李 晨 呂晨曦

(泰山醫(yī)學院運動醫(yī)學與康復學院，山東 泰安 271016)

隨著武術運動的不斷發(fā)展，武術競技水平逐年提高，比賽日趨白熱化。為了不斷提高武術運動水平，平時的大運動量重復運動訓練(力竭運動)就成為提高武術運動員競技水平、運動成績的重要手段，隨之而來的運動性骨骼肌微損傷(exercise-induced muscle damage，EIMD)在所難免。在各種運動項目的損傷類型中，骨骼肌微損傷所占的比率最高[1]。目前，多數(shù)學者認為，重復離心運動導致的骨骼肌超微結(jié)構變化不是損傷，而是骨骼肌肌節(jié)重塑過程。不同的運動方式、運動項目都可以引起骨骼肌超微結(jié)構變化。提示重復運動訓練可能對骨骼肌纖維的損傷產(chǎn)生一定的累加作用，本研究旨在能通過電鏡獲得大強度運動及補充泰山赤靈芝后大鼠骨骼肌超微結(jié)構變化圖像；利用圖像分析以及生物信息學手段進行鑒定、分析，推測其在骨骼肌微損傷過程中可能起到的預防作用以及骨骼肌損傷修復過程中可能存在的促進修復機制。

1 材料與方法

1.1一般資料

動物模型構建及分組：成年雄性SD大鼠52只，隨機分為2組：對照組、實驗組。重復運動的動物模型構建：大鼠在跑臺上進行下坡跑，速度18 m/min，坡度-16度，進行大運動量重復訓練(力竭運動)。設立實驗組(喂養(yǎng)泰山赤靈芝水煎液)、對照組，進行同樣的重復力竭運動，在同一時間點分別對正常對照組、實驗組在大運動量重復訓練(力竭運動)后取股四頭肌，同時對實驗組大鼠進行治療量泰山赤靈芝喂養(yǎng)，考察該藥對大運動量重復訓練(力竭運動)下大鼠骨骼肌微損傷變異是否有影響。觀察對照組、實驗組大運動量重復訓練(力竭運動)下大鼠骨骼肌超微結(jié)構變異進行研究。所有大鼠實驗前均未進行過跑臺運動。動物飼養(yǎng)室符合國家二級動物飼養(yǎng)標準，自由飲食。

1.2實驗方案

1.2.1設立實驗組(喂養(yǎng)泰山赤靈芝水煎液)、對照組，進行同樣進行大運動量重復訓練(力竭運動)，在同一時間點分別對正常對照組、實驗組在大運動量重復訓練(力竭運動)后用頸椎脫臼法處死，在股四頭肌上取大、小兩塊肌肉，小塊肌肉迅速切成米粒大小的組織塊，取材后放入濃度為3.5%的戊二醛固定液中固定過夜(備電鏡觀察)。大塊肌肉放入濃度為10%的中性緩沖福爾馬林固定液中固定過夜(備光鏡觀察)。

1.2.2電鏡標本及切片制作 電鏡標本用0.1M pH值為7.2的磷酸緩沖液沖洗5次，每隔20 min沖洗一次。用1%的鋨酸(四氧化鋨)再固定4 h后，再用0.1M、pH值為7.2的磷酸緩沖液沖洗5次，每20 min一次。用梯度乙醇脫水(30%、55%、70%、85%、95%、100%、100%乙醇)每步時間為30分鐘，再用環(huán)氧丙烷過渡兩次，每次2 h。使用Epon812樹脂浸透，包埋，聚合。使用LKB超薄切片機進行超波切片，用醋酸鈾—檸檬酸鉛雙染色。制成的電鏡切片使用美國GE公司生產(chǎn)的透射電鏡(山東農(nóng)業(yè)大學)進行觀察，并拍照。

