陳新宇，蔡虎志，史 微，陳青揚，盧 青，劉越美，唐燕萍

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

溫陽振衰顆粒對阿霉素誘導(dǎo)慢性心衰兔心肌細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5表達(dá)的影響

陳新宇1，蔡虎志2，史 微2，陳青揚2，盧 青1，劉越美1，唐燕萍2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

目的 觀察溫陽振衰顆粒對阿霉素誘導(dǎo)慢性心衰模型兔心肌細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5表達(dá)的影響。方法 健康新西蘭兔60只，隨機抽取15只為正常對照組，余45只兔耳緣靜脈注射阿霉素4周后，先從中隨機抽取13只為模型4周組，余下實驗兔按心功能分層，隨機分組，再隨機分為模型8周組及各治療組，各組用對應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)4周。分別檢測4、8周末兔心肌細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5（ERK5）的總蛋白及蛋白磷酸化（P-ERK5）水平。結(jié)果 阿霉素造模后，模型4、8周組心肌P-ERK5水平均下調(diào)，兩者較正常對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且模型8周組較模型4周組下調(diào)更為明顯（P＜0.05）；各組經(jīng)藥物干預(yù)4周后心肌P-ERK5水平較正常對照組仍明顯下調(diào)（P＜0.05），但均高于模型8周組（P＜0.05），其中以陽性對照組和溫陽高劑量組心肌P-ERK5水平升高最為明顯（P＜0.05）；各組心肌ERK5水平相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 溫陽振衰顆粒能上調(diào)ERK5蛋白磷酸化的水平，從而激活ERK5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中以高劑量溫陽振衰顆粒最為明顯，這可能是其調(diào)控慢性心衰時心室重構(gòu)和心肌細(xì)胞凋亡的重要機制之一。

慢性心衰；溫陽振衰顆粒；阿霉素；細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5；蛋白磷酸化；心肌；兔

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是各種嚴(yán)重心臟疾病終末階段所表現(xiàn)出來的一種臨床綜合征，是各種心血管疾病發(fā)展的終末階段，已成為日益關(guān)注的最重要的心血管病癥之一。現(xiàn)已基本明確CHF的發(fā)生、發(fā)展的分子學(xué)基礎(chǔ)是心肌重構(gòu)或心室重塑[1]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)亦越來越受到研究人員的關(guān)注。MAPK級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑存在于所有真核生物中，是細(xì)胞外各種信號刺激引起細(xì)胞分化、增殖和凋亡等多種反應(yīng)的共同匯聚點或中樞。而其在心血管方面的作用也正被廣泛地關(guān)注與研究[2-3]。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶 5（mitogen-activated protein kinase5，ERK5）是MAPK家族中的一種非典型通路，有研究顯示[4]，ERK5磷酸化（PERK5）的表達(dá)對正常心肌細(xì)胞的維護起雙向調(diào)節(jié)作用，抑制其通路活性對病理狀態(tài)下的心肌肥厚亦有抑制作用但同時也促進了心肌細(xì)胞的凋亡，因此ERK5的變化在CHF的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸的過程中可能具有重要作用。溫陽振衰顆粒是臨床治療CHF的有效中藥復(fù)方，也是作者的經(jīng)驗方，經(jīng)前期研究顯示其具有改善患者心功能及抑制細(xì)胞炎性因子的作用，但其作用機制有待進一步研究。本實驗通過阿霉素復(fù)制慢性心衰動物模型，來探討ERK5與慢性心衰的關(guān)系及溫陽振衰顆粒治療慢性心衰的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 健康雄性普通級新西蘭兔60只，體質(zhì)量（1.87±0.12）kg，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，動物許可證批號:SCXK（湘）2009-0012。在自由飲食、光/暗周期為12 h/12 h（光照時間為6:00-18:00）、背景噪聲為（40±10）db、溫度（20±3）℃條件下飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。

1.1.2 主要藥物與試劑 鹽酸阿霉素 （深圳萬樂藥業(yè)有限公司，批號:201109，注射劑，規(guī)格10 mg/瓶）；溫陽振衰顆粒 （湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室，批號:201205，8 g/包）；依那普利片（辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號:201107，5 mg/片）；ERK5抗體（美國Santa Cruz公司，批號:H-300 sc-5626）；PERK5抗體（美國Santa Cruz公司，批號:Y220 sc-135761)。

