梁剛柱，張福先，劉勇

·實(shí)驗(yàn)研究Experimental research·

辛伐他汀對(duì)兔股動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜增生和平滑肌細(xì)胞增殖的影響

梁剛柱，張福先，劉勇

目的評(píng)價(jià)辛伐他汀對(duì)兔股動(dòng)脈球囊損傷后血管狹窄和平滑肌細(xì)胞增殖的影響。方法將24只雄性新西蘭兔隨機(jī)分為假手術(shù)組、動(dòng)脈狹窄模型組和辛伐他汀組，每組8只。除假手術(shù)組外，其余兩組行股動(dòng)脈球囊損傷，辛伐他汀組給予辛伐他汀灌胃干預(yù)。術(shù)后第14天處死實(shí)驗(yàn)兔，取出血管標(biāo)本，處理后行HE染色觀察組織病理變化。計(jì)算機(jī)病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)量動(dòng)脈管腔、內(nèi)彈力層、外彈力層圍繞面積，計(jì)算內(nèi)膜、中膜面積和內(nèi)膜/中膜面積比值，免疫組化法檢測(cè)動(dòng)脈壁增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）表達(dá)，觀察平滑肌細(xì)胞增殖情況。結(jié)果與動(dòng)脈狹窄模型組相比，辛伐他汀組血管管腔面積增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.057），新生內(nèi)膜面積顯著減少（P=0.006），內(nèi)膜/中膜面積比值降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.16），血管壁PCNA的陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)顯著降低（P=0.003）。結(jié)論辛伐他汀可以顯著抑制兔股動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜增生和平滑肌細(xì)胞增殖。

股動(dòng)脈；球囊損傷；辛伐他汀；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

目前，經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)（percutaneous transluminal angioplasty，PTA）是治療外周動(dòng)脈硬化閉塞癥（peripheral arterial occlusive disease，PAOD）的有效方法。但是術(shù)后管腔再狹窄影響了其遠(yuǎn)期療效，有報(bào)道顯示下肢動(dòng)脈PTA術(shù)后1年再狹窄率達(dá)40%～60%［1-2］。PTA后血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和脫落，誘發(fā)血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）大量增殖并向內(nèi)膜遷移引起內(nèi)膜增生以及血管重構(gòu)，是PTA術(shù)后再狹窄的主要病理機(jī)制［3］。既往研究表明他汀類藥物在動(dòng)脈系統(tǒng)中有不依賴其降脂作用的促動(dòng)脈內(nèi)皮修復(fù)和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、預(yù)防動(dòng)脈血栓形成的作用［4-5］，但對(duì)他汀類藥物在預(yù)防外周動(dòng)脈PTA術(shù)后再狹窄的作用研究較少［6］。我們通過(guò)建立兔股動(dòng)脈球囊損傷模型，觀察辛伐他汀對(duì)該模型血管管腔狹窄程度、內(nèi)膜增生程度以及VSMC增殖的影響，探討其在防止PTA術(shù)后血管再狹窄形成中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選用體重2.5～3.5 kg的雄性新西蘭兔24只（購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），分籠飼養(yǎng)。將24只兔隨機(jī)分為假手術(shù)組、動(dòng)脈狹窄模型組和辛伐他汀組，每組8只。辛伐他汀組給予辛伐他汀粉劑與蒸餾水配成的溶液，以3 mg·kg-1·d-1灌胃，假手術(shù)組和模型組給予等量蒸餾水灌胃。三組均喂養(yǎng)至2周末取材。

1.2 建立血管損傷動(dòng)物模型

用5%戊巴比妥鈉（30mg/kg）耳緣靜脈麻醉后，解剖暴露兔右側(cè)股動(dòng)脈遠(yuǎn)端達(dá)腘動(dòng)脈，在腘動(dòng)脈遠(yuǎn)端結(jié)扎，阻斷近端，之間作一長(zhǎng)約0.5 cm的切口，向近端送入3 F Forgarty球囊導(dǎo)管達(dá)髂動(dòng)脈，深入約10 cm，向球囊內(nèi)注入生理鹽水，維持壓力，緩慢回拉球囊至平切口處，回抽球囊內(nèi)液體維持負(fù)壓，再將導(dǎo)管送至原處，重復(fù)上述過(guò)程5次，使血管內(nèi)皮充分剝脫。退出導(dǎo)管，縫合切口。術(shù)后每天肌注青霉素80萬(wàn)u，連續(xù)3 d。假手術(shù)組不插入球囊，余步驟同上。

