賀淵哲，邵先舫，熊 輝，劉志軍，李 前，嚴(yán) 望，湯思敏

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬常德醫(yī)院，湖南 常德 415000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

福爾馬林足底炎性疼痛大鼠模型的建立及其背根神經(jīng)節(jié)辣椒素受體表達(dá)水平

賀淵哲1，2，邵先舫1，熊 輝3，劉志軍1，李 前1，嚴(yán) 望1，湯思敏2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬常德醫(yī)院，湖南 常德 415000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

目的 評(píng)價(jià)福爾馬林足底炎性疼痛大鼠模型的疼痛行為學(xué)表現(xiàn)，并對(duì)該模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)辣椒素受體表達(dá)水平進(jìn)行分析。方法 SD大鼠24只，隨機(jī)分為2組，即對(duì)照組（n=12）及福爾馬林模型組（n=12）。對(duì)照組不予處理，福爾馬林模型組于左后足底注射5%福爾馬林0.1 mL，觀察造模后大鼠疼痛行為學(xué)反應(yīng)，并以Dubuisson評(píng)分方法進(jìn)行記錄比較；2組大鼠在指定時(shí)間點(diǎn)取出L3-6節(jié)段背根神經(jīng)節(jié)，運(yùn)用RT-PCR、蛋白質(zhì)印跡（Western blot）檢測(cè)辣椒素受體在大鼠背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)水平。結(jié)果 福爾馬林模型組大鼠呈典型的雙相傷害性行為反應(yīng)，大鼠疼痛反應(yīng)120 min內(nèi)積分在5～1，對(duì)照組無(wú)疼痛反應(yīng)。福爾馬林模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)辣椒素受體表達(dá)水平顯著增加，與對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05﹚。結(jié)論 福爾馬林足底炎性疼痛大鼠模型可以產(chǎn)生持續(xù)的、可信的痛覺(jué)過(guò)敏，并誘導(dǎo)大鼠背根神經(jīng)節(jié)辣椒素受體表達(dá)水平增加，是研究組織損傷誘發(fā)炎性疼痛機(jī)制的較佳模型選擇。

福爾馬林炎性疼痛；辣椒素受體；背根神經(jīng)節(jié)

1997年由Dubuisson與Dennis創(chuàng)立的，引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物持續(xù)的炎性疼痛[1]的福爾馬林注射足底方法，已經(jīng)得到國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)界的公認(rèn)，廣泛應(yīng)用于疼痛機(jī)制的研究。辣椒素受體是一個(gè)能被辣椒素激活的受體，屬于瞬時(shí)感受器電位（transient receptor potential，TRP）家族，當(dāng)其與配體結(jié)合后，通道開(kāi)放，陽(yáng)離子(尤其是鈉離子和鈣離子)從胞外進(jìn)入胞內(nèi)，引發(fā)了一系列生物學(xué)效應(yīng)[2]。辣椒素受體廣泛分布于哺乳動(dòng)物的感覺(jué)神經(jīng)纖維，尤其是無(wú)髓鞘的C類和部分少髓鞘的A類纖維中[3]。辣椒素受體能被多種理化刺激激活，參與人體內(nèi)如咳嗽、疼痛、炎癥等生理或病理過(guò)程[4-7]。本研究旨在復(fù)制福爾馬林足底炎性疼痛大鼠模型，觀察其疼痛行為學(xué)表現(xiàn)，并利用實(shí)時(shí)熒光定量（RT-PCR）和Western blotting的方法觀察辣椒素受體在大鼠炎性疼痛模型背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)情況，為課題組下一步研究鎮(zhèn)痛藥物的機(jī)制奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)將方法與結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 一抗 （Anti-VR1 antibody ab74855），（廠家:abcam，代購(gòu)公司:長(zhǎng)沙奧星醫(yī)療科技有限公司）；二抗（HRP-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L)），（廠家:abcam，代購(gòu)公司:長(zhǎng)沙奧星醫(yī)療科技有限公司）。

