吳莎 華清泉 楊琨 肖伯奎 張志敏

阿司匹林類藥物的主要成分是水楊酸鈉，是臨床常用的解熱、鎮(zhèn)痛、抗風濕類藥物，在心血管疾病的預防中起到重要作用[1]。該藥在治療疾病的同時，高劑量使用也會產生明顯的毒副作用，聽力下降、耳鳴及言語認知能力的降低是水楊酸鈉耳毒性的三大主要癥狀[2]。多年來，學者們從聽覺系統(tǒng)的不同層面探討了水楊酸鈉耳毒性的機制，包括耳蝸(形態(tài)學改變、電生理學以及生化等方面的改變)、蝸神經(聽神經復合動作電位、單根耳蝸神經纖維自發(fā)放電活動、耳蝸神經電生理活動的平均譜等)以及耳蝸核、下丘和聽皮層的神經元放電和神經遞質等方面的研究[3～9]，然而，至今水楊酸鈉耳毒性具體機制仍在探索中。

研究表明水楊酸鈉能夠改變聽覺中樞系統(tǒng)興奮性，聽覺中樞興奮性神經遞質與抑制性神經遞質的失衡與水楊酸鈉所致耳毒性作用關系密切[10]。下丘是中樞聽覺系統(tǒng)的重要結構之一，具有精密加工和處理復雜聽覺信息的功能。γ-氨基丁酸(GABA)是中樞神經系統(tǒng)中重要的抑制性神經遞質，通過與其特異性受體結合產生抑制性突觸后電位，谷氨酸脫羧酶(GAD)是GABA生成的關鍵酶，在體內催化興奮性神經遞質谷氨酸(Glu)轉化生成GABA[11]，GAD67作為GAD的亞型之一，負責維持GABA基本水平[12]。為此，本研究擬觀察長期注射水楊酸鈉對大鼠下丘GAD67蛋白表達的影響，探討其在水楊酸鈉致耳鳴、聽力下降中的可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物分組及處理 選擇健康成年Wistar大鼠18只(由湖北省預防科學院動物實驗中心提供)，雌雄不限，體重200～300 g，耳廓反應靈敏、無中耳感染、強噪聲暴露及耳毒性藥物使用史。適應性飼養(yǎng)一周后，將實驗動物隨機分為水楊酸鈉組(6只)、生理鹽水組(6只)、對照組(6只)。將水楊酸鈉(Sigma公司，S2679)溶于生理鹽水中配成10%溶液，水楊酸鈉組實驗動物肌肉(后腿)注射水楊酸鈉175 mg/kg，2次/天，時間間隔8小時，連續(xù)注射28天[6,13]；生理鹽水組每天相同時間及部位注射等量生理鹽水，連續(xù)注射28天；對照組實驗動物不予處理。

1.2ABR檢測 造模結束后，三組大鼠采用美國TDT系統(tǒng)進行ABR檢測。大鼠經2%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后，保持肛溫37 ℃并置于隔聲屏蔽室內進行檢測。選用短聲(click)作為刺激聲，單耳給聲刺激，耳機發(fā)聲窗距外耳道口1 cm，刺激速率為21次/秒，帶通濾波100～3 000 Hz，觀察時程為10 ms，疊加次數1 024次。記錄電極置于兩側外耳道口與顱正中線交叉處皮下，參考電極置于同側耳乳突皮下，接地電極置于鼻尖正中皮下。測試聲響從110 dB SPL開始，以5 dB SPL逐次遞減，以波Ⅲ最后消失的上一強度作為ABR反應閾，記錄ABR反應閾及90 dB SPL時波Ⅲ潛伏期。

1.3Western blot檢測下丘GAD67蛋白表達 ABR檢測后將三組大鼠斷頭處死并在冰盤中迅速剝離下丘，-80 ℃冰箱保存。各組標本分別加入適當體積組織裂解液后冰上徹底勻漿，離心后取上清液。采用Bradford方法測定蛋白濃度，各組取總蛋白40 μg經10%SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液室溫封閉1小時，將PVDF膜浸泡于兔抗鼠GAD67多克隆抗體(1∶1 000)4 ℃過夜，TBST洗滌5 min×3次，加入HRP標記羊抗兔二抗(1∶3 000)室溫下孵育30分鐘，TBST洗滌5 min×3次，在暗室內加入ECL化學發(fā)光底物曝光，最后用顯影、定影試劑進行顯影和定影。選用β-action作為內參照，并用圖像分析系統(tǒng)分析結果，比較各組下丘GAD67蛋白與β-action光密度比值。