1.1.3 主要儀器 Beckman LE-80K超速離心機（美國Beckman公司）；DYCZ-24F電泳儀（北京六一儀器廠）；NovaBlot轉(zhuǎn)印儀 （美國GE healthcare公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組 新西蘭兔60只，隨機抽取15只為正常對照組，將余下45只按文獻(xiàn)報道方法[5]進行兔耳緣靜脈注射阿霉素，4周后從存活的43只實驗兔中隨機抽取13只為模型4周組，檢測其心肌ERK5及P-ERK5水平。余下30只實驗兔按心功能分層后，再隨機分為模型8周組、陽性對照組和溫陽振衰顆粒低、中、高劑量組，每組6只。

1.2.2 CHF模型建立 參照張靜等[5]方法，將注射用鹽酸阿霉素用生理鹽水稀釋成1.0 mg/mL溶液，耳緣靜脈注射，每次1.0 mL/kg，每周2次，連續(xù)8周。

1.2.3 給藥方法 溫陽振衰顆粒為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，規(guī)格為8 g/包，臨床推薦成人起始劑量8 g/d，實驗兔中藥給藥低劑量按成人70 kg起始劑量體表面積換算，低、中、高劑量按1∶2∶4倍計算。4周末經(jīng)超聲心動圖檢測提示各組造模成功后，自實驗第5周起，溫陽振衰顆粒低、中、高劑量組分別按0.4、0.8、1.6 g/（kg·d）配以蒸餾水10 mL進行灌胃，陽性對照組依那普利按5 mg/（kg·d）配以蒸餾水10 mL進行灌胃[6]，模型8周組灌服等量蒸餾水，各組連續(xù)灌胃4周。

1.3 樣本采集與檢測

1.3.1 心肌組織總蛋白質(zhì)提取 將預(yù)處死兔麻醉后迅速取左室面心肌組織，置入液氮凍存。將凍結(jié)的心肌轉(zhuǎn)移到預(yù)先稱質(zhì)量的離心管中，稱出心肌的質(zhì)量。按照約1∶8（質(zhì)量∶體積）的比例加入組織裂解液混合后，冰浴上機械勻漿，渦旋混勻，靜置1 h，21 000 r/min、4℃離心30 min，取上清即為組織的總蛋白質(zhì)，Bradford方法測定蛋白質(zhì)濃度，然后分裝，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 ERK5和P-ERK5的指標(biāo)檢測 采用Western-blot檢測，將50 μg心肌總蛋白加入2×SDS上樣緩沖液 （0.1 mol/L Tris pH 6.8，0.2 mol/L DTT，4% SDS，20%甘油，0.02%溴酚蘭)，100℃變性8 min，上樣，恒定電流，前15 min 16 mA/gel電泳，然后32 mA/gel電泳至底部。電轉(zhuǎn)印按照膜面積0.8 mA/cm2設(shè)定電流，轉(zhuǎn)膜2 h。然后用含3%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h。將膜取出，置于一雜交袋中，分別加入抗ERK5、p-ERK5抗體，4℃過夜。TBS-Tween 20漂洗10 min×3次，將膜取出，置于另一雜交袋中，加入酶標(biāo)二抗(1∶2 000)，室溫雜交2 h。TBST漂洗10 min×3次。ECL曝光顯像，掃描(300 dpi)，保存，分析。ERK5值以吸光值1（Actin1）、P-ERK5值以吸光值2（Actin2）分別作為對照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有資料采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件包進行處理，計量資料均采用“±s”表示，并進行正態(tài)性檢驗，多組均數(shù)組間比較采用單因素方差分析，顯著性水準(zhǔn)P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 動物數(shù)量變化

造模后的45只新西蘭兔分別于造模3、4周時因反復(fù)腹瀉各死亡1只，4周末分組后模型8周組、陽性對照組和溫陽中劑量組實驗兔在實驗結(jié)束前各死亡1只，考慮為阿霉素推注速度過快致急性中毒所致，正常對照組均生長良好。

