劉華 趙守琴 高占梅 范爾鐘 李潔 宋揚

目前研究認為中耳黏膜同其他呼吸道黏膜功能相似，反應方式相同，同樣可以發(fā)生變態(tài)反應[1,2]。變態(tài)反應是導致具有變應性體質(zhì)的分泌性中耳炎(otitis media with effusion,OME)患者中耳滲液持續(xù)不愈的主要原因之一。抗原刺激下中耳局部微環(huán)境中T細胞激活，T輔助細胞(T helper cell,Th)分化發(fā)生偏移，導致Th1 /Th2失衡，產(chǎn)生以Th2 細胞過度增殖、活化和細胞因子過量分泌的Th2反應，被認為是OME患者中耳變應性炎癥的重要特征[3,4]。免疫學研究發(fā)現(xiàn)Th1和Th2細胞在不同水平可以相互調(diào)節(jié)[5]，一方面，Th2細胞因子-白細胞介素4(interleukin 4，IL-4)誘導Th0細胞不斷分化為Th2細胞，進一步大量分泌IL-4，從而維系Th2極化反應；另一方面，Th1細胞因子-干擾素γ(interferon γ, IFN-γ)可以發(fā)揮截然相反的作用，導致Th1 /Th2平衡轉(zhuǎn)向Th1偏移， 因此，通過調(diào)節(jié)Th1 /Th2失衡狀態(tài)成為免疫治療研究的熱點。白細胞介素18(IL-18)是新近發(fā)現(xiàn)的一種免疫調(diào)節(jié)因子，最初因為能強力誘導IFN-γ的產(chǎn)生，而被定義為IFN-γ誘導因子，進一步研究發(fā)現(xiàn)其還能通過促進T細胞的增殖、增加自然殺傷(natural killer,NK)細胞的毒性等方式發(fā)揮多種免疫調(diào)節(jié)作用[6]。IL-18在哮喘和變應性鼻炎中的作用受到關注，但其在中耳變應性炎癥時發(fā)揮何種調(diào)節(jié)作用有待探討，本研究擬通過觀察OME模型大鼠在應用IL-18后中耳微環(huán)境中炎癥細胞的增殖情況以及IFN-γ和IL-4的表達變化，探討IL-18對OME大鼠中耳炎癥的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 雄性SD大鼠18只(36耳)(SPF級，北京維通利華實驗動物技術有限公司)，體重250～300 g。隨機分為對照組(A組)、OME模型組(B組)和IL-18注射組(C組)，每組各6只(12耳)，全部動物經(jīng)耳內(nèi)鏡檢查證實無外耳道及中耳感染。

1.2實驗試劑 卵清蛋白干粉( Ovalbumin , OVA) V級，購自美國Sigma公司；兔抗大鼠IFN-γ抗體及兔抗大鼠IL-4抗體，均購自武漢博士德生物工程有限公司；DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；重組大鼠IL-18，購自美國R&D公司。

1.3分泌性中耳炎模型建立 造模方法參考Hardy的方法[7]，采用1.2 mg OVA溶于0.6 ml磷酸緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)，再以5.14 mg氫氧化鋁(購自北京化學試劑公司)溶于0.6 ml PBS作為免疫佐劑對B組和C組大鼠行腹腔注射，第8天重復注射一次, 此為全身致敏階段；第15天用10 %水合氯醛15 mg/kg對該2組大鼠行腹腔注射麻醉，在手術顯微鏡下經(jīng)鼓膜以微量進樣器將0.1 mg OVA溶于35 μl PBS后注入大鼠中耳腔，第16天再次麻醉，耳內(nèi)鏡觀察鼓膜情況，并重復第2次注射, 此為耳內(nèi)激發(fā)階段，制成OME模型。耳鏡檢查發(fā)現(xiàn)鼓膜明顯內(nèi)陷、紅斑，部分可見液平面及中耳內(nèi)氣泡形成，視為造模成功。

A組大鼠在全身致敏階段以5.14 mg氫氧化鋁溶于1.2 ml PBS腹腔注射, “耳內(nèi)激發(fā)階段”用PBS替代OVA；C組在OME造模同時于第1、2、7、8、15、16天時分別腹腔注射重組大鼠IL-18 1 μg加生理鹽水0.2 ml(IL-18應用劑量及方法參考張惠蘭等[8]的研究)，A、B兩組在相同時間點腹腔注射生理鹽水0.2 ml。