1.1.2 主要儀器動(dòng)物 DYCZ-40D濕式轉(zhuǎn)膜裝置（北京六一儀器廠），HAD-T10電動(dòng)組織分散儀 （北京恒奧德），JY3000核酸電泳儀 （上海達(dá)平），UV-19紫外分光光度計(jì)（上海析譜），GTR16-2冷凍離心機(jī)（北京時(shí)代兆利離）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源合格證:syxk（湘）2009-0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用合格證號(hào):scxk（湘）2011-0003。

1.2 建模及分組[8]

健康雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量250～280 g，購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物一般狀態(tài)良好，皮毛光澤，進(jìn)食與活動(dòng)正常。適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，每組12只。

用微量注射器抽取5%福爾馬林0.1 mL注入模型組大鼠左側(cè)后足底皮下建立大鼠炎性疼痛模型，空白對(duì)照組不予任何處理。造模完成后在飼養(yǎng)箱底成45°夾角放置一面鏡子以便觀察動(dòng)物后肢的活動(dòng)情況。

1.3 痛行為觀察及分級(jí)評(píng)價(jià)[3-4]

于注射福爾馬林后 1、5、15、30、45、60、90 min及120 min分別觀察每只大鼠的疼痛反應(yīng)，按下述標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行疼痛分級(jí)并記錄 0分:注射福爾馬林一側(cè)后足與對(duì)側(cè)后足均接觸底面，行走自如；1分:兩側(cè)后足均接觸底面，但行走時(shí)注射側(cè)輕微跛行；2分:兩側(cè)后足均接觸底面，但身體重心在健側(cè)，行走時(shí)注射側(cè)明顯跛行；3分:注射側(cè)后足輕微接觸底面，但不敢負(fù)重，行走時(shí)抬起；4分:注射福爾馬林一側(cè)后足抬起，不接觸任何表面；5分:大鼠舔、咬、抖動(dòng)注射福爾馬林一側(cè)后足。

1.4 組織標(biāo)本的取材與處理[10-11]

大鼠于造模后24、48、72 h，每次每組取3只，腹腔注射水合氯醛麻醉，解剖暴露大鼠脊柱，定位L3-6椎體，取出定位節(jié)段，縱向打開(kāi)椎管，暴露背根神經(jīng)節(jié)，依次取出，置入2 mL凍存管中，迅速保存于液氮中，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中備用。

1.5 RT-PCR檢測(cè)

采用RT-PCR方法對(duì)背根神經(jīng)節(jié)中辣椒受體mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)?？俁NA提取:樣本用液氮在研缽中研磨成粉狀，按照TRIzol試劑說(shuō)明書提取標(biāo)本總RNA，并溶于DEPC水，各標(biāo)本總RNA用 l%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)其質(zhì)量；以DEPC水作空白對(duì)照，用紫外分光光度儀測(cè)定RNA濃度及樣本A260與A280比值，檢測(cè)其純度。每個(gè)樣本分別取1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。cDNA的合成:選用Random hexamer primer 1 μL，加無(wú)核酶水至12 μL；5×reaction buffer 4 μL，RiboLockTMRNase Inhibitor(20 U/μL)，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，RevertAidTMM-MuLV Reverse Transciptase(200 U/μL)，總反應(yīng)體系為 20 μL。經(jīng) 25℃ 5 min，42℃ 60 min，70℃ 5 min后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩１緦?shí)驗(yàn)選用內(nèi)參基因?yàn)?正向引物:5'-CCAGCCATGTACGTFGCTATC-3反向引物:5'-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3'，辣椒素受體上游引物:5'-ATCGAGCTCATGGAACAACGGGCTAGCTTAG-3'下游引物:5'-ACTGGTACCTATTTCTCCCCTGGGACCAT-3''，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以2-△△CT表示，得出“±s”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）檢測(cè)

