謝穎穎，湯冬娥，劉小會，高學娟，劉朗夏

(暨南大學 功能蛋白質研究廣東普通高校重點實驗室，生命與健康工程研究院，廣東 廣州 510632)

0 引言

自然界中的生命體處在一個動態(tài)的生活環(huán)境中，隨時都有可能受到周圍環(huán)境及自身不利因素的影響。許多的物理因素如紫外線(UV)、各種射線、化學試劑以及細胞自身生理活動產生的活性氧等都可以使細胞的基因組DNA產生變異，導致基因損傷，最終可能致使細胞無法進行正常的生命活動［1］。然而，生命體對于各種的DNA損傷有不同的應對及調控機制，其中涉及許多基因和蛋白質。細胞增殖核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)是真核細胞中一種分子量為36 kD的蛋白質，為DNA聚合酶δ和polε的輔助蛋白，作為DNA復制的必需因子之一，同時參與了DNA損傷修復過程及細胞周期的調控［2］。

UV照射主要形成嘧啶二聚體(CPD)和6－4光產物，細胞主要通過核苷酸切除(Nucleotide Excision Repair，NER)進行DNA修復;MMS(甲磺酸甲酯)是典型的甲基化試劑，可以使細胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂(Double Strand Break，DSB)［3］。UV 與 MMS 的作用機理有一定的相似性。關于 PCNA泛素化的研究多采用紫外線照射損傷為模型，并且多集中于探討 PCNA泛素化在募集錯配傾向DNA聚合酶以及在跨損傷復制中的作用。

最近研究結果表明，當UV照射細胞后PCNA賴氨酸164(K164)位點可被泛素蛋白識別進行泛素化修飾，這種修飾使PCNA募集跨損傷修復DNA聚合酶參與損傷應答，提高細胞對損傷的耐受力［4］。據(jù)報道有相當數(shù)量的酶及蛋白因子可能參加了此應答過程，但是大多數(shù)還不清楚［5］。我們使用 UV和MMS處理細胞，構建DNA損傷模型，在蛋白水平和mRNA水平研究PCNA的表達變化情況，利用ShRNA干擾技術，干擾兩個泛素E3連接酶 RAD18和CUL4A在細胞中的表達，研究其對PCNA蛋白表達的影響，從而進一步研究PCNA蛋白的穩(wěn)定性與其參與DNA損傷修復之間的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗主要儀器

RT-PCR儀(美國Bio-Rad公司)，凝膠成像掃描系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，垂直電泳槽(美國Bio-Rad公司)，瓊脂糖水平電泳儀(北京市六一儀器廠)，高速冷凍離心機 (德國Eppendorf公司)，熒光顯微鏡(奧林巴斯公司)。

1.2 實驗主要材料

人胚腎T細胞293T和人宮頸癌細胞HeLa購自中科院細胞庫，質粒pcDNA-FLAG-PCNA由美國斯克利普斯研究院的Clare H.McGowan教授惠贈。

1.3 實驗試劑

BCA測定蛋白濃度試劑盒、ECL底物發(fā)光液試劑盒均購自碧云天公司;MMS購自Sigma公司;轉染試劑 Lip2000、DMEM和 Trizol購自 Invitrogen公司;胎牛血清、雙抗購自 鼠源單抗、β-Actin鼠源單抗購自Santa Cruz公司;山羊抗小鼠IgG購自Proteintech Group公司;重組DNA酶和Q-PCR引物購自TaKaRa公司;反轉錄試劑盒和Q-PCR試劑盒購自Bio-Rad公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)和轉染(轉染效率檢測) 人胚腎T細胞293T細胞和人宮頸癌細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，放置37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中生長，用0.25%胰酶消化傳代，每2～3天傳代一次。六孔板中，每孔接種5*105/mL細胞密度，待細胞貼壁后進行轉染(貼壁密度 30～50%)。將野生型質粒FLAG-PCNA用250 μL DMEM培養(yǎng)液(不含血清和雙抗)室溫混勻5 min，再用250 μL DMEM培養(yǎng)液(不含血清和雙抗)室溫分別混勻兩管 Lipo2000 轉染試劑，3.5 μL/管，5 min 靜置，將Lipo2000懸液和質粒懸液均勻混合，室溫靜置孵育30 min后，將 DNA復合物加入細胞中進行轉染，4～6小時后更換成含有10%胎牛血清及雙抗的DMEM全培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24、48小時。對應的細胞轉染效率用pEGFP-N1空載表達的綠色熒光蛋白GFP檢測，用量和比例與構建的重組質粒相同，轉染24、48小時后在熒光顯微鏡488 nm激光波長下，觀察細胞的轉染效率。