1.3 檢測(cè)方法

于術(shù)后第14天處死動(dòng)物，小心取出模型段血管（球囊損傷的股動(dòng)脈全程），迅速置于4%多聚甲醛中固定，然后取材，逐級(jí)脫水、石蠟包埋。

1.3.1 血管管腔病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)將石蠟包埋標(biāo)本5μm厚切片用蘇木精-伊紅（HE）染色后攝像，用MiE V2.0圖像分析系統(tǒng)分別測(cè)量管腔面積、內(nèi)彈力層圍繞面積和外彈力層圍繞面積，以毫米2（mm2）表示。通過(guò)以上測(cè)定結(jié)果，計(jì)算新生內(nèi)膜面積、中膜面積以及新生內(nèi)膜/中膜面積比值，每次測(cè)量3次，取平均值。具體計(jì)算方法如下：新生內(nèi)膜面積=內(nèi)彈力層圍繞面積-管腔面積；中膜面積=外彈力層圍繞面積-內(nèi)彈力層圍繞面積；新生內(nèi)膜/中膜面積比值=新生內(nèi)膜面積/中膜面積。

1.3.2 免疫組化檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）表達(dá)將石蠟包埋標(biāo)本于不同切面切3張5μm厚切片，置于載玻片（均經(jīng)APES防脫片處理）上，抗PCNA抗體為I抗，陽(yáng)性對(duì)照用人乳腺癌切片，陰性對(duì)照用PBS緩沖液代替I抗，進(jìn)行免疫組化染色。PCNA表達(dá)評(píng)定方法：PCNA陽(yáng)性細(xì)胞的胞核染成棕黃色，高倍鏡（200倍）采集圖像，利用圖文分析系統(tǒng)隨機(jī)測(cè)量每張切片中3個(gè)視野，計(jì)數(shù)內(nèi)膜細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算PCNA陽(yáng)性細(xì)胞百分率，取其均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 三組血管管腔形態(tài)、面積比較

光鏡下，假手術(shù)組右側(cè)股動(dòng)脈內(nèi)彈力層內(nèi)側(cè)為一層藍(lán)染的內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋，內(nèi)彈力層完整，呈卷曲“城墻狀”，動(dòng)脈壁各層結(jié)構(gòu)完整，中膜VSMC呈梭型，排列整齊，分布均勻，外彈力層完整。動(dòng)脈狹窄模型組內(nèi)膜增生嚴(yán)重，向腔內(nèi)呈丘狀隆起，可見(jiàn)大量VSMC排列紊亂，內(nèi)彈力層輕度拉伸，形態(tài)不規(guī)則。與動(dòng)脈狹窄模型組相比，辛伐他汀組內(nèi)膜增生程度較輕，管腔較光滑，內(nèi)膜中VSMC均較少，見(jiàn)圖1。

與動(dòng)脈狹窄模型組相比，辛伐他汀組血管管腔面積增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.057，表1）。

與動(dòng)脈狹窄模型組相比，辛伐他汀組血管管腔面積、內(nèi)彈力層圍繞面積和外彈力層圍繞面積無(wú)明顯增加（表1）。

與動(dòng)脈狹窄模型組相比，辛伐他汀組新生內(nèi)膜面積減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.006），內(nèi)膜/中膜面積比值減小，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.16），見(jiàn)表1。

2.2 免疫組化染色形態(tài)學(xué)觀察PCNA表達(dá)

圖1 三組血管管腔形態(tài)（HE，×200）

表1 三組血管管腔面積、內(nèi)/外彈力層圍繞面積、新生內(nèi)膜面積、中膜面積、內(nèi)膜/中膜面積比值比較（±s）

表1 三組血管管腔面積、內(nèi)/外彈力層圍繞面積、新生內(nèi)膜面積、中膜面積、內(nèi)膜/中膜面積比值比較（±s）

與動(dòng)脈狹窄模型組比較，aP＜0.05

組別管腔面積（mm2）內(nèi)彈力層圍繞面積（mm2）外彈力層圍繞面積（mm2）新生內(nèi)膜面積（mm2）中膜面積（mm2）內(nèi)膜/中膜面積比值假手術(shù)組（n=8）1.06±0.16 1.06±0.16 1.69±0.14-0.63±0.1-動(dòng)脈狹窄模型組（n=8）0.58±0.12 1.09±0.13 1.75±0.15 0.51±0.06 0.66±0.08 0.78±0.11辛伐他汀組（n=8）0.73±0.17 1.08±0.15 1.71±0.14 0.35±0.13a0.63±0.15 0.63±0.41