1.6.1 組織總蛋白的提取 背根神經(jīng)節(jié)組織剪切成細(xì)小的碎片。每100 mg組織加入1 mL RIPA裂解液。用機(jī)械勻漿器勻漿。冰上放置30 min，-80℃凍融2次。超聲波處理，打斷DNA。12 000 r/min離心10 min。吸取上清液，蛋白定量，分裝，保存在-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳 按照安裝玻璃板→配制10%Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠溶液→分離聚膠→吸水→制備濃縮膠→濃縮膠聚合完全→按自己設(shè)計(jì)的點(diǎn)樣順序點(diǎn)樣→連接電源進(jìn)行電泳→卸下玻璃板，緊靠最左邊一孔（第一槽）凝膠下部切去一角以標(biāo)注凝膠的方位的順序進(jìn)行蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.6.3 免疫印跡 將封閉的PVDF膜TTBS漂洗2次，加入用5%脫脂奶粉稀釋 (濃度為1∶500)的辣椒素受體多克隆抗體中，4℃下反應(yīng)過(guò)夜，TTBS漂洗PVDF膜10 min×4次，加入1∶2 000稀釋的二抗，室溫下孵育 60 min，TTBS漂洗 PVDF膜 10 min×4次，最后經(jīng) ECL發(fā)光液顯影，X線膠壓片后送自動(dòng)X線洗片機(jī)洗片。以每條蛋白電泳帶的灰度值表示辣椒素受體蛋白的表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以“±s”表示。結(jié)果應(yīng)用t檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，等級(jí)資料用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 福爾馬林模型組、對(duì)照組疼痛行為學(xué)表現(xiàn)結(jié)果

福爾馬林模型組大鼠左側(cè)后肢足底皮下注射5%福爾馬林0.1 mL后呈典型的雙相傷害性行為反應(yīng)，出現(xiàn)躁動(dòng)不安、不時(shí)尖叫、注射足抬起不著地、舔咬或抖動(dòng)注射足等反應(yīng)。其傷害性行為學(xué)痛反應(yīng)呈典型的雙相變化，即注射后即刻開(kāi)始，持續(xù)約3～ 5 min的急性疼痛時(shí)相(第一時(shí)相)，約5～10 min的靜息期，和隨后出現(xiàn)的可持續(xù)40～60 min的繼發(fā)性疼痛一時(shí)相(第二時(shí)相)[10]。結(jié)果見(jiàn)圖1。對(duì)照組無(wú)上述疼痛行為，疼痛反應(yīng)積分為0。

圖1 注射福爾馬林后不同時(shí)間模型組大鼠疼痛評(píng)分折線圖

2.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

福爾馬林模型組背根神經(jīng)節(jié)中辣椒素受體m-RNA的表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1，圖2。

表1 各時(shí)間點(diǎn)大鼠背根神經(jīng)節(jié)中辣椒素受體mRNA表達(dá)比較 （s，n=3）

表1 各時(shí)間點(diǎn)大鼠背根神經(jīng)節(jié)中辣椒素受體mRNA表達(dá)比較 （s，n=3）

注:模型組與空白組比較△P<0.01。

組別空白對(duì)照組福爾馬林模型組1 d 0.264±0.018 1.125±0.035△2 d 0.292±0.012 1.029±0.062△3 d 0.319±0.011 0.910±0.090△

圖2 各時(shí)間點(diǎn)大鼠背根神經(jīng)節(jié)中辣椒素受體mRNA表達(dá)的柱形圖

2.3 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）結(jié)果

福爾馬林模型組及空白對(duì)照組每個(gè)時(shí)相點(diǎn)中隨機(jī)取3個(gè)樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)，其辣椒素受體的蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)表達(dá)量條帶灰度分析結(jié)果示:福爾馬林模型組背根神經(jīng)節(jié)中辣椒素受體蛋白的表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組上升，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2，圖3-4。