1.4.2 細胞收集與蛋白樣品準備 胰酶消化細胞后，1000 r/min離心3分鐘，PBS清洗2～3次。棄除殘余上清后，用 100 μL EBC裂解液 +PMSF(1∶100)+Protein inhibitor(1∶50)吹打均勻細胞后，冰浴30分鐘裂解。隨后，12000 r/min、4℃、10分鐘離心留取上清作為全細胞裂解液，利用BCA法測定蛋白濃度。

1.4.3 Western blot驗證 利用 SDS-PAGE，將30 μg蛋白樣品進行電泳并轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1小時，加入鼠源PCNA單克隆抗體(1∶1000)4℃孵育過夜;TBST清洗三次后，加入辣根過氧化物酶標記的鼠二抗(1∶2000)室溫孵育1 h;TBST清洗三次后，加入ECL底物發(fā)光液，利用膠片進行顯影。β-Actin和FLAG以同樣的稀釋濃度和實驗流程，在同一張膜上進行顯色。

1.4.4 RAD18和 CUL4A ShRNA 干擾 ShRNA CUL4A:CCGGGCAGAACTGATCGCAAAGCATCTCGA GATGCTTTGCGATCAGTTCTGCTTTTT;ShRNA RAD18:GAGCATGGATTATCTATTCAA。帶GFP標簽的干擾質粒由吉瑪公司構建合成，用Lipo2000轉染到細胞中，轉染72 h后，收集細胞1000 r/min離心3分鐘，PBS清洗2～3次。

1.4.5 RNA 提取和逆轉錄生成 cDNA Trizol法提取細胞總RNA，加入重組DNA酶去除DNA后，進行逆轉錄生成，反應體系與條件如下:

反應條件:

1.4.6 實時熒光定量PCR(Q-PCR) 將生成cDNA進行實時熒光定量PCR檢測，引物設計采用Primer Primer 5.0軟件(見表1)，送至TaKaRa公司合成。

表1 目的基因引物Tab.1 Primers of target genes

Q-PCR反應體系:

反應條件:

運用Bio-rad CFX Manager系統(tǒng)軟件，顯示相關PCR相關結果和參數(shù)。選用ACTB和GAPDH為內參，校正差異。mRNA的差異用ΔCt值計算表示，實驗重復3次后，計算平均值和標準方差。

2 實驗結果

2.1 UV照射和MMS處理對內源PCNA蛋白水平表達及細胞形態(tài)的影響

Hela細胞經 UV照射(1 min)和 MMS處理(1 μmol/L)后，繼續(xù)進行培養(yǎng)，在不同時間點收集細胞，利用Western blot檢測蛋白質水平的變化。結果顯示細胞內源PCNA的表達沒有發(fā)生明顯的變化(圖1A)。而細胞形態(tài)有明顯的變化，隨著UV照射，細胞在3 h開始出現(xiàn)漂浮壞死細胞，6 h后貼壁細胞大量減少、死亡增加，12 h后基本全部死亡。MMS處理細胞3hr后，貼壁能力開始降低，接近12 h時，細胞皺縮呈懸浮狀態(tài)。

圖1 UV照射和MMS處理對內源PCNA蛋白水平表達(A)及細胞形態(tài)的影響(B)。A.Western blot檢測HeLa細胞中PCNA蛋白的表達;B.倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化Fig.1 The protein expression levels of endogenous PCNA(A)and cell morphology(B)after UV irradiation and MMS treatment.A.Western blot analysis of PCNA protein levels in HeLa cells;B.Changes in cell morphology was observed using an inverted fluorescence microscope.