1.3指標觀察 電鏡下觀察

1.3.1骨骼肌的粗、細兩種肌絲、位于肌節(jié)的A帶、M線、Z線、H帶、I帶、A帶。

1.3.2橫小管 是肌膜向肌漿內(nèi)凹陷形成的小管網(wǎng)，橫小管可將肌膜的興奮迅速傳到每個肌節(jié)。

1.3.3線粒體(mitochondrion)：粒體為線狀、長桿狀、卵圓形或圓形小體，外被雙層界膜。

1.3.4細胞核 主要看核膜厚度、基質(zhì)電子密度高低、有無核邊集現(xiàn)象。

2 結(jié) 果

2.1光鏡結(jié)果(HE染色)：對照組顯示縱切面上骨骼肌細胞呈細長的纖維狀、排列整齊無分支，胞質(zhì)多呈強嗜酸性(為I型纖維)；核小數(shù)多, 位于肌膜下，染色較淺。橫紋清晰、規(guī)則。橫斷面觀察，細胞多呈不規(guī)則的圓形，直徑大小不同，以強勢酸性者為主，弱嗜酸性者較粗(為II型纖維)，核小呈圓形。對照組、實驗組大運動量重復訓練(力竭運動)下大鼠骨骼肌超微結(jié)構可見肌細胞腫脹，節(jié)段性著色變淺局灶性損傷擴大，血管擴張出血溢血現(xiàn)象明顯，局部炎細胞多見損傷處斷片排列紊亂、界線不清的溶解現(xiàn)象嚴重。但細胞腫脹減輕、損傷灶縮小。實驗組(喂養(yǎng)泰山赤靈芝水煎液)細胞腫脹進一步減輕、損傷灶縮小。

圖1 (光鏡)CK組：縱切面上骨骼肌細胞呈細長的纖維狀、排列整齊無分支，胞質(zhì)多呈強嗜酸性(為I型纖維)；核小數(shù)多, 位于肌膜下，染色較淺。橫紋清晰、規(guī)則。

橫斷面觀察：細胞多呈不規(guī)則的圓形，直徑大小不同，以強勢酸性者為主，弱嗜酸性者較粗(為II型纖維)，核小呈圓形。(左：縱切圖；右：橫切圖)

2.2電鏡結(jié)果

2.2.1對照組、實驗組大運動量重復訓練(力竭運動)下線粒體出現(xiàn)水腫，內(nèi)部的嵴開始融解，出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象，其外膜不完整。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、肌纖維均出現(xiàn)不同的變化。

2.2.2實驗組(喂養(yǎng)泰山赤靈芝水煎液)肌細胞機能開始恢復，線粒體雖然仍有受到損傷的跡象，但已可以看出正在開始逐漸恢復。細胞結(jié)構恢復的較好，但線粒體數(shù)量較少，同時外膜進一步恢復。

大運動量重復訓練(力竭運動)下，線粒體數(shù)量較少，外膜不完整；骨骼肌超微結(jié)構有顯著改善，但是仍表現(xiàn)為肌原纖維排列不規(guī)則，肌節(jié)不完整，Z線變細，肌絲卷曲等表現(xiàn)。

研究結(jié)果顯示：大運動量重復訓練(力竭運動)及離心運動均可以引起骨骼肌超微結(jié)構的損傷。損傷變化主要表現(xiàn)為：運動后即刻骨骼肌細胞膜發(fā)生局部模糊、溶解，肌纖維間嵴有缺損，核膜皺縮，肌細胞內(nèi)線粒體空泡變性改變。隨著時間的延長，至大強度運動(重復運動)下?lián)p傷程度最重，出現(xiàn)肌纖維排列紊亂、扭曲，肌細胞膜溶解，Z線紊亂呈鋸齒狀，且部分消失，線粒體空泡變性改變加重。同時對實驗組大鼠進行治療量泰山赤靈芝喂養(yǎng)超微結(jié)構圖像顯示骨骼肌細胞超微結(jié)構、功能逐漸恢復，機體損傷程度開始逐漸降低，隨著時間的推移肌纖維排列基本正常，細胞膜部分皺縮，核膜間隙局部擴張，未見肌纖維水腫，Z線明暗帶、M線均可分清。大運動量重復訓練(力竭運動)且長時間、重復離心運動較一次性運動更容易引起骨骼肌超微結(jié)構的異常性變化，并延續(xù)到運動后數(shù)天，是造成運動功能下降、身體疲勞、酸痛、進而影響正常訓練和比賽的重要原因。

