 8.91%，堿性氨基酸占11.35%(圖 1)。

圖1 HSK的氨基酸組成Fig.1 Amino acid compositions of HSK

利用ExPASY網(wǎng)站的ProtParam工具預(yù)測HSK的基本特性;預(yù)測結(jié)果顯示，HSK的不穩(wěn)定系數(shù)II=34.03，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì);脂肪族系數(shù) AI=98.35，平均親水性(GRAVY)0.267;在不同物種的體細(xì)胞內(nèi)，HSK的半衰期也不盡相同:在哺乳動物的網(wǎng)織紅細(xì)胞中半衰期達(dá)30 h，在酵母和大腸桿菌中，其半衰期分別為＞20 h和＞10 h。

使用ProtScale程序?qū)SK的疏水性進行分析(圖2)。親水指數(shù)(hydropathy index)越大，表明該氨基酸的疏水性越強。在18～22處有一顯著親水區(qū)域，200～205及265～271有兩段顯著疏水區(qū)域。此外，疏水性氨基酸在25～75及113～160兩端區(qū)域分布較為集中，而在205～260這一區(qū)域親水性氨基酸分布較為集中，其余區(qū)域親疏性氨基酸大致呈均勻分布(圖2)。

圖2 HSK疏水性圖譜Fig.2 Hydrophilicity profiles of HSK

圖3 HSK二級結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Secondary structure analysis of HSK

2.2 HSK二級結(jié)構(gòu)分析

利用NPS程序中的HNN算法對HSK的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析，結(jié)果如圖3。在HSK的370個氨基酸殘基中，有127個氨基酸殘基(34.32%)參與構(gòu)成不同區(qū)域的α-螺旋，178個殘基(48.11%)構(gòu)成不規(guī)則卷曲，65個殘基(17.57%)組成延伸鏈，不含Beta turn、310 helix、Pi helix、Beta bridge 及 Bend region等二級結(jié)構(gòu)?？尚哦容^高的α-螺旋(藍(lán)色部分)分布在113～133、151～168、260～269、269～307及 332～345等區(qū)域，延伸鏈(紅色部分)分布在40～45、50～55、96～110、203～208、321～326等區(qū)域，此外在9～26、138～150、209～224、278～295等區(qū)域還存在大量不規(guī)則卷曲(紫色部分)(圖3)。

使用SignalP3.0程序的NN算法對HSK前體蛋白的前70個氨基酸殘基進行信號肽預(yù)測(圖4)。圖4中C值(紅線)代表剪切位點值，S值(綠線)表示信號肽區(qū)域，Y值(藍(lán)線)為綜合考慮C值和S值的參數(shù)，用于推測信號肽的剪切位點。HSK的信號肽可能由1～16位的氨基酸殘基組成，即“LITCSSMASLCFQS”片段，剪切位點可能位于“PSK*PIS”處(15～20)(圖4)。

使用TMpred程序預(yù)測HSK跨膜結(jié)構(gòu)域(圖5)。黑色實線表示由細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)向外側(cè)延伸(i→o)的跨膜結(jié)構(gòu)，灰色虛線代表相反方向(o→i)的跨膜螺旋，分值大于500的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)表示具有跨膜顯著性。如圖所示，在145 ～163(o→i)、145 ～168(i→o)、255～277(o?i)、304 ～325(i→o)、307 ～325(o→i)等 5個區(qū)域可能存在不同朝向的顯著跨膜結(jié)構(gòu)(圖5)。

圖4 HSK信號肽預(yù)測Fig.4 Prediction of signal peptide for HSK

圖5 HSK的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Prediction of transmembrane topology for HSK