2.2 UV照射對外源表達FLAG-PCNA蛋白表達的影響

在Hela細胞中轉染野生型的FLAG-PCNA質粒，在轉染42 h后，對細胞進行UV照射1 min，繼續(xù)培養(yǎng)細胞6 h后收集細胞，利用 Western blot檢測FLAG-PCNA蛋白質水平的變化。結果顯示，當UV照射細胞時，F(xiàn)LAG-PCNA蛋白表達差異不明顯(圖2)。

圖2 UV照射對外源表達FLAG-PCNA蛋白表達的影響Fig.2 The effect of UV irradiation on expression of exogenous FLAG-PCNA protein

2.3 UV照射和MMS處理對內源PCNA mRNA水平的影響

Hela細胞經UV照射后，提取等量的cDNA進行擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測間接反映PCNA和GAPDH(內參)mRNA含量的變化情況。如圖3A所示，觀察到特異性的PCNA和GAPDH擴增條帶，在UV照射下，GAPDH的mRNA含量無明顯變化，而PCNA的mRNA表達量明顯降低。然后，我們又利用Q-PCR技術檢測DNA損傷時，PCNA的mRNA水平變化情況。如圖3B所示，Hela細胞經UV或MMS處理3小時后，PCNA的mRNA表達量急劇下降，到達一個穩(wěn)定期，在處理6小時的時間點，無明顯的再下降。

2.4 敲除 E3連接酶 RAD18或 CUL4A對內源PCNA蛋白表達的影響

將RAD18或CUL4A的shRNA干擾質粒轉染293T細胞72 h，收集細胞，利用Western blot檢測內源PCNA的表達變化。如圖4A和B所示，利用QPCR的方法檢測到RAD18或CUL4A的shRNA明顯降低了二者的表達量。與對照組相比，干擾RAD18或CUL4A的表達以后，PCNA的蛋白表達量均增加(圖4C)，說明E3連接酶RAD18和CUL4A均參與了PCNA的泛素化降解過程。

圖3 UV照射和MMS處理對PCNA mRNA水平的影響。A.常規(guī)PCR后產物瓊脂糖凝膠電泳結果;B.UV照射和MMS處理細胞后進行Q-PCR檢測，結果為三次獨立的重復實驗結果Fig.3 The effects of UV irradiation and MMS treatment on PCNA mRNA levels.A.Agarose gel electrophoresis analysis of the products of conventional PCR;B.Real-time fluorescence quantitative PCR analysis after UV irradiation and MMS treatment.The experiments were independently repeated three times

圖4 敲除E3連接酶RAD18或CUL4A對內源PCNA蛋白表達的影響。A.Q-PCR檢測RAD18的mRNA表達水平;B.Q-PCR檢測CUL4A的mRNA表達水平;C.Western blot檢測PCNA蛋白的表達水平Fig.4 Effects of knockdown of E3 ubiquitin ligase RAD18 or CUL4A on the endogenous expression of PCNA protein levels.A.Q-PCR analysis of RAD18 mRNA levels;B.Q-PCR analysis of CUL4A mRNA levels;C.Western blot analysis of PCNA protein levels

3 討論

從以上實驗結果觀察到當UV照射和MMS處理后，細胞形態(tài)發(fā)生變化，并且隨著時間的延長，大部分細胞都趨于死亡，說明細胞中損傷的DNA未能得到及時有效的修復，這可能與UV的劑量和MMS的處理時間有關系［6，7］。但UV照射細胞后，內源和外源的PCNA蛋白水平的表達都沒有明顯的變化，說明細胞中存在著一定的修復機制，使得PCNA的穩(wěn)定性得到保護。隨后通過實時熒光定量PCR的檢測，發(fā)現(xiàn)PCNA的mRNA水平反而下降，說明在DNA損傷時PCNA蛋白的穩(wěn)定性增加，參與DNA損傷修復。