鏡下觀察，PCNA陽(yáng)性細(xì)胞的胞核染成棕黃色。正常動(dòng)脈管壁PCNA表達(dá)極少或無(wú)表達(dá)。各實(shí)驗(yàn)組PCNA陽(yáng)性細(xì)胞主要聚集在新生內(nèi)膜，中膜表達(dá)極少或無(wú)表達(dá)。

2.2.1 PCNA陽(yáng)性指數(shù)比較與假手術(shù)組相比，動(dòng)脈狹窄模型組與辛伐他汀組新生內(nèi)膜中VSMC細(xì)胞有不同程度的PCNA表達(dá)，辛伐他汀組PCNA陽(yáng)性細(xì)胞指數(shù)（17.25±6.88）小于動(dòng)脈狹窄模型組（33.78±7.87），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003），見(jiàn)圖2。

圖2 三組PCNA表達(dá)（免疫組化，×200）

3 討論

目前，抗血小板藥物是預(yù)防PTA術(shù)后再狹窄的主要手段，其機(jī)制在于抗血小板藥物可以抑制血小板活化引起的內(nèi)膜增生，ACCP指南第9版推薦外周動(dòng)脈PTA術(shù)后長(zhǎng)期使用阿司匹林或氯吡格雷預(yù)防再狹窄［7］。雖然，抗血小板藥物可以降低再狹窄的發(fā)生，但是再狹窄依然是制約PTA治療效果的瓶頸。PTA術(shù)后再狹窄的機(jī)制復(fù)雜，涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、VSMC增殖和遷移及血管重構(gòu)等多個(gè)方面。在血管損傷局部，活化的血小板、炎性細(xì)胞產(chǎn)生很多促細(xì)胞分裂劑和細(xì)胞因子，刺激中膜VSMC增殖、遷移及表型轉(zhuǎn)變，分泌細(xì)胞外基質(zhì)，膠原沉積，導(dǎo)致內(nèi)膜增生，發(fā)生管腔再狹窄［3］。

既往研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物除降低血膽固醇外，還具有抗炎、改善內(nèi)皮功能及舒張血管降壓、抑制血管平滑肌的遷移和增生、抑制血小板聚集及抗凝等作用［4-5，8-10］，提示其在預(yù)防PTA術(shù)后再狹窄中有潛在的應(yīng)用前景。Kappert等［11］發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可以增加大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后血管腔面積，但是新生內(nèi)膜面積、內(nèi)膜/中膜面積比值與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。van der Harst等［12］在大鼠主動(dòng)脈內(nèi)植入支架，喂養(yǎng)瑞舒伐他汀的實(shí)驗(yàn)組大鼠主動(dòng)脈新生內(nèi)膜面積較對(duì)照組減少23%［（0.66±0.06）mm2比（0.51±0.02）mm2，P＜0.05］，并證實(shí)其機(jī)制與瑞舒伐他汀保護(hù)內(nèi)皮功能有關(guān)。Preusch等［13］從PTA術(shù)后血管重構(gòu)角度研究他汀類藥物在抑制內(nèi)膜增生中的作用，發(fā)現(xiàn)在球囊擴(kuò)張損傷頸動(dòng)脈大鼠模型中瑞舒伐他汀可以顯著抑制內(nèi)膜增生，但該機(jī)制與瑞舒伐他汀對(duì)細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達(dá)的影響無(wú)關(guān)。翟國(guó)君等［14］發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物可以減少犬靜脈人工血管橋內(nèi)膜增生。Lin等［15］研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可以抑制兔腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素-18的表達(dá)，抑制兔主動(dòng)脈VSMC增殖。Janardhanan等［16］研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可以降低動(dòng)靜脈瘺術(shù)后血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A（VEGF-A）和MMP-9的基因表達(dá)，抑制血管內(nèi)膜增生和血管重構(gòu)。趙鋼等［17］研究發(fā)現(xiàn)，載有他汀類藥物的納米粒子涂層支架可抑制支架內(nèi)再狹窄。以上研究提示他汀類藥物確實(shí)可以抑制PTA術(shù)后的內(nèi)膜增生，其機(jī)制涉及內(nèi)皮功能的保護(hù)、抑制血管重構(gòu)、抑制VSMC增殖等內(nèi)膜增生的多個(gè)環(huán)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)球囊損傷血管后，動(dòng)脈狹窄模型組內(nèi)膜增生明顯，給予辛伐他汀干預(yù)后，新生內(nèi)膜面積明顯減少，提示辛伐他汀可有效抑制球囊損傷后VSMC增殖和內(nèi)膜增生。本研究從VSMC增殖角度研究其相關(guān)機(jī)制，選用PCNA的表達(dá)觀察VSMC增殖情況。PCNA的高表達(dá)提示細(xì)胞內(nèi)DNA合成反應(yīng)旺盛，是S期細(xì)胞的良好標(biāo)志物，是評(píng)價(jià)細(xì)胞增生的良好指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈狹窄模型組新生內(nèi)膜VSMC中PCNA呈高表達(dá)，而辛伐他汀組中PCNA陽(yáng)性指數(shù)減少，提示他汀類藥物可以通過(guò)抑制VSMC增殖抑制PTA術(shù)后的內(nèi)膜增生。本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)了目前常用的兔頸動(dòng)脈球囊損傷模型，采用兔股動(dòng)脈球囊損傷狹窄模型，在球囊損傷股動(dòng)脈全程后，結(jié)扎腘動(dòng)脈，其流出道由隱動(dòng)脈代償，臨床上更接近于下肢動(dòng)脈病變流出道少的特點(diǎn)。