使用Epestfind程序預(yù)測HSK的PEST結(jié)構(gòu)(圖6)。檢測閾值設(shè)定為+5.00，序列分值越高，表示蛋白質(zhì)在此處發(fā)生降解的可能性越大。有效的PEST結(jié)構(gòu)依據(jù)分值高低分為三類:PEST motif(Symboles)、Potential(+++++)、Poor(ooooo)。HSK中可能存在6個PEST結(jié)構(gòu)(poor)，分別位于141～169、302～330、55～82、36～55、223～239和 242～253處(圖6)。

圖6 HSK PEST結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Prediction of PEST motif for HSK

使用PSORT(V6.4)程序預(yù)測HSK的亞細(xì)胞定位，該程序通過檢測蛋白質(zhì)的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、特征信號序列、邊界定位序列以及疏水矩等信息來確定蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位。預(yù)測結(jié)果顯示:HSK定位于葉綠體基質(zhì)的確定分值為0.887，定位于葉綠體類囊體膜的確定性分值0.593，定位于葉綠體類囊體體腔中的確定分值 0.548。

使用ScanProsite工具預(yù)測HSK的翻譯后修飾位點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HSK的中可能存在9個PKC磷酸化位點，2個CK2磷酸化位點，8個豆蔻?；揎椢稽c，1個酰胺化位點，1個天冬酰胺糖基化位點(257～260，“NSSQ”)，1 個 ATP 結(jié) 合 位 點(143 ～154，“LPLGSGLGSSAA”)。

2.3 HSK建模結(jié)構(gòu)分析

目前，預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的方法主要有三種，同源建模法、串線法(折疊識別法)和從頭預(yù)測法［8］。蛋白質(zhì)同源建模是基于序列同源比對的一種建模方法，此法對于序列相似度大于30%的預(yù)測模擬較為有效。我們以1FWL.A為模板，利用SWISSMODEL 進行同源建模，再利用 Chimera(V 1.8.1)軟件對初建模型進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化并顯示最終結(jié)果，結(jié)果見圖 7、8，最后使用 Molprobity4 及 ERRAT(V 2.0)對優(yōu)化模型進行立體化學(xué)質(zhì)量評估，并給出Ramachandran圖，結(jié)果見圖9。

圖7-A展示了主側(cè)鏈的空間走向，可清晰地觀察到10個α-螺旋(紅色部分)、12個β-折疊(藍(lán)色部分)及多個β-轉(zhuǎn)角、β-凸起和無規(guī)卷曲的空間分布及相對位置;圖7-B為HSK的疏水表面結(jié)構(gòu)，由圖可看觀察到分子表面的基本輪廓、多個疏水凹陷中心以及空穴結(jié)構(gòu)的空間分布。

圖7 HSK的三維結(jié)構(gòu)模擬圖Fig.7 Prediction of 3D structure for HSK

圖8 HSK結(jié)構(gòu)修飾對比圖(灰白色部分為修飾前結(jié)構(gòu))Fig.8 Comparison of structural modification for HSK(The part colored gray-white is pre-modified structure)

Ramachandran圖，亦稱［φ，ψ］圖，該圖依據(jù)分子內(nèi)非鍵合原子間的最小距離，評估兩個相鄰肽單位的α-碳與酰胺平面交角(φ和ψ)構(gòu)象是否合理，并分別以φ和ψ為橫，縱坐標(biāo)在圖中進行標(biāo)注。該圖通過計算允許區(qū)中的氨基酸所占比例來描述蛋白質(zhì)主鏈碳的φ和ψ所產(chǎn)生的低能構(gòu)象和分布方式，并大致評估模擬的結(jié)構(gòu)是否與自然結(jié)構(gòu)趨勢相同［9］。φ和ψ最理想的分布區(qū)域位于一般允許區(qū)，藍(lán)線外為不允許區(qū)。如果蛋白質(zhì)中90%以上的二面角位于一般允許區(qū)內(nèi)，說明該結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)［10］。在本次HSK的最終預(yù)測模型中，有91.00%的氨基酸殘基位于拉氏構(gòu)象圖的一般允許區(qū)內(nèi)，98.71%的殘基位于最大允許區(qū)以內(nèi)，結(jié)果表明該模型具有穩(wěn)定的空間構(gòu)型。此外，筆者還用ERRAT(V 2.0)對模型進行了進一步的結(jié)構(gòu)驗證，測評所得分值為92.905，高于 ERRAT的平均分值91.000分，表明該模型整體構(gòu)象符合立體化學(xué)規(guī)則(圖9)。