表2 辣椒素受體條帶灰度分析結(jié)果 （±s，n=3）

表2 辣椒素受體條帶灰度分析結(jié)果 （±s，n=3）

注:與空白組比較#P<0.05。

組別空白對(duì)照組福爾馬林模型組1 d 0.550 1±0.103 6 0.952 2±0.041 0#2 d 0.540 1±0.107 2 0.963 5±0.052 0#3 d 0.532 8±0.118 7 0.948 0±0.047 0#

圖3 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中辣椒素受體表達(dá)柱形圖

圖4 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中辣椒素受體的表達(dá)電泳圖

3 討論

福爾馬林足底炎性疼痛大鼠模型屬經(jīng)典疼痛造模，模型成功復(fù)制率高，造模成功后有明顯的行為學(xué)變化，其疼痛行為反應(yīng)表現(xiàn)為雙相傷害性行為反應(yīng)，第一時(shí)相是福爾馬林直接刺激大鼠傷害性感受器，屬短暫的急性疼痛反應(yīng)，第二時(shí)相屬繼發(fā)性傷害性反應(yīng)，是依賴于外周的炎癥發(fā)展及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的參與[11-12]。其疼痛表現(xiàn)與臨床實(shí)際表現(xiàn)相似，目前已在疼痛發(fā)生機(jī)制及鎮(zhèn)痛藥物機(jī)制中廣泛應(yīng)用。大量研究表明，福爾馬林致痛大鼠模型可作為對(duì)臨床疼痛進(jìn)行定量研究的模型。本實(shí)驗(yàn)采用5%福爾馬林注射于大鼠左側(cè)后足底復(fù)制福爾馬林大鼠炎性疼痛模型，發(fā)現(xiàn)大鼠注射福爾馬林后，注射足表現(xiàn)出縮腿、舔爪、抖動(dòng)等反應(yīng)，且表現(xiàn)為典型雙相傷害性行為反應(yīng)，說(shuō)明福爾馬林大鼠炎性疼痛模型的復(fù)制是成功的，為下一步鎮(zhèn)痛藥物的機(jī)制研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

辣椒素受體是一個(gè)配體門控的非選擇性陽(yáng)離子通道，Helliwell等[13]研究表明辣椒素受體廣泛存在于背根神經(jīng)節(jié)。Caterina等[14]成功培育出辣椒素受體基因敲出小鼠，其生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖力、運(yùn)動(dòng)與行為和正常小鼠一樣，對(duì)傷害性刺激反應(yīng)正常，但對(duì)外周炎性疼痛反應(yīng)減弱。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，福爾馬林足底炎性疼痛大鼠模型背根神經(jīng)節(jié)辣椒素受體通道蛋白極有可能參與疼痛信號(hào)傳導(dǎo)，在疼痛發(fā)生機(jī)制中扮演重要角色，其背根神經(jīng)節(jié)中辣椒素受體的表達(dá)水平較空白對(duì)照上升，提示背根神經(jīng)節(jié)中辣椒素受體的表達(dá)量可能與疼痛的發(fā)生相關(guān)。本文為課題組下一步研究陣痛藥物的機(jī)制奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并有待大樣本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

[1]Clavelou P，Dallel R，Orliaguet T，et a1.The orofacial formalin test in rats:effects of different formalin concentrations[J].paln，1995，62(3):295-301.

[2] Caterina MJ， Schumacher MA， Tominaga M，et al.The capsaicin receptor:a heat-activated ion chan-nel in the pain pathway［J］.Nature，1997，389(6653):816－824.

[3]Alawi K，Keeble J.The paradoxical role of the transient receptor potential vanilloid 1 receptor in inflammation［J］.Pharmacol Ther，2010，125(2):181－195.

[4]Alawi K，Keeble J.The paradoxical role of the transient receptor potential vanilloid 1 receptor in inflammation［J］.Pharmacol Ther，2010，125(2):181－195.