1.4觀察鼓膜及中耳灌洗液中細胞因子含量檢測 實驗第18 天時各組大鼠麻醉后顯微鏡下觀察鼓膜，然后斷頭處死, 取出雙側(cè)聽泡, 自聽泡鉆孔，以50 μl PBS灌洗中耳腔3次并收集灌洗液150 μl，4 ℃ 4 000×g離心10 min后，取上清液凍存于-80 ℃待測細胞因子。以ELISA試劑盒(購自晶美生物工程有限公司)檢測中耳滲液中IFN-γ、IL-4濃度。

1.5細胞計數(shù)方法 取各組大鼠雙側(cè)中耳組織標本，用4 %的多聚甲醛固定, 10%EDTA溶液脫鈣,經(jīng)脫水后,石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察中耳的病理變化,計數(shù)嗜酸性粒細胞,甲苯胺藍染色計數(shù)肥大細胞。自中耳鼓室段起始處切片, 厚度為3～ 4 nm, 出現(xiàn)管腔狀結(jié)構(gòu)后, 連續(xù)切片選取第9、10 張。低倍鏡下于中耳黏膜上皮下固有層及骨髓腔選取5 個細胞數(shù)多的視野( 黏膜1 個視野, 骨髓腔4 個視野) , 高倍鏡下計數(shù)細胞。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包，各組間比較用方差分析F檢驗，兩組間差異比較用q檢驗(LSD法)，均以P<0.05(雙側(cè)檢驗)為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

C組麻醉意外死亡1只，余各組無動物死亡。

2.1各組動物鼓膜像表現(xiàn) A組鼓膜基本正常，可見少量放射狀血管紋，B組鼓膜及周圍組織出現(xiàn)充血，鼓膜有放射狀擴張的血管紋，可見明顯內(nèi)陷、紅斑，部分動物可見液平面及中耳內(nèi)氣泡形成。C組出現(xiàn)鼓膜內(nèi)陷、充血和放射狀血管紋，少數(shù)動物可見氣泡(圖1)。

圖1 三組動物鼓膜圖像 (a、b、c分別為A、B、C組)圖2 三組大鼠中耳黏膜厚度比較 (a、b、c分別為A、B、C組)(HE 40×10)圖3 三組動物黏膜纖毛上皮觀察情況 (a、b、c分別為A、B、C組)(HE 40×10)圖4 三組動物中耳細胞計數(shù) (a、b、c分別為A、B、C組)

2.2各組動物中耳粘膜病理改變 光鏡觀察：A組纖毛上皮輕度腫脹，纖毛結(jié)構(gòu)正常，排列整齊。B組咽鼓管鼓室段纖毛上皮腫脹，纖毛排列紊亂，部分纖毛脫落，中耳黏膜明顯增厚，毛細血管擴張，中耳黏膜下層、骨髓腔中有較多嗜酸粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞，此外咽鼓管周圍組織中肥大細胞增多、脫顆粒。C組中耳黏膜和咽鼓管鼓室段黏膜炎癥較B組無明顯減輕(圖2，3)，中耳黏膜或骨髓腔中性粒細胞較B組明顯增多(P<0.05)，嗜酸粒細胞計數(shù)仍多于對照組(P<0.05)(表1)。

表1 三組動物中耳黏膜下固有層或骨髓腔中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、咽鼓管周圍組織肥大細胞計數(shù)(個，

注：*與B、C兩組比較，P<0.05；△與B組比較，P<0.05；#與C組比較，P<0.05

2.3IL-18對中耳微環(huán)境中Th1、Th2細胞因子的影響 由表2可見，三組動物中耳IFN-γ含量比較差異有統(tǒng)計學意義，C組IFN-γ濃度明顯高于B組和A組(P<0.05)，B組IFN-γ含量稍高于A組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。三組IL-4含量比較差異有統(tǒng)計學意義，B組和C組中耳灌洗液IL-4含量明顯多于A組(P<0.05)，而C組IL-4濃度稍高于B組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。三組Th1 /Th2(IFN-γ/IL-4)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 各組中耳灌洗液中IFN-γ和IL-4含量及IFN-γ/IL-4比值