圖2 線粒體高度水腫。 嵴融解、空泡化現(xiàn)象

圖3 肌細胞機能開始恢復， 線粒體仍有受損跡象

圖4 I帶出現(xiàn)過度收縮膜為正?，F(xiàn)象，結(jié)構開始恢復

圖5 細胞結(jié)構、線粒體數(shù)量進一步恢復

圖6 線粒體變化并不大僅數(shù)量較少

圖7 線粒體外膜核基質(zhì)模糊

圖8 線粒體空泡化嚴重

圖9 肌節(jié)I帶變長，肌絲卷曲

圖10 線粒體數(shù)量較少，I帶拉長，Z線扭曲，核膜增厚

圖11 結(jié)構雖有改善，但排列仍不規(guī)則，肌節(jié)不完整，Z線變細，肌漿膜腫脹

3 討 論

我們知道，武術運動員骨骼肌的舒張與收縮運動是各種關節(jié)運動的基礎，其肌纖維受運動神經(jīng)元軸突末梢的支配。當神經(jīng)沖動傳到末梢時，興奮經(jīng)神經(jīng)——骨骼肌接頭傳遞給肌纖維，引起肌纖維的興奮與運動。隨著武術運動的不斷發(fā)展，競技武術水平逐年提高，武術比賽日趨白熱化，對武術運動員的體力、體能、綜合素質(zhì)的要求越來越高，骨骼肌超微結(jié)構機能訓練及調(diào)整的作用越來越受到武術教練們的高度重視，使得科學合理的安排大運動量(力竭運動)訓練成為提高武術運動成績的重要手段。武術運動員的骨骼肌超微結(jié)構損傷是競技體育運動中常見的損傷，在各種競技運動項目的損傷類型中，骨骼肌超微結(jié)構損傷所占的比率最高[2]。由于損傷后導致骨骼肌超微結(jié)構組織的病理機制改變等，對武術運動員的運動能力、運動壽命構成潛在威脅，所以充分研究骨骼肌超微結(jié)構損傷機制，了解其病理變化的特點及規(guī)律，探討其相應的預防、治療及康復措施等，一直都是運動醫(yī)學研究領域中的一個重要課題。在現(xiàn)代武術競技運動中骨骼肌超微結(jié)構損傷多見于像武術運動訓練這樣的周期性重復大運動量(力竭運動)的速度、耐力、力量、靈敏等方面訓練中，其中以重復離心運動訓練時損傷最為明顯。因此，在骨骼肌超微結(jié)構運動性損傷的實驗中，很多學者都采用下坡跑的離心運動方式復制骨骼肌超微結(jié)構損傷的病理模型[8-11]。原因是動物在下坡跑的過程中，骨骼肌超微結(jié)構需要抵抗身體重量而進行離心收縮做功，肌纖維組織承受過度載荷而致傷。同時研究證實，大運動量、尤其是離心運動會導致骨骼肌超微結(jié)構延遲性損傷。然而，連續(xù)性的離心運動訓練與骨骼肌超微結(jié)構損傷之間的研究卻不多見，且研究結(jié)果也并不一致[8,9]。

我們在實際的武術運動訓練過程中，武術運動員機體在進行大運動量、強度突然增加或運動方法改變時，通常會誘發(fā)肌肉延遲性酸痛(DOMS)的現(xiàn)象。1902年，Hough首先進行了，并提出了DOMS損傷學說，并認為酸痛是由于肌纖維內(nèi)部的破損造成的[2]。事實上，延遲性肌纖維酸痛及其伴隨改變常發(fā)生在武術運動訓練中。武術運動包含有大量離心舒張與收縮成分的肌纖維運動，這是武術運動訓練中不可避免的現(xiàn)象。據(jù)此，延遲性肌肉酸痛產(chǎn)生機制較多認為與肌纖維損傷時的急性炎癥有關。近來，國內(nèi)學者提出，環(huán)境或運動疲勞與骨骼肌超微結(jié)構、功能的變化直接相關。這些變化主要包括敏感細胞器線粒體的積極響應，能源物質(zhì)的積累，骨骼肌纖維結(jié)構的改變和自由基、ATP等對細胞凋亡的啟動[12,13]。

