王永華 王一鳴 沈曉麗 韓明訓(xùn)

自由基作為機體新陳代謝的正常副產(chǎn)物，產(chǎn)生在體內(nèi)所有細(xì)胞中，并且可被各種防御體系滅活，使之維持在正常的水平。但是某些病理因素能導(dǎo)致自由基生成過多，從而對機體造成損傷。研究證明川芎(tetramethylpyrazine,TMP)能明顯增加豚鼠耳蝸血流，具有減輕慶大霉素(GM)的耳毒性作用[1，2]。因此本實驗擬通過檢測慶大霉素致聾豚鼠耳蝸組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，結(jié)合聽性腦干反應(yīng)(ABR)檢測，觀察川芎對急性藥物性聾豚鼠耳蝸內(nèi)氧自由基生成的影響，以探討TMP對急性藥物性聾的干預(yù)作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 耳廓反射正常的健康豚鼠60只，體重250～350 g, 雌雄不限，隨機分成4組，正常對照組10只，TMP組10只，慶大霉素組(GM組)20只，GM+TMP組20只。所有動物由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。GM組每日腹腔注射硫酸慶大霉素120 mg/kg(天津藥業(yè)焦作有限公司，批號：06012122)；TMP組每日腹腔注射鹽酸川芎嗪40 mg/kg(北京市燕京制藥廠，批號：050701)；GM+TMP組同時注射硫酸慶大霉素和鹽酸川芎嗪，劑量分別同GM組和TMP組；正常對照組則每日腹腔注射等量生理鹽水。均連續(xù)用藥10天，每日一次，用藥期間每天監(jiān)測體重以調(diào)整藥量。

1.2ABR檢測 各組動物于用藥前及停藥后第1天分別在隔音屏蔽室內(nèi)進行ABR測試。豚鼠用戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉后，記錄電極置顱頂正中，參考電極及接地電極分別置于給聲耳及對側(cè)耳后乳突皮下。采用ZEP誘發(fā)電位儀(北京中科電器高技術(shù)公司)，帶通濾波為100～3 000 Hz，短聲(click)刺激，疊加512次，掃描時程10 ms，TDH-39型耳機輸出，重復(fù)率10次/秒，距離豚鼠耳道口0.5 cm，以能夠波Ⅲ的最小刺激聲強確定反應(yīng)閾。

1.3耳蝸組織MDA含量測定 各組豚鼠停藥后第一天完成ABR測試后，迅速斷頭處死取出聽泡，蝸頂刺穿，雙側(cè)耳蝸合為一份標(biāo)本制成勻漿，4 000 r/min離心10 min，取上清液-20 ℃凍存。采用南京建成生物研究所的MDA測定試劑盒，按說明進行操作。將實驗試管中試劑及樣本用旋渦混勻器混勻，然后用保鮮薄膜將試管口扎緊，用針頭刺一小孔，95 ℃水浴40 分鐘，取出后流水冷卻，然后3 500～4 000 r/min，離心10分鐘，取上清，532 nm 處，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度值。計算MDA的含量，單位用nmol/mg prot表示。

1.4T-SOD、SOD1、SOD2活性檢測 動物細(xì)胞內(nèi)含有兩種SOD，即銅鋅-SOD(SOD1)與錳-SOD(SOD2)，兩者相加等于T-SOD，經(jīng)樣本前處理過的樣本中SOD2活力喪失，但SOD1活性不變。取耳蝸樣本稱重，以1 g：1 000 ml生理鹽水稀釋研磨，制成5%組織勻漿4 000轉(zhuǎn)離心15分鐘，取上清30 Ul,采用南京建成生物研究所的SOD測定試劑盒，按說明書加入試劑，37 ℃恒溫水浴40分鐘后加入顯色劑，靜置10分鐘，用分光光度儀550 nm下測吸光度，計算各SOD含量，SOD活力單位用U/mg prot表示。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，自身前后ABR反應(yīng)閾比較應(yīng)用配對t檢驗；組間比較采用單因素ANOVA分析，多個樣本均數(shù)的兩兩比較采用q檢驗。

2 結(jié)果

2.1各組豚鼠ABR反應(yīng)閾 各組豚鼠用藥前后ABR反應(yīng)閾見表1，四組動物用藥前ABR反應(yīng)閾差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；用藥10天后GM組ABR反應(yīng)閾明顯升高，與用藥前及對照組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明慶大霉素耳毒性致聾動物模型造模成功；用藥后GM+TMP組ABR反應(yīng)閾較GM組明顯降低(P<0.05)。

表1 各組豚鼠用藥前后ABR閾值比較

注：▲與同組用藥前比較，P<0.01；△與正常對照組比較，P<0.01；*與GM組比較，P<0.01

2.2各組豚鼠耳蝸組織MDA含量 給藥10天后，GM組耳蝸組織中MDA含量顯著升高，與正常對照組、GM+TMP組、TMP組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。GM+TMP組、TMP組與正常對照組之間耳蝸MDA含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