2.2 溫陽振衰顆粒對阿霉素誘導(dǎo) CHF兔心肌ERK5表達(dá)的影響

實驗結(jié)果顯示:各組心肌ERK5水平相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示各組心肌ERK5水平在阿霉素的誘導(dǎo)下無明顯變化，溫陽振衰顆粒亦不能對ERK5表達(dá)產(chǎn)生明顯影響，見表1、圖1。

2.3 溫陽振衰顆粒對阿霉素誘導(dǎo)性CHF兔心肌PERK5表達(dá)的影響

實驗結(jié)果顯示:阿霉素造模后，模型4、8周組心肌P-ERK5水平均下調(diào)，兩者較正常對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且模型8周組較模型4周組下調(diào)更為明顯（P＜0.05）。經(jīng)陽性對照組及溫陽各組治療4周后心肌P-ERK5水平較正常對照組仍明顯下調(diào)（P＜0.05），但均高于模型8周組（P＜0.05），其中以陽性對照組和溫陽高劑量組心肌P-ERK5水平升高最為明顯（P＜0.05），且兩者P-ERK5水平相比無明顯差異（P＞0.05）。提示溫陽振衰顆?？杉せ頒HF模型兔心肌P-ERK5的表達(dá)，從而影響ERK5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，見表1、圖1。

表1 溫陽振衰顆粒對阿霉素誘導(dǎo)性CHF兔心肌ERK5、P-ERK5表達(dá)的影響 （s）

表1 溫陽振衰顆粒對阿霉素誘導(dǎo)性CHF兔心肌ERK5、P-ERK5表達(dá)的影響 （s）

注:與正常對照組比較#P＜0.05；與模型4周組比較△P＜0.05；與陽性對照組比較▲P＜0.05。

組別正常對照組模型4周組模型8周組陽性對照組溫陽低劑組溫陽中劑組溫陽高劑組n 15 13 5 5 6 5 6 ERK5/Actin1 0.05±0.01 0.06±0.02 0.05±0.01 0.06±0.01 0.05±0.02 0.05±0.01 0.05±0.02 P-ERK5/Actin2 0.78±0.03 0.64±0.02#0.42±0.02#△0.53±0.03#△0.47±0.03#△▲0.48±0.02#△▲0.54±0.02#△

圖1 各組阿霉素誘導(dǎo)CHF兔心肌ERK5、P-ERK5表達(dá)的電泳圖

3 討論

近年的研究表明MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常是CHF的重要發(fā)病機制之一，目前，在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了4條比較典型的MAPK信號通路:細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2、c-Jun N-末端激酶、P38激酶同工酶和ERK5。ERK5是MAPK家族中的一種非典型通路，主要定位于胞質(zhì)，接受細(xì)胞外傳來的信號并由其上游激酶MEK5激活，然后可轉(zhuǎn)位于細(xì)胞核對轉(zhuǎn)錄因子心肌細(xì)胞增強子 （myocyte enhancer factor，MEF2）磷酸化而調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性。其信號通路與經(jīng)典的MAPK通路一致，由胞外刺激→MAPKKK→MAPKK(MAPKK是ERK5唯一且特異性的上游激酶)→ERK5激活。最初的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子如表皮生長因子、神經(jīng)生長因子等能誘導(dǎo)激活ERK5，而ERK5可促進轉(zhuǎn)錄因子MEF2家族和cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白 (camp responds element binding protein，CREB)的磷酸化，這些轉(zhuǎn)錄因子與細(xì)胞生存密切相關(guān)。ERK5還可以入核直接調(diào)節(jié)其他轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，如c-Jun參與細(xì)胞周期的調(diào)控，而c-fos可介導(dǎo)ERK5的抗凋亡作用。研究發(fā)現(xiàn)ERK5與血管發(fā)育、增殖等功能密切相關(guān)[7]，自1995年由Zhou等[8]首次克隆后，已發(fā)現(xiàn)其控制著一系列原認(rèn)為由ERK1/2完成的功能，并明確了在氧化應(yīng)激、低氧、活性氧簇以及各種絲裂原的激動下，在保持血管完整和細(xì)胞生長中起到重要作用。Regan等[9]研究發(fā)現(xiàn)，ERK5小鼠缺陷模型表現(xiàn)出多種胚胎外血管和胚胎心血管發(fā)育遲緩，表明ERK5在心血管發(fā)育中起著極其重要的作用。Hayashi[10]等也發(fā)現(xiàn)，敲除成年小鼠ERK5基因后，小鼠在2～4周內(nèi)死亡。本實驗結(jié)果說明經(jīng)阿霉素造模后，模型4、8周組心肌P-ERK5水平均下調(diào)，兩者較正常對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且模型8周組較模型4周組下調(diào)更為明顯。經(jīng)陽性對照組及溫陽各組治療4周后心肌P-ERK5水平較正常對照組仍明顯下調(diào)，但均高于模型8周組，其中以陽性對照組和溫陽高劑量組心肌P-ERK5水平升高最為明顯，且兩者P-ERK5水平相比無明顯差異。但各組心肌ERK5水平相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這提示溫陽振衰顆?？杉せ頒HF模型兔心肌PERK5的表達(dá)，從而影響ERK5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，這其中以高劑量溫陽振衰顆粒最為明顯。