二十世紀六十年代以來，通過對人和動物肌纖維超微結(jié)構及機制的研究，提供了肌纖維損傷的直接證據(jù)：運動性骨骼肌微損傷在電鏡下主要表現(xiàn)為線粒體腫脹、收縮蛋白和細胞骨架的變化。其中，Z盤是整個肌節(jié)結(jié)構中最容易受破壞的部位。這種變化表現(xiàn)為Z盤加寬、Z帶斷裂或完全消失。離心運動所引起的骨骼肌超微結(jié)構變化更明顯，A帶也會出現(xiàn)損傷性變化。應當注意的是，運動性骨骼肌微損傷(Micro-injury of Skeletal Muscle)僅占全部肌纖維的極小部分，在人體實驗中，由于取樣技術、活檢取樣的限制，研究時往往遺漏某些肌纖維的超微結(jié)構變化，可能會造成不同的研究結(jié)果。

目前，關于力竭離心運動的研究逐漸增多，力竭離心運動引起骨骼肌超微結(jié)構的損傷主要表現(xiàn)為：運動后即刻：肌細胞膜發(fā)生局部模糊、溶解，肌纖維間嵴有缺損，核膜皺縮，肌細胞內(nèi)線粒體空泡變性改變。隨著時間的延長損傷程度加重，出現(xiàn)肌纖維排列紊亂、扭曲，肌細胞膜溶解，Z線紊亂呈鋸齒狀，且部分消失，線粒體空泡變性改。進行治療量泰山赤靈芝喂養(yǎng)超微結(jié)構圖像顯示骨骼肌細胞超微結(jié)構、功能逐漸恢復，機體損傷程度開始逐漸降低，隨著時間的推移肌纖維排列基本正常，細胞膜部分皺縮，核膜間隙局部擴張，未見肌纖維水腫，Z線明暗帶、M線均可分清。大強度運動(重復運動)且長時間、重復離心運動較一次性運動更容易引起骨骼肌超微結(jié)構的異常性變化，并延續(xù)到運動后數(shù)天，是造成運動功能下降、身體疲勞、酸痛、進而影響正常訓練和比賽的重要原因。

關于重復運動訓練，早在本世紀60年就有研究者從動物身上獲得了組織學證據(jù)，證明反復運動可以引起骨骼肌超微結(jié)構的變化。田野、楊錫讓等[14]針對運動性骨骼肌超微結(jié)構以及機能變化的機制問題進行了一系列的研究證實，力竭性離心運動可引起大鼠比目魚肌出現(xiàn)形態(tài)學改變，這些改變包括肌原纖維排列不規(guī)則，Z線呈鋸齒狀或波形異常，甚至消失。通過定量統(tǒng)計力竭運動后Z線異常百分率得出：骨骼肌超微結(jié)構損傷隨著運動后時間的不斷延長，先出現(xiàn)加重狀況。與本組光鏡下結(jié)果一致。本實驗中我們發(fā)現(xiàn)離心運動后骨骼肌出現(xiàn)明顯的組織形態(tài)結(jié)構和超微結(jié)構的變化，并且，這種變化具有明顯的時相性和延遲性，重復運動過程中骨骼肌超微結(jié)構有恢復的趨勢，如開始階段以間質(zhì)血管改變和炎癥細胞浸潤為特征，隨后則可見肌細胞腫脹，電鏡下骨骼肌細損傷的組織形態(tài)變化表現(xiàn)主要有：肌原纖維排列混亂、肌節(jié)、肌絲排列紊亂、Z線模糊、扭曲，呈鋸齒狀、波紋狀變化。肌核腫脹或固縮，線粒體腫脹等。這種變化是骨骼肌對運動負荷刺激的反應，提示這種運動性骨骼肌微損傷未必是一種完全的病理過程，可能是骨骼肌適應運動訓練刺激的一個介于生理與病理的中間過程——“先解離而后才重新建構”，可能正是骨骼肌對運動訓練刺激的一種適應[15,16]。