1.4統(tǒng)計學方法 數據采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行分析，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1各組動物ABR檢測結果 水楊酸鈉肌肉注射28天后，水楊酸鈉組ABR波形分化較差，各波振幅下降。水楊酸鈉組、生理鹽水組、對照組ABR反應閾及波Ⅲ潛伏期見表1，可見，水楊酸鈉組ABR反應閾較生理鹽水組、對照組明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；水楊酸鈉組波Ⅲ潛伏期較生理鹽水組、對照組明顯延長，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；生理鹽水組ABR反應閾、波Ⅲ潛伏期與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2各組動物下丘GAD67蛋白表達結果 Western

表1 三組大鼠ABR反應閾及波Ⅲ潛伏期比較

注：*與生理鹽水組、對照組比較，P<0.01

blot檢測結果顯示，實驗各組均表達相對分子量約為67 kDa的GAD67蛋白。與生理鹽水組、對照組比較，水楊酸鈉組下丘GAD67蛋白表達升高，差異具有顯著統(tǒng)計學性意義(P<0.01)，而生理鹽水組與對照組下丘GAD67蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖1，表2)。

圖1 Western blot檢測下丘GAD67表達

表2 三組大鼠下丘GAD67蛋白與β-action的光密度比值

注：與生理鹽水組、對照組比較，P<0.01

3 討論

阿司匹林廣泛應用于臨床，至今約有150年的歷史。研究發(fā)現大劑量服用此類藥物(血藥濃度超過30 mg/dl)后，可導致患者出現聽力下降及耳鳴[14]。同樣，動物研究顯示長期注射水楊酸鈉可致實驗動物ABR各波振幅下降、反應閾升高且潛伏期延長[15]。本研究結果顯示，水楊酸鈉組動物肌肉注射水楊酸鈉28天后ABR反應閾較生理鹽水組、對照組明顯升高，波Ⅲ潛伏期明顯延長；而生理鹽水組與對照組ABR反應閾及波Ⅲ潛伏期無明顯差異，與上述報道一致，說明長期注射水楊酸鈉能夠導致大鼠聽功能損傷。

在中樞聽覺系統(tǒng)中，興奮性神經遞質與抑制性神經遞質的平衡是維持正常聽覺的重要因素，當其平衡受到影響時勢必影響聽覺信號的正常輸入，導致聽覺障礙。GABA作為抑制性神經遞質廣泛存在于中樞神經系統(tǒng)中，在信號傳遞過程中起著重要的作用，可通過與其特異性受體結合發(fā)揮抑制性效應。研究指出水楊酸鈉可導致GABA發(fā)生下調使聽覺中樞抑制性效應減弱，興奮性效應增加，從而導致中樞聽覺系統(tǒng)神經活動增強[16]而發(fā)生耳鳴。GAD是GABA合成的重要限速酶，在體內催化谷氨酸(Glu)轉化為GABA，并直接影響腦組織中GABA的濃度，其在哺乳動物大腦中存在分子量分別為65 kDa、67 kDa兩種亞型，即GAD65、GAD67[12]。GAD65可能作為一種惰性儲備，提供GABA生成的短期需求；而GAD67則可能為機體提供更為長程的生理調節(jié)[17]，GAD表達的上調被認為是使GABA能神經元抑制性功能增加而發(fā)生的代償性反應[18]。Bauer等[19]在動物實驗(8 mg/ml，連續(xù)4月)中發(fā)現，長期口服水楊酸鈉后GAD蛋白在動物下丘中表達上調，而在非聽覺結構中，GAD蛋白表達無明顯改變。本研究結果顯示，水楊酸鈉組動物下丘GAD67蛋白表達較生理鹽水組、對照組明顯升高，而生理鹽水組與對照組GAD67蛋白的表達無明顯差異，說明長期肌肉注射水楊酸鈉能夠導致大鼠下丘GAD67蛋白表達水平升高。推測在長期肌肉注射水楊酸鈉的過程中，聽覺通路持續(xù)性興奮，機體通過上調GAD67蛋白表達，作為負反饋以代償去抑制(GABA所介導抑制作用的降低)所引起的興奮與抑制的失衡狀態(tài)，促進抑制性效應的產生。