[5]LUO Xiu-ju，PENG Jun，LI Yuan-jian.Recent advances in the study on capsaicinoids and capsinoids［J］.Eur J Pharmacol，2011，650(1):1－7.

[6]PENG Jun，LI Yuan-jian.The vanilloid receptor TR-PV1:role in cardiovascular and gastrointestinal protection［J］.Eur J Pharmacol，2010，627(1－3):1－7.

[7]Baylie RL，Brayden JE.TRPV channels and vascular function［J］. Acta Physiol (Oxf)，2010，doi: 10.1111/j.1748 －1716.2010.02217.x.

[8]Fertleman CR，Aker MD，Parker KA，et al.SCN9A mutat ions in paroxysmalextreme pain disorder:Allelic variants underlie distinctchanneldefectsand phe-notypes[J].Neuron，2006，52(5):767-747.

[9]楊安峰，王 平.大鼠的解剖和組織[M].北京:科學(xué)出版社，1985: 159-189.

[10]孫焱芫，陳 軍，熊利澤，等.鞘內(nèi)依咪酯對(duì)大鼠足底皮下注入蜜蜂毒誘致持續(xù)性痛的抑制作用[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，20 (4):300-303.

[11]Cowan A，Porreca F，Wheeler H.Use of the formalin test in evaluating analgesics[J].NIDA Res Monogr，1989（95）:116-122.

[12]Yaksh TL， Rudy TA.Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space[J].Physiol Behav，1976（17）:175-185.

[13]Helliwell RJA，MeUtchie LM，Clarke M，et al.CaPsaicin sensitivity is assoeiated with the expression of the vanilloid(cpsaiein)receptor (VRI)mRNA in adult rat sensory ganglia[J]. Neurosci Lett，1998（250）:177-180.

[14] Caterina MJ， Leffler A， Malmberg AB， et al.Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor[J].Science，2000，288(3):306-313.

（本文編輯 楊 瑛）

Establishment of rat model with inflammatory pain induced by formalin and the expression level of capsaicin receptor in dorsal root ganglion

HE Yuanzhe1，2,SHAO Xianfang1,XIONG Hui3,LIU Zhijun1,LI Qian1,YAN Wang1, TANG Siming2
(1.Changde Affiliated Hospital,Hunan University of CM,Changde,Hunan 415000,China;
2.Graduate School,Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410208,China;
3.Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To evaluate the behavioral manifestations of inflammatory pain in rat model injected with formalin in plantar,and analyze the expression level of capsaicin receptor of dorsal root ganglion in rat.Methods 24 SD rats were randomly divided into model group and control group.12 SD rats in model group were injected with 0.1 mL 5%formalin in the left plantar,other 12 SD rats in controls did not be treated.The pain behaviors were observed,and Dubuisson score method was used.The segments of L3-6 dorsal root ganglion have been taken from rats in a specific time.The expression level of capsaicin receptor of dorsal root ganglionwas detected by RT-PCR and western blotting.Results Formalin injected group showed a typically biphasic nociceptive responses,and had scores from 5～1 in pain response within 5 min(P<0.05). Control group did not have pain response. The expression level of capsaicin receptor of model group was significantly higher than that of the control group(P<0.05).Conclusion The rat model with inflammatory pain induced by the plantar injection of formalin has sustained,crediblehyperalgesia,and hasan increased expression levelofcapsaicin receptor of dorsal root ganglion.It might be a good model for the mechanism study of the inflammatory pain induced by tissue damage.

Inflammatory pain induced by formalin;capsaicin receptor;dorsal root ganglion

R441.1；Q95-33

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.01.003.010.04

2013－12－03

湖南省常德市科技局（2011sk13）。

賀淵哲，男，湖南中醫(yī)藥大學(xué)2011級(jí)碩士研究生，研究方向:中醫(yī)藥防治創(chuàng)傷修復(fù)的研究。

*邵先舫，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，骨科主任醫(yī)師，E-mail:50529779@qq.com。