3 討論

圖9 HSK的拉氏構(gòu)象圖Fig.9 Ramachandran plot of HSK

蛋白質(zhì)是由多種α-氨基酸按一定的序列通過肽鍵(酰胺鍵)縮合而成的具有一定功能的生物大分子。為了研究的方便，通常將蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象分為不同層次來描述。多肽鏈中的氨基酸序列即為蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)(primary structure)，氨基酸序列的多樣性決定了蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和功能的多樣性。高絲氨酸激酶(HSK)由370個氨基酸殘基組成，非極性氨基酸占51.61%，酸性氨基酸占8.91%，堿性氨基酸占11.35%，預(yù)測 pI=8.48，呈弱堿性。蛋白質(zhì)的酸堿性主要取決于酸/堿性氨基酸的比例以及所處的空間位置和化學(xué)環(huán)境［11］。HSK為弱堿性蛋白質(zhì)，這可能不僅是堿性氨基酸在數(shù)量上占優(yōu)勢的表現(xiàn)，更可能與該蛋白質(zhì)在行使功能時所處的化學(xué)環(huán)境有關(guān)。而聯(lián)系前文我們利用PSORT(V6.4)程序來預(yù)測HSK的亞細(xì)胞定位所得結(jié)果來看，似乎也應(yīng)證了我們的這一猜測。HSK的亞細(xì)胞定位最有可能位于葉綠體基質(zhì)(確定分值為0.887，定位于類囊體膜和類囊體腔的確定分值為別為0.593和0.548);而眾所周知，由于存在跨類囊體膜的H+梯度，所以類囊體腔中的環(huán)境呈酸性，pH約為4［12］，葉綠體基質(zhì)呈微堿性，pH 約為 8［13，14］，而完成卡爾文循環(huán)的最適 pH為8.1［12］。所以，縱觀 HSK的酸堿性和亞細(xì)胞定位的結(jié)果來看，HSK呈弱堿性的氨基酸構(gòu)成可能是其在特殊離子環(huán)境中行使特定功能所必須的。

蛋白質(zhì)的合成是細(xì)胞內(nèi)一項精密而復(fù)雜的活動，這一工程需要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工、修飾及定位等多個步驟在時間和空間上的精確協(xié)同，才能最終完成的。擬南芥HSK的編碼基因位于第二條染色體上，而其經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯后，最終定位于葉綠體。這一過程中，在胞質(zhì)游離核糖體上可能先進行HSK前體蛋白的合成，待合成完畢后再被釋放到細(xì)胞溶膠中(翻譯后轉(zhuǎn)運途徑)。而HSK靶向葉綠體的前體蛋白的N端極有可能含有一段信號肽，這一信號肽可能通過識別附著于葉綠體被膜上的Toc和Tic復(fù)合物，將前體蛋白導(dǎo)入葉綠體中。我們利用SignalP3.0程序的NN算法對HSK前體蛋白的信號肽進行預(yù)測的結(jié)果(圖4)顯示，信號肽可能由1～16位的“LITCSSMASLCFQS”片段組成，剪切位點可能位于“PSK*PIS”處(15～20)。然而，我們從圖4中還可以觀察到這樣一個信息，在第35～40位上還檢測到一個信號肽預(yù)測峰，這一段序列是否也是一段信號肽，在前體蛋白進入葉綠體基質(zhì)，基質(zhì)導(dǎo)入序列(the stromal import sequence，可能為1～16位序列)被切割、折疊后，使得35～40片段暴露出來，繼而引導(dǎo)余下多肽鏈進入類囊體，還有待進一步研究。當(dāng)然，做出這一猜測的前提是HSK有可能定位于類囊體腔中或其膜上。