溫陽振衰顆粒以溫陽益氣、利水消腫為其基本功效，藥物主要由附片、干姜、紅參、甘草等組成。其中附片有回陽救逆，助陽補火的作用，其性純陽無陰，剛烈迅捷，走而不守，能通上達(dá)下，行表徹里，通行十二經(jīng)脈，乃治療陽衰陰盛、水濕腫滿等病癥之要藥，亦為中醫(yī)治病救命之第一品藥。干姜能溫中散寒，回陽通脈?！侗静萸笳妗吩?“干姜大熱無毒，守而不走，凡胃中虛冷，元陽欲覺，合以附子同投，則能回陽立效”，古醫(yī)書有“附子無姜不熱”之句。紅參為人參蒸制后干燥者，性微溫，味甘，大補元氣，補脾益肺。甘草味甘性平，能益氣補中，調(diào)和諸藥，此方中還可以減輕附片的毒性作用。諸藥合用，共奏溫陽益氣、利水消腫之功。通過前期研究發(fā)現(xiàn)溫陽振衰顆粒對于治療CHF顯示出良好的臨床療效，能顯著改善心功能，且可降低血清腫瘤壞死因子-a、內(nèi)皮素-1水平，上調(diào)白細(xì)胞介素-10水平[11]。還可降低血漿血管緊張素Ⅱ、心房利鈉肽水平[12]。在心肌細(xì)胞凋亡檢測中，能降低心肌細(xì)胞凋亡陽性面密度比值，對心肌細(xì)胞起到明顯保護作用[13]。本研究結(jié)果則進一步提示，溫陽振衰顆粒可能通過上調(diào)CHF模型兔心肌組織ERK5蛋白的磷酸化，從而激活ERK5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化，進而對心肌重塑和心肌細(xì)胞凋亡起到調(diào)控作用。

[1]DhingraS，Sharma AK，SinglaDK，etal.P38 and ERK1/2 MAPKs mediate the interplay of TNF-αand IL-10 in regulating oxidative stress and cardiac myocyte apoptosis[J].Am J Physiol Heart Cric Physiol，2007，293（6）:3 524-3 531.

[2]Brown RD，Ambler SK，Li M，et al.MAP kinase kinase kinase-2(MEKK2)regulates hypertrophic remodeling of the right ventricle in hypoxia-induced pulmonary hypertension[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2013，304（2）:H269-281.

[3]Carlota Garcia-Hoz，Guzman Sanchez-Fernandez，Ramon Garcia-Escudero，et al.Protein Kinase C-mediated Gα Stimulation of ERK5 Protein Pathway in Cardiomyocytes and Cardiac Fibroblasts [J].The journal of biological chemistry，2012，287（10）:7 792-7 802.

[4]Kimura TE，Jin J，Zi M，et al.Targeted Deletion of the Extracellular Signal-Regulated Protein Kinase 5 Attenuates Hypertrophic Response and Promotes Pressure Overload-Induced Apoptosis in the heart[J].Circ Res，2010，106（5）:961-970.

[5]張 靜，李庚山，李國草，等.兔阿霉素心衰模型的建立[J].心臟雜志，2004，16（5）:437-439.