據(jù)報道，泛素連接酶RAD18可以增加PCNA的泛素化，是人體細胞內DNA損傷旁路機制所必需的成分［8］。CUL4A是E3連接酶核心結構中的主要骨架，能夠通過UPS介導蛋白降解，從而使細胞內調節(jié)蛋白水平及功能得到調控。因此，在DNA損傷的情況下，研究這兩個E3泛素連接酶對PCNA的影響是十分必要的。我們的結果證明使用shRNA干擾E3連接酶CUL4A和RAD18表達，PCNA蛋白水平升高，說明它們與PCNA的降解過程有關。這些結果將有助于深入研究 PCNA蛋白的穩(wěn)定性與其參與DNA損傷修復之間的關系以及DNA復制與損傷修復調制機制。

研究DNA損傷與修復有利于了解基因突變機制、衰老和癌變的原因，可應用于環(huán)境致癌因子的檢測。Liu等的研究表明，在鎘污染環(huán)境中生長的擬南芥苗中，PCNA的含量明顯升高，表明PCNA也可作為一種監(jiān)控鎘污染和環(huán)境污染的分子標記物［9］。此外，在人體內，由于終末分化細胞的 PCNA表達水平通常較低，而在許多常見的癌癥細胞內PCNA的表達水平都顯著增高［10，11］;因此，研究 PCNA 的表達水平變化對于揭示其參與細胞功能的分子機制至關重要。

［1］向生光，胡維新.增殖細胞核抗原PCNA在DNA修復中的作用［J］.生命的化學，2009，29(4):472-476.XIANG Shengguang，HU Weixin.Role of PCNA in DNA repair［J］.Chemistry of Life，2009，29(4):472-476.

［2］HENDEL A，KRIJGER P H，DIAMANT N，et al.PCNA ubiquitination is important，but not essential for translesion DNA synthesis in mammalian cells ［J］. PLoS Genet， 2011， 7(9):e1002262.

［3］GALI H，JUHASZ S，MOROCZ M，et al.Role of SUMO modification of human PCNA at stalled replication fork［J］.Nucleic Acids Res，2012，40(13):6049-6059.

［4］GENING L V，TARANTUL V Z.Involvement of DNA polymerase iota in hypermutagenesis and tumorigenesis:an improper model can lead to inaccurate results［J］.Immunol Lett，2006，106(2):198-199.

［5］HOEGE C，PFANDER B，MOLDOVAN G L，et al.RAD6-dependent DNA repair is linked to modification of PCNA by ubiquitin and SUMO［J］.Nature，2002，419(6903):135-141.

［6］NORBURY C J，ZHIVOTOVSKY B.DNA damage induced apoptosis［J］.Oncogen，2004，23(16):2797-2808.

［7］PFEIFER G P，YOU Y H，BESARATINIA A.Mutations induced by ultraviolet［J］.Mutat Res，2005，571(1-2):19-31.

［8］胡恭華，李鋒，莊志雄，等.氫醌誘導下肝細胞 PCNA、RAD6B及RAD18基因mRNA表達的時間效應［J］.中國工業(yè)醫(yī)學雜志，2009，22(2):83-86，90.HU Gonghua，LI Feng，ZHUANG Zhixiong，et al.Study on time-effect of PCNA，RAD6B and RAD 18 mRNA expression induced by hydroquinone in L-02 hepatic cells［J］.Chinese J Ind Med，2009，22(2):83-86，90.

［9］ LIU W，YANG Y S，F(xiàn)RANCIS D，et al.Cadmium stress alters gene expression of DNA mismatch repair related genes in Arabidopsis seedlings［J］.Chemosphere，2008，73(7):1138-1144.

［10］ SHEN S Q，LI K，ZHU N，et al.Expression and clinical significance of NET-1 and PCNA in hepatocellular carcinoma［J］.Med Oncol，2008，25(3):341-345.

［11］ WANG Y Z，CAO Y Q，WU J N，et al.Expression of nitric oxide synthase in human gastric carcinoma and its relation to p53，PCNA ［J］.World J Gastroenterol，2005，11(1):46-50.