PEST序列是指富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)的肽段。根據(jù)PEST序列假說而言，含有該序列的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)可能通過由蛋白體或鈣蛋白酶介導(dǎo)的途徑進行降解，因而胞內(nèi)半衰期較短［15］。我們利用 epestfind程序?qū)?HSK的PEST序列的預(yù)測結(jié)果顯示，在全長為370的HSK中，不存在明顯的PEST序列，因此該蛋白質(zhì)在胞內(nèi)應(yīng)較為穩(wěn)定。而這一結(jié)果與ProtParam的預(yù)測不謀而合，在哺乳動物的網(wǎng)織紅細(xì)胞中半衰期達(dá)30 h，在酵母和大腸桿菌中，其半衰期分別為＞20 h和＞10 h，不穩(wěn)定系數(shù) II=34.03，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)，并且脂肪系數(shù)AI高達(dá)98.35。脂肪族系數(shù)是指脂肪族氨基酸(丙氨酸，纈氨酸，異亮氨酸和亮氨酸)的側(cè)鏈占整個蛋白質(zhì)的相對體積，它被認(rèn)為是提高球狀蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的積極因素［16］。

蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的維持主要依靠氫鍵、疏水作用和范德華力等。在水溶液中，疏水作用作為一種因氨基酸側(cè)鏈相互聚集而形成的作用力，減少了非極性殘基與水的相互作用，使水分子的混亂度(熵值)增加，在能量上有利于蛋白質(zhì)形成特有的空間結(jié)構(gòu)［17］。對蛋白質(zhì)疏水性進行預(yù)測分析有助于幫助我們進一步了解其跨膜結(jié)構(gòu)域和分子表面結(jié)構(gòu)。尤其是分子表面結(jié)構(gòu)，眾所周知，分子表面常有空穴，它是結(jié)合配體，行使生物學(xué)功能的活性部分，而空穴通常是一個疏水的區(qū)域［18］。另一個重要用途是預(yù)測膜蛋白在細(xì)胞膜中的分布。如果發(fā)現(xiàn)膜蛋白有連續(xù)二十個左右的氨基酸都具有較強的疏水性，那么很有可能這一段氨基酸是膜蛋白橫跨細(xì)胞膜的部分［19］。

我們利用ProtScale程序?qū)SK的疏水性進行分析，圖2中利用親水指數(shù)來對氨基酸的親疏水性進行了量化。氨基酸的親水指數(shù)是根據(jù)蒸汽至水相轉(zhuǎn)移的ΔtrGme○值以及在形成蛋白質(zhì)時氨基酸在表面和內(nèi)部的分布來測算的，是一個描述氨基酸支鏈的親水性或疏水性程度大小的值。它于1982年被Jack Kyte與 Russell Doolittle首先提出［20］。親水指數(shù)越大，這種氨基酸的疏水性就越強。在18～22處有一顯著親水區(qū)域，200～205及265～271有兩段顯著疏水區(qū)域。此外，疏水性氨基酸在25～75及113～160兩端區(qū)域分布較為集中，而在205～260這一區(qū)域親水性氨基酸分布較為集中，其余區(qū)域親疏性氨基酸大致呈均勻分布。接著，我們使用TMpred程序預(yù)測HSK跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果(圖5)顯示，在145～163(o→i)、145 ～168(i→o)、255 ～277(o?i)、304 ～325(i→o)、307～325(o→i)等5個區(qū)域可能存在不同朝向的跨膜結(jié)構(gòu)域。而跨膜結(jié)構(gòu)域(Transmembrane domain)通常是指跨膜蛋白上的一個跨膜α-螺旋(極少數(shù)為β-桶裝結(jié)構(gòu))，但從更廣義的角度來說，跨膜結(jié)構(gòu)域是指在膜上具有熱力學(xué)穩(wěn)定性的任意蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)［21］。聯(lián)系疏水性與跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測結(jié)果來看，在145～168、255～277和304～325三個存在跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測峰的片段中，絕大多數(shù)都為疏水性氨基酸，符合跨膜結(jié)構(gòu)對片段長度和疏水性的基本要求。而其中尤為值得注意的是255～277這一段序列，這一包含了23個具有極強疏水性的片段很可能為跨膜α-螺旋，而這一猜測在利用NPS程序?qū)Χ壗Y(jié)構(gòu)進行預(yù)測的結(jié)果(圖3)中也似乎得到了驗證。此外，我們利用ScanProsite工具對HSK的翻譯后修飾位點進行預(yù)測分析后發(fā)現(xiàn)，在257～260處可能存在1個天冬酰胺糖基化位點(-NSSQ-)。多重預(yù)測結(jié)果集中出現(xiàn)在255～277這一區(qū)域，是否預(yù)示著HSK除了催化高絲氨酸磷酸化之外，這一區(qū)域的存在是否會賦予HSK其它未知功能，還有待進一步研究。