[6]于厚志，楊 慶，鄧玨琳，等.依那普利對實驗兔肥厚心室肌電重構(gòu)的影響及其機理研究[J]中華心血管病雜志，2005，33（6）:565-567.

[7]Bartha E，Nishida E.MAPK signal:ERK5 versus ERK1/2[J].EMB0 Rep，2006，7(8):782，786.

[8]Yi bin Wang.Mitogen-Activated Protein Kinases in Heart development and diseases[J].Circulation，2007，116（12）:1 413-1 423.

[9]Regan CP，Li W，Boucher DM，et al.ERK5 null mice display multiple extraembryonic vascular and embryonic cardiovascular defects[J].Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(14):48-53.

[10]HayashiM，Kim SW，Imanaka-YoshidaK， etal.Targeted deletion of BMK1/ERK5 in adult mice Perturbs vascular integrity and leadsto endothelialfailure [J].Clin Inverst，2004.113(8):138-148.

[11]唐燕萍，盧 青，謝海波，等.溫陽強心方對慢性充血性心力衰竭家兔細(xì)胞因子的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2012，19（2）:35-40.

[12]陳新宇，張 帆，盧 青，等.重劑溫陽強心方對慢性充血性心力衰竭兔神經(jīng)內(nèi)分泌的影響[J].湖南中醫(yī)雜志，2011，27（5）:118-119.

[13]陳新宇，唐燕萍，盧 青，等.溫陽強心方對兔慢性充血性心力衰竭細(xì)胞凋亡及心臟結(jié)構(gòu)的影響 [J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，32（1）:16-19.

（本文編輯 徐愛良）

Effects of Wenyang Zhenshuai Granule on the expression of extracellular signal-regulated kinase 5 of the myocardial tissue in rabbit model with chronic heart failure induced by adriamycin

CHEN Xinyu1，CAI Huzhi2，SHI Wei2，CHEN Qingyang2，LU Qing1，LIU Yuemei1，TANG Yanping2
(1.First Affiliated Hospital,Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410007,China;
2.Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To elucidate the effects of Wenyang Zhenshuai Granule on the expression of extracellular signal-regulated kinase 5 (ERK5) of the myocardial tissue in rabbit model with chronic heart failure induced by adriamycin.Methods 15 rabbits were randomly extracted from 60 rabbits for the control group,13 rabbits were randomly extracted from other 45 rabbits after modeled by intravenous injection of adriamycin for 4 weeks,which is named model 4 weeks group.The rest rabbits were randomly divided into 5 groups including the model 8weeks group and the 4 medicine treatment groups.Each medicine group was given enalapril (positive control)or Wenyang Zhenshuai Granule high dose,medium dose and low dose by gastric administration for 4 consecutive weeks.The expression levels of ERK5 and P-ERK5 in all groups were detected by western blotting.Results P-ERK5 expression levels in myocardial tissue of model 4 and 8 weeks groups were lower than that in control group(P<0.05),and its down-regulation in model 8 weeks group was marked than that of model 4 weeks group.4 weeks after treatment, P-ERK5 expression levels in all medicine treating groups were lower than that of control group, but significantly higher than that of model 8 weeks group(P<0.05).Among of them,up-regulation of P-ERK5 in the positive control group and Wenyang Zhenshuai Granule high dose group were more obviously(P<0.05).There were no significant differences in ERK5 proteins among these groups.Conclusion Wenyang Zhenshuai Granule can promote the level of p-ERK5 protein, then activate ERK5 signal transduction pathway, and Wenyang Zhenshuai Granule high dose group has more significant effects than other two doses groups,which may be one of the mechanisms of Wenyang Zhenshuai Granule regulating the ventricular remodeling and the apoptosis of myocardial cells in chronic heart failure.

chronic heart failure;Wenyang Zhenshuai Granule;adriamycin;ERK5;protein phosphorylation;myocardial tissue;rabbit

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.01.004.014.05

2013－11－17

國家自然科學(xué)基金資助項目 （81173213/H2708）；湖南省科技廳科技計劃項目 （2011FJ3042）；湖南省中醫(yī)藥管理局重點項目（201106）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項目（CX2011B341）。

陳新宇，男，教授，醫(yī)學(xué)博士，博士研究生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥防治心腦血管疾病的研究。