注：*與其他兩組比較，P<0.05

3 討論

既往研究發(fā)現(xiàn)，在抗原刺激下，中耳局部微環(huán)境中的炎癥基因過度或異常表達，嗜酸性粒細胞、肥大細胞、淋巴細胞等多種免疫細胞激活分泌細胞因子及轉(zhuǎn)錄因子參與OME的發(fā)病[9]，Th1 /Th2免疫失衡與OME中耳變應性炎癥的發(fā)病關系密切[10]。Th1和Th2細胞在不同水平可以相互調(diào)節(jié)，通過下調(diào)過度的Th2病理反應調(diào)節(jié)Th1 /Th2失衡狀態(tài)有可能成為治療變應性炎癥的重要手段。Pollock等[11]通過動物實驗研究發(fā)現(xiàn)應用可溶性IL-4受體和IL-5抗體拮抗Th2反應中的重要效應因子的作用，可明顯改善變態(tài)反應導致的咽鼓管功能障礙，并減輕中耳和咽鼓管炎癥反應。孫榮等[12]發(fā)現(xiàn)卡介苗注射后能扭轉(zhuǎn)OME動物模型中Ⅰ型變態(tài)反應的發(fā)生發(fā)展，其機制可能為卡介苗增強Th1型反應進而抑制過度的Th2反應，調(diào)節(jié)了Th1 /Th2失衡狀態(tài)。

IL-18是IFN-γ 產(chǎn)生的主要誘導因子之一， 主要由T細胞、NK細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞分泌的一種多功能細胞因子，既能促進先天性免疫又能促進Th1 /Th2免疫反應的調(diào)控[5]。研究發(fā)現(xiàn)IL-18 可單獨或者通過與IL-12 協(xié)同作用于Th1 細胞[13],通過誘導IFN-γ的產(chǎn)生，上調(diào)Th1型免疫應答, 進而抑制Th2細胞的增殖，減少Th2炎性介質(zhì)(尤其是IL-4、IL-5)的釋放，進一步抑制IgE的產(chǎn)生和嗜酸性粒細胞的聚集，逆轉(zhuǎn)變應性炎癥的Th1 /Th2免疫偏極化，從而在氣道變應性反應的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的保護作用[13，14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠OME模型抗原致敏和激發(fā)階段應用IL-18注射后，IL-18注射組大鼠中耳灌洗液中IFN-γ含量明顯高于OME組和正常對照組，說明IL-18作為IFN-γ誘導因子，可通過刺激OME大鼠中耳灌洗液中中性粒細胞、T細胞等效應細胞，大量合成IFN-γ，顯著上調(diào)Th1反應，與其在呼吸道中的作用相似[14，15]。但是，IL-18注射組中耳IL-4蛋白含量并未顯著下調(diào)，反而稍高于OME組，且IL-18注射組和OME組中耳IL-4濃度均明顯高于正常對照組；光鏡觀察發(fā)現(xiàn)IL-18注射組大鼠中耳黏膜下層可見中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等炎性細胞募集，中耳黏膜下層及骨髓腔中中性粒細胞數(shù)量較OME組顯著增多，嗜酸粒細胞雖較OME組有所減少但仍明顯多于正常對照組。上述結(jié)果與張惠蘭[7]、陳湘琦等[15]的研究發(fā)現(xiàn)IL-18可抑制哮喘小鼠氣道中的漿細胞和嗜酸性粒細胞浸潤，改善過度Th2反應，在氣道炎癥中發(fā)揮保護作用有所不同。

Nakanishi等[16]提出, IL-18對Th1 /Th2免疫反應具有雙重作用：一方面通過IFN-γ依賴途徑強化Th1反應；另一方面，在一定條件下IL-18 具有激活NF-κB途徑啟動Th2細胞分化及分泌Th2 細胞因子( IL-4、IL-13 和GM-CSF等) 的潛能，還能通過非IL-4 依賴途徑上調(diào)特異性IgE 生成[17]。同時IL-18上調(diào)NK細胞毒性和影響FasL/Fas介導的細胞凋亡過程[18]，從而加重氣道上皮細胞和組織的損傷，與哮喘和變應性鼻炎等呼吸道變應性炎癥的持續(xù)存在有關[19～21]。本研究結(jié)果也表明IL-18作為一種具有多重效應的生物因子，可刺激OME大鼠中耳微環(huán)境中IFN-γ大量合成，顯著上調(diào)Th1反應；同時，持續(xù)維系以IL-4過量分泌為特征的Th2極化反應，從而發(fā)揮對Th1 /Th2免疫反應雙重調(diào)節(jié)作用，參與OME大鼠中耳變應性炎癥過程。此外，推測通過影響程序化的細胞凋亡過程，維持以Th細胞為主的多種免疫細胞過度活化，多種促炎因子過度分泌的免疫紊亂狀態(tài)，最終導致OME大鼠中耳粘膜上皮系統(tǒng)持續(xù)損傷，是IL-18在OME病理反應中的另一種潛在機制。因此，深入分析IL-18與OME的關系，不斷發(fā)現(xiàn)IL-18在OME免疫反應中獨特的調(diào)節(jié)作用及內(nèi)在機制，將會為OME的診斷和治療提供新的靶點。

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