目前，公認的理論是運動性骨骼肌微損傷是由于長時間、高強度、重復運動后結(jié)果，常表現(xiàn)為延遲性肌肉酸痛，盡管有自主緩解現(xiàn)象，但由于延遲性肌肉酸痛的癥狀體征對運動訓練的影響，以及肌肉酸痛與肌纖維拉傷有某種內(nèi)在的聯(lián)系等原因。所以，幾十年來國內(nèi)外學者一直嘗試了解運動性微損傷的特性、力求尋找一些解決措施。為探尋最新的、可靠的、有效的方法來干預運動性骨骼肌微損傷的發(fā)展提供理論參考依據(jù)。目前，解釋骨骼肌微損傷現(xiàn)象的假說主要是機械損傷和化學損傷兩種假說[17]。機械損傷理論(高張力理論)認為運動性骨骼肌超微結(jié)構變化起因于機械因素，主要依據(jù)Morgan和Morgan等提出的離心運動時肌節(jié)長度不均一性學說(sarcomere length non-uniformities)和肌節(jié)爆裂學說(popping sarcomere hypothesis)，其主要論點是：離心運動時由于肌節(jié)被動拉長的長度不均一，且肌節(jié)長度-張力曲線處于降支狀態(tài)時肌節(jié)結(jié)構穩(wěn)定性最差，導致較弱肌節(jié)被過度牽拉[3]。并認為疼痛是由肌纖維結(jié)構損傷引起的，其中包括肌纖維損傷和結(jié)締組織損傷?；瘜W假說：運動應激使肌細胞增加的自由基將攻擊細胞膜脂質(zhì)，出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生大量丙二醛(MDA)，引起細胞膜通透性的改變，鈣離子進入細胞內(nèi)，細胞內(nèi)鈣的超載將抑制細胞內(nèi)呼吸鏈，從而導致ATP生成減少及有巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞參與的炎癥反應等。所以用兩種或兩種以上的假說綜合解釋骨骼肌微損傷似乎更為合理。據(jù)此，人們設計出了補充人參皂甙Re和Rb1保護中等強度運動訓練大鼠骨骼肌超微結(jié)構，效果滿意[18]。張海平等[1]進行了維生素E對離心運動大鼠骨骼肌超微結(jié)構影響的研究，結(jié)果顯示：維生素E對運動性骨骼肌損傷的預防作用主要是通過抗氧化作用完成的。運動前和運動中補充維生素E，可以在活性氧與生物膜發(fā)生反應之前，捕捉自由基以阻滯不飽和脂肪酸的過氧化反應，減少過氧物質(zhì)的生成，使細胞膜結(jié)構免受氧化破壞，膜的完整性得以保護，必然會保護細胞內(nèi)膜結(jié)構各ATP酶的活性，調(diào)節(jié)和修正由于運動而出現(xiàn)的鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)，降低胞漿鈣離子的含量，減少由于細胞內(nèi)鈣超載引起的骨骼肌損傷，從而達到對骨骼肌微損傷的預防作用。

總之，武術運動員在平時的大運動量訓練中產(chǎn)生運動性疲勞現(xiàn)象是不可避免的，也是造成和限制運動訓練效果的重要因素之一。適度的重復運動訓練(骨骼肌疲勞然后施以合理的恢復手段)可以促進人體機能水平的提高，而過度的運動性疲勞和不及時消除的疲勞堆積，無助于提高武術運動員機能及運動技能水平，最終對骨骼肌超微結(jié)構的病理性損傷形成損害。武術運動員在訓練期給與適當?shù)闹委熈刻┥匠囔`芝藥物干預有助于運動性骨骼肌微損傷的修復。

4 值得進一步研究的題目

①重復離心運動導致的骨骼肌超微結(jié)構變化是病理性損傷，還是肌節(jié)的主動適應過程。

②骨骼肌超微結(jié)構變化與基質(zhì)、肌膜結(jié)構的關系。

③肌節(jié)恢復、重塑過程是否需要炎癥因子參與(有學者報道：運動后血液中與炎癥反應有關的蛋白、如急相蛋白和炎癥過程指示物含量增加)等是今后研究的方向。

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