朱保成 夏 勇

(1.徐州醫(yī)學(xué)院心血管研究所，江蘇 徐州 221002；2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科， 江蘇 徐州 221002)

隨著醫(yī)療科技的不斷發(fā)展，經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)血管成形術(shù)(PTCA)已經(jīng)是治療冠心病的重要手段[1]。但其術(shù)后30%～50%的再狹窄率，嚴(yán)重限制了PTCA在臨床上的應(yīng)用。藥物涂層支架的出現(xiàn)是冠心病介入治療的一個重大進(jìn)展，可通過抑制血管的彈性回縮，預(yù)防晚期血管重塑，但經(jīng)皮冠狀動脈介入治療的再狹窄率仍有5%～9%[2]。雷帕霉素及紫杉醇在體外實(shí)驗(yàn)中可以顯著抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖[3]。熊果酸同樣為抗腫瘤藥物已經(jīng)被證實(shí)具有抑制血管平滑肌細(xì)胞遷移增殖[4]，抗炎抗氧化[5]，抗動脈粥樣硬化等多重功效。因而，我們制作球囊損傷大鼠頸總動脈模型，研究熊果酸對血管平滑肌細(xì)胞遷移增殖的影響及可能機(jī)制，為預(yù)防PCI術(shù)后再狹窄及動脈粥樣硬化提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 健康清潔級雄性SD大鼠32只，體重300～350 g，購自徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。飼養(yǎng)條件：按清潔級大鼠飼養(yǎng)，每籠放3～5只，實(shí)驗(yàn)室光照，通風(fēng)良好并按常規(guī)定期消毒。

1.1.2儀器及試劑 1.5 mm×15 mm球囊由美敦力公司提供，熊果酸購于上海晶純生化科技股份有限公司，NF-kB抗體購于北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。PCNA抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。SP試劑盒購于北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 將 32只大鼠隨機(jī)分為假損傷組(對照組)、頸總動脈球囊損傷組(模型組)、頸總動脈球囊損傷+ 熊果酸低劑量(低劑量組)、頸總動脈球囊損傷+ 熊果酸高劑量(高劑量組)，各組8只，每4只為一亞組，分別在術(shù)后7 d、21 d取頸總動脈。 對照組只進(jìn)行手術(shù)操作但不插入球囊損傷，術(shù)后每天給予等量二甲基亞砜腹腔注射直至取標(biāo)本；損傷組球囊損傷后給予等量二甲基亞砜腹腔注射直至取標(biāo)本；熊果酸低劑量組，于造模前2天給予熊果酸每日劑量10 mg/kg 腹腔注射直至取出標(biāo)本；熊果酸高劑量組，于造模前2天給予熊果酸每日劑量20 mg/kg 腹腔注射直至取出標(biāo)本。

1.2.2頸總動脈球囊損傷模型的建立 苯巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠。麻醉后大腹面向上固定于手術(shù)操作臺上，備皮、常規(guī)消毒、鋪巾，頸部正中切口 ，鈍性分離皮下組織，暴露左側(cè)頸總動脈及左頸內(nèi)、頸外動脈。永久結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)心段，并臨時結(jié)扎頸總動脈近心端和頸內(nèi)動脈。 于頸外動脈剪一V形切口。將1.5 mm×15 mm球囊經(jīng)頸外動脈切口插入頸總動脈，進(jìn)至距頸內(nèi)外動脈分叉處1～2 cm左右用壓力泵加壓并維持壓力2個大氣壓15秒，緩慢回拉導(dǎo)管至切口處將壓力泵回抽使壓力降為零。重復(fù)上述過程共3次，然后沿剪口近心端結(jié)扎頸外動脈，解除頸內(nèi)、頸總動脈結(jié)扎線，逐層縫合皮下組織及皮膚。術(shù)后慶大霉素沖洗切口和腹腔注射肝素100 U/kg。

1.2.3標(biāo)本收集 各組大鼠分別于術(shù)后7、21 d處死、取材。 用：苯巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠后，放血處死。取約1～2 cm長的左頸總動脈。PBS漂洗平均分為2段，浸入10%甲醛中于4冰箱固定。

1.2.4組織病理圖像分析 24h后將固定于10%甲醛溶液中的血管組織取出，脫水、透明、石蠟包埋。均勻切片(0.5 μm)，經(jīng)HE染色后在光鏡下(×100)觀察組織形態(tài)學(xué)變化及內(nèi)膜增生情況。采用光學(xué)顯微鏡和Image-pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對各組HE染色切片進(jìn)行圖像分析，計(jì)算血管內(nèi)膜面積(IA)和內(nèi)膜與中膜面積比(IA/MA)。

1.2.5免疫組織化學(xué)檢測核因子(NF-kB)及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA) 采用免疫組化SP法免疫組化染色，按試劑盒操作說明進(jìn)行試驗(yàn)。每段血管隨機(jī)選取3張切片，在高倍光學(xué)顯微鏡(×400)下觀測增殖情況，Image-pro Plus 6.0分析圖片，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞陽性率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1熊果酸能減少頸動脈球囊損傷后內(nèi)膜增厚程度，觀察術(shù)后7d、21d頸總動脈病理切片，見圖1。7d熊果酸高、低劑量組內(nèi)膜面積(IA)和內(nèi)膜與中膜面積比(IA/MA)較損傷組無明顯減少(P>0．05)。21d熊果酸高、低劑量組內(nèi)膜面積(IA)和內(nèi)膜與中膜面積比(IA/MA)較損傷組明顯減少(P<0．05)。21 d熊果酸高劑量組內(nèi)膜面積(IA)和內(nèi)膜與中膜面積比(IA/MA)較熊果酸低劑量組顯著減少(P<0．05)。(表1)。