與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測相比，蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測的成功率要低得多。這可能是因為高級結(jié)構(gòu)折疊關(guān)鍵決定于序列中的間隔距離的殘基之間的特異側(cè)鏈相互作用。目前，預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的方法主要有三種，同源建模法、串線法(折疊識別法)和從頭預(yù)測法，而其中同源建模法的應(yīng)用范圍最廣，構(gòu)建成功率相對較高。此法主要步驟有:結(jié)構(gòu)保守性分析，主側(cè)鏈結(jié)構(gòu)預(yù)測以及模型優(yōu)化［22］。我們以1FWL.A為模板，利用SWISS-MODEL進行同源建模，再經(jīng)Chimera(V 1.8.1)做優(yōu)化處理，最后利用 Molprobity4 及ERRAT(V 2.0)對模型進行立體化學(xué)質(zhì)量評估。Molprobity4評估結(jié)果顯示，HSK三級結(jié)構(gòu)模型中，有91.00%的殘基位于一般允許區(qū)以內(nèi)，98.71%的位于最大允許區(qū)以內(nèi)，clashscore=1.3，molProbity score=1.93;而 133-VAL(-154.50，76.17)、351-VAL(66.65，93.36)和 360-VAL(76.71，14.05)這三個殘基介于一般允許區(qū)和最大允許區(qū)之間，它們的空間位置或折疊構(gòu)象可能不盡合理，但90-SER(-61.99，21.16)位于最大允許區(qū)外，表明其空間位置錯誤，仍需進一步的修飾。但就整體而言，該模型具有穩(wěn)定的空間構(gòu)型。ERRAT(V 2.0)對模型的進一步驗證表明，該模型(92.905)的空間構(gòu)型基本正確，整體構(gòu)象符合立體化學(xué)規(guī)則。

［1］ZHAO Q，YU D，CHANG H，et al.Regulation and function of Arabidopsis AtGALK2 gene in abscisic acid response signaling［J］.Mol Biol Rep，2013，40(12):6605-6612.

［2］EGERT A，PETERS S，GUYOT C，et al.An Arabidopsis TDNA insertion mutant for galactokinase(AtGALK，At3g06580)hyperaccumulates free galactose and is insensitive to exogenous galactose［J］.Plant Cell Physiol，2012，53(5):921-929.

［3］HUIBERS R P，LOONEN A E，GAO D，et al.Powdery mildew resistance in tomato by impairment of SlPMR4 and SlDMR1［J］.PLoS One，2013，8(6):e67467.

［4］VAN DEENEN N，BACHMANN A L，SCHMIDT T，et al.Molecular cloning of mevalonate pathway genes from Taraxacum brevicorniculatum and functional characterisation of the key enzyme 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase ［J］.Mol Biol Rep，2012，39(4):4337-4349.