2.3各組豚鼠耳蝸SOD、SOD1、SOD2含量 給藥10天后，GM+TMP組與TMP組耳蝸組織中T-SOD活性明顯高于GM組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，GM組T-SOD活性低于對照組(P<0.05)。GM組耳蝸組織中SOD1活性明顯下降，且與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，GM+TMP組耳蝸組織中SOD1、SOD2活性明顯高于GM組(P<0.05)(表2)。

表2 各組豚鼠耳蝸組織中MDA含量及T-SOD、SOD1、SOD2活性比較

注：△與正常對照組相比，P<0.05；*與GM組相比，P<0.05

3 討論

氨基糖苷類藥物致聾的主要原因之一是耳蝸毛細(xì)胞的喪失，其致聾機理之一是耳蝸細(xì)胞內(nèi)氧自由基的過量產(chǎn)生，通過改變細(xì)胞膜的通透性，損傷細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡和死亡[3，4]。SODs是體內(nèi)最主要和最常見的抗氧化系統(tǒng)，包括SOD1、SOD2、SOD3，SOD可歧化超氧陰離子自由基生成過氧化氫，從而消除超氧陰離子自由基的毒性及對生物膜的降解，保護細(xì)胞免受傷害。因此，SOD活性的高低可間接反映機體清除氧自由基的能力。

有研究發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)用慶大霉素等氨基糖苷類抗生素后，內(nèi)耳血流減少及隨后的再灌注損傷，基底膜過度振動導(dǎo)致局部組織機械損傷，這些過程中均有大量自由基產(chǎn)生，清除自由基的酶及其代謝產(chǎn)物的消耗，均可誘導(dǎo)耳蝸毛細(xì)胞的凋亡[5]。本研究結(jié)果顯示，單獨注射GM 10天后，豚鼠ABR反應(yīng)閾明顯升高，豚鼠耳蝸組織中T-SOD、SOD1活性均低于正常(P<0.05)，表明機體清除自由基的能力下降，氧自由基含量增多；氧自由基及其派生物可攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，導(dǎo)致代謝產(chǎn)物MDA含量的明顯升高(P<0.05)，這表明氧自由基增多及其引發(fā)的脂質(zhì)氧化參與了GM的毒性作用。

川芎嗪是中藥川芎的有效成分，化學(xué)結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪(TMP),可通過血液、耳蝸外淋巴液及腦脊液3種途徑直接作用于耳蝸和聽神經(jīng)[6]。藥理研究證實[7]，川芎具有抑制自由基產(chǎn)生、提高內(nèi)源性超氧化物歧化酶活性、清除自由基、改善血液流變學(xué)、抗脂質(zhì)過氧化作用等藥理作用。本實驗中GM和川芎嗪聯(lián)合使用10天后，豚鼠ABR反應(yīng)閾較GM組明顯降低(P<0.01)，SOD1、SOD2活力明顯增強(P<0.05)，MDA的含量顯著減少(P<0.05),充分說明TMP能有效提高SOD的活力，減少脂質(zhì)過氧化物及終產(chǎn)物MDA的生成，保護耳蝸組織免受GM的毒性破壞。另外，目前研究認(rèn)為[8,9]Bcl-2定位于線粒體，而Bax定位于胞質(zhì)，死亡信號啟動后Bax從胞質(zhì)易位到線粒體膜上與Bcl一2形成異源二聚體或自身形成同源二聚體。當(dāng)線粒體膜上Bcl一2家族同源二聚體多于異源二聚體時，線粒體膜通透性孔道開放并釋放相應(yīng)物質(zhì)，激發(fā)線粒體途徑促使細(xì)胞凋亡或壞死。因此有作者認(rèn)為Bcl一2具有抗氧化作用并可通過抑制活性氧形成而抑制細(xì)胞凋亡[6]。前期研究也發(fā)現(xiàn)，針刺加川芎可通過抑制 Bax蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白表達(dá)，從而達(dá)到對耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用[2]。因此推測，TMP能夠通過降低MDA 含量，增強Bcl一2的表達(dá)，從而提高SOD活性，抑制自由基的產(chǎn)生，以對抗氨基糖苷類藥物對耳蝸造成的損傷。

綜上所述，TMP可通過提高耳蝸組織內(nèi)SOD的活力，以防止脂質(zhì)過氧化，從而減輕急性氨基糖苷類藥物的耳毒性，但TMP是否有直接的氧自由基清除作用及SOD活性的變化是否源于上游因子調(diào)控，仍需進一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

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2 王永華,劉金洪,王楓,等. 針刺及川芎嗪對慶大霉素致耳聾豚鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡及調(diào)控基因Bcl-2、Bax表達(dá)的影響[J] .中國中西醫(yī)結(jié)合耳鼻咽喉科雜志,2007,15:321.

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