2.27 d、21 d各組大鼠PCNA陽性細(xì)胞率

7d熊果酸高、低劑量組增生組織中可見PCNA表達(dá)的陽性率較損傷組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。21d熊果酸高、低劑量組增生組織中可見PCNA表達(dá)的陽性率較損傷組無明顯降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。7d熊果酸高劑量組PCNA表達(dá)陽性率較熊果酸低劑量組減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05),見圖2，表1。

2.37d、21 d各組大鼠NF-kB陽性細(xì)胞率

對照組兩時間點(diǎn)陽性細(xì)胞極少， 熊果酸高、低劑量組兩時間點(diǎn)增生組織中可見NF-kB表達(dá)的陽性率較損傷組均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。7d、21d熊果酸高劑量組NF-KB表達(dá)陽性率較低劑量組均減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3，表1。

1.21天模型組；2.21天低劑量組；3.21天高劑量組；4.21天對照組

5.7天模型組；6.7天低劑量組；7.7天高劑量組；8.7天對照組

表1 7d、21d各組內(nèi)膜面積(IA)和內(nèi)膜與中膜面積比(IA/MA)及PCNA、NF-kB 免疫組化細(xì)胞陽性率情況

注：*P較21天模型組(<0.05)；#P較21天模型組(<0.05)；**P較7天模型組陽性率(<0.05)；##P較7天模型組(<0.05)；###P較21天模型組(<0.05)

圖1 7d、21d各組頸總動脈新生內(nèi)膜增生情況(×100)

1.21天模型組；2.21天低劑量組；3.21天高劑量組；4.21天對照組;6.7天模型組；6.7天低劑量組；7.7天高劑量組；8.7天對照組

圖2 7d、21d各組PCNA表達(dá)的免疫組化情況(×400)

圖3 7d、21d各組NF-kB表達(dá)的免疫組化情況(×400)

3 討 論

PTCA術(shù)后再狹窄的形成與內(nèi)膜增生、血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖、血管彈性回縮以及炎癥有關(guān)已得到廣泛證實(shí)。其中血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的遷移和增殖與炎癥因子的作用是血管再狹窄的主要機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)主要研究熊果酸對球囊損傷大鼠頸總動脈內(nèi)膜增生及核因子-kB的影響。

NF-kB是一類具有多向性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)家族。它在機(jī)體免疫、炎癥、細(xì)胞增殖、黏附等方面發(fā)揮重要的作用[6]。NF-kB是Rel蛋白家族的成員以同源或異源二聚體的形式組成的一組轉(zhuǎn)錄因子。靜息狀態(tài)下，NF-kB蛋白二聚體與特異性抑制蛋白IKB形成三聚體，以非活化形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)外界因素作用于細(xì)胞后，NF-kB得以激活，進(jìn)入細(xì)胞核，繼而作用于靶基因，并迅速誘導(dǎo)基因表達(dá)，導(dǎo)致炎癥、增殖反應(yīng)的發(fā)生。等實(shí)驗(yàn)證明，NF-KB參與了AS中血管平滑肌細(xì)胞(vSMc)、血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)增殖和遷移的調(diào)節(jié)。熊果酸是存在于天然植物中的一種三萜類化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、等多種生物學(xué)效應(yīng)。Pozo[7]等率先報(bào)道了UA對大鼠頸動脈囊球?qū)Ч苎軗p傷模型的影響。他們發(fā)現(xiàn)uA能抑制損傷血管內(nèi)膜新生和中膜中血管平滑肌的遷移和增殖。本實(shí)驗(yàn)中熊果酸減少了NF-kB的表達(dá)，使血管管腔較模型組增生減少。

PCNA是一種酸性核蛋白在DNA復(fù)制中起重要作用[8]，其含量在靜止期細(xì)胞極少。PCNA因此被認(rèn)為是在正常和疾病狀態(tài)正在增殖的細(xì)胞的一個標(biāo)志。為評估熊果酸在核水平調(diào)控血管平滑肌增殖的影響，我們檢測PCNA的表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中可觀測到增殖的血管平滑肌細(xì)胞中有大量PCNA的表達(dá)，而熊果酸可明顯抑制PCNA的表達(dá)。

經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)過程中，球囊損傷內(nèi)皮及支架植入引起的炎癥反應(yīng)引起血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)向內(nèi)膜遷移增生，基質(zhì)分泌導(dǎo)致的支架再狹窄又與動脈粥樣硬化的發(fā)生機(jī)制有相似之處。本實(shí)驗(yàn)中熊果酸藥物組與損傷組比較，明顯減少內(nèi)膜增生程度，其主要機(jī)制可能是NF-kB與MMPs、COX-2的表達(dá)有關(guān)[9]，待進(jìn)一步證實(shí)。對于熊果酸與動脈粥樣硬化的關(guān)系尚有爭議[10]，需要更多論證。

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