［5］YANG T，BAR-PELED L，GEBHART L，et al.Identification of galacturonic acid-1-phosphate kinase，a new member of the GHMP kinase superfamily in plants，and comparison with galactose-1-phosphate kinase［J］.J Biol Chem，2009，284(32):21526-21535.

［6］VAN DAMME M，ZEILMAKER T，ELBERSE J，et al.Downy mildew resistance in Arabidopsis by mutation of HOMOSERINE KINASE ［J］.Plant Cell，2009，21(7):2179-2189.

［7］CORBETT E L，WATT C J，WALKER N，et al.The growing burden of tuberculosis:global trends and interactions with the HIV epidemic ［J］.Arch Intern Med，2003，163(9):1009-1021.

［8］BBALLA U S，IYENGAR R.Emergent properties of networks of biological signaling pathways ［J］. Science， 1999， 283(5400):381-387.

［9］RICHARDSON J S.Anatomy and taxonomy of protein structures［J］.Adv Protein Chem，1981，34:167-339.

［10］周猛，洑香香，童春發(fā)，等.杉木CCoAOMT蛋白的生物信息學(xué)分析與同源模建［J］.生物信息學(xué)，2008，6(2):62-64.ZHOU Meng，F(xiàn)U Xiangxiang，TONG Chunfa，et al.Bioinformatics analysis and homology modeling of CCoAOMT protein from Chinese fir［J］.China Journal of Bioinformation，2008，6(2):62-74.

［11］吳斌，艾建宇，馮勝彥，等.酶蛋白分子可及性與等電點關(guān)系的研究［J］.氨基酸和生物資源，2003，25(2):14-17.WU Bin，AI Jianyu，F(xiàn)ENG Shengyan，et al.Study on the relation between accessibility of enzyme and isoelectronic point［J］.Amino Acids Biotic Res，2003，25(2):14-17.

［12］BERG J M，TYMOCZKO J L，STRYER L.［M］.Biochemistry(5th ed.).W H Freeman，2002，Section 19.4.

［13］TIKHONOV A N.pH-dependent regulation of electron transport and ATP synthesis in chloroplasts［J］.Photosynth Res，2013，116(2-3):511-534.

［14］JARVIS P，LóPEZ-JUEZ E.Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids ［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2013，14(12):787-802.

［15］ZHUANG X，NORTHUP J K，RAY K.Large putative PEST-like sequence motif at the carboxyl tail of human calcium receptor directs lysosomal degradation and regulates cell surface receptor level［J］.J Biol Chem，2012，287(6):4165-4176.

［16］IKAI A J.Thermostability and aliphatic index of globular proteins［J］.Biochem，1980，88:1895-1898.

［17］張麗萍，楊健雄.生物化學(xué)簡明教程(第二版)［M］.北京:高等教育出版社，2009:44-45.ZHANG Liping，YANG Jianxiong.Concise course of biological chemistry(2th ed)［M］.Beijing:Press of Higher Eduction，2009:44-45.

［18］HAYLEY J SHARPE，TIM J STEVENS.A comprehensive comparison of transmembrane domains reveals organelle-specific properties［J］.Cell，2010，142(1):158-169.

［19］JIN X.Essential bioinformatics［M］.Cambridge University Press.2006:208.

［20］KYTE J，DOOLITTLE R F.A simple method for displaying the hydropathic character of a protein［J］.J Mol Biol，1982，157(1):105-132.

［21］EISENBERG D.Three-dimensional structure of membrane and surface proteins［J］. Annu Rev Biochem，1984，53:595-623.

［22］KACZANOWSKI S，ZIELENKIEWICZ P.Why similar protein sequences encode similar three-dimensional structures［J］.Theor Chem Acc，2010，125(3-6):543-550.