綜上所述，本研究結果表明長期注射水楊酸鈉能夠引起大鼠聽力下降及下丘GAD67蛋白表達上調。GAD67蛋白表達水平的升高極有可能作為一種機體對水楊酸鈉引起耳毒性的一種抑制性代償反應和調節(jié)機制，其調節(jié)的具體機制有待進一步研究。

4 參考文獻

1 Kojda G. Direct vasoprotection by aspirin: a significant bonus to antiplatelet activity[J]? Cardiovasc Res,2004,64:192.

2 Ramesh G, Reeves WB. Salicylate reduces cisplatin nephrotoxicity by inhibition of tumor necrosis factor-alpha[J]. Kidney Int,2004, 65:490.

3 Kimitsuki T, Kakazu Y, Matsumoto N, et al. Salicylate-induced morphological changes of isolated inner hair cells and outer cells from guinea-pig cochlea[J]. Auris Nasus Larynx,2009,36:152.

4 Guitton MJ, Caston J, Reul J, et al.Salicylate induces tinnitus through activation of cochlear NMDA receptors[J]. J Neurosci, 2003, 23:3 944.

5 Ruel J, Chabbert C, Nouvian R, et al. Salicylate enables cochlear arachidonic-acid-sensitive NMDA receptor responses[J]. J Neurosci,2008, 28:7 313.

6 Huang ZW, Luo Y, Wu Z, et al. Paradoxical enhancement of active cochlear mechanics in Long-term administration of salicylate[J]. J Neurophysiol,2005,93:2 053.

7 Peleg U, Perez R, Freeman S, et al. Salicylate ototoxicity and its implications for cochlear microphonic potential generation[J]. J Basic Clin Physiol Pharmacol,2007,18:173.

8 Eggermont JJ. Pathophysiology of tinnitus[J].Prog Brain Res,2007,166:19.

9 陳林，王海濤，陸云剛，等.水楊酸鈉誘導耳鳴的神經機制[J].中國科學技術大學學報，2008，38:986.

10 Sun W, Lu J, Stolzberg D,et al.Salicylate increases the gain of the central auditory system[J].Neuroscience,2009,159:325.

11 Burianova J ,Ouda L, Profant O,et al. Age-related changes in GAD levels in the central auditory system of the rat[J]. Exp Gerontol, 2009, 44:161.

12 Hwang IK, Li H, Yoo KY, et al. Comparison of glutamic acid decarboxylase 67 immunoreactive neurons in the hippocampal CA1 region at various age stages in dogs[J]. Neurosci Lett , 2008,431:251.

13 黃治物，楊琨，肖伯奎.慢性注射水楊酸鈉使大鼠耳蝸prestin表達上調[J].中華耳科學雜志，2010，8:451.

14 王洪田，孫建和，于寧，等.水楊酸鈉引起耳鳴大鼠聽皮層突觸形態(tài)改變的透射電鏡觀察[J].中華耳科學雜志，2009，7:208.

15 陳抗松，廖華，楊希林，等.水楊酸致耳鳴大鼠的行為學及聽性腦干反應改變[J].聽力學及言語疾病雜志，2013,21:163.

16 Wang HT, Luo B, Zhou KQ, et al. Sodium salicylate reduces inhibitory postsynaptic currents in neurons of rat auditory cortex[J]. Hear Res, 2006, 215: 77.

17 Pouyatos B, Morel G, Lambert-Xolin AM, et al.Consequences of noise-or styrene-induced cochlear damages on glutamate decarboxylase levels in the rat inferior colliculus[J]. Hear Res,2004,189：83.

18 Esclapez M, Houser CR . Up-regulation of GAD65 and GAD67 in remaining hippocampal GABA neurons in a model of temporal lobe epilepsy[J]. J Comp Neurol, 1999, 412:488.

19 Bauer CA, Brozoski TJ, Holder TM, et al. Effects of chronic salicylate on GABAergic activity in rat inferior colliculus[J]. Hear Res, 2000,147:175.