本研究結(jié)果證實(shí)他汀類藥物可以抑制兔股動(dòng)脈球囊損傷后的VSMC增殖和內(nèi)膜增生，提示他汀類藥物對(duì)于下肢動(dòng)脈PTA術(shù)后再狹窄的防治具有潛在的臨床應(yīng)用前景，但其在預(yù)防外周動(dòng)脈PTA術(shù)后再狹窄中的具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

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The effects of sim vastatin on in timal hyperp lasia and vascular smooth m uscle cell proliferation of balloon-injured fem oral ar tery in experimental rabbits

LIANG Gang-zhu，ZHANG Fu-xian，LIU Yong. Department of Vascular Surgery，Beijing Shijitan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100038，China

ZHANG Fu-xian，E-mail：zhangfuxian@yahoo.com

ObjectiveTo evaluate the effects of simvastatin on vascular stenosis and vascular smooth muscle cell（VSMC）proliferation of balloon-injured femoral artery in experimental rabbits.MethodsA total of 24 male New Zealand white rabbits were random ly and equally divided into three groups：the sham group（n=8），the artery stenosismodel group（n=8）and the simvastatin group（n=8）.Femoral artery stenosis was induced by injurieswith balloon in both themodel group and the simvastatin group，except for the sham group.The rabbits in simvastatin group were fed with simvastatin.The rabbitswere sacrificed on the 14th day after operation，and the femoral arteries were removed and sent for the pathological exam ination.The internal elastic lamina，external elastic lamina and luminal areasweremeasured.Then the areas of intima，media and the intima-to-media ratio were calculated.In order to observe the proliferation of VSMC，proliferating cell nuclear antigen（PCNA）expression of arterialwallwas tested and observed by immunohistochemistrymethod. Results In comparison with the model group，the average luminal area of the simvastatin group was increased although the differencewas not statistically significant（P=0.057）.The area of intima of simvastatin group was decreased（P=0.006），and the intima-to-media ratio was notably decreased，but the difference was of no statistic significance（P=0.16）.The PCNA expression of arterial wall was remarkably decreased（P=0.003）.ConclusionSimvastatin can effectively inhibit the intimal hyperplasia and the vascular smooth muscle cell proliferation of balloon-injured femoral artery in experimental rabbits.（J Intervent Radiol，2014，23：50-53）

femoral artery；balloon injury；simvastatin；animal experiment

R543.5

B

1008-794X（2014）-01-0050-04

2013-07-02）

（本文編輯：侯虹魯）

10.3969/j.issn.1008-794X.2014.01.014

100038北京首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院血管外科（梁剛柱、張福先），超聲科（劉勇）

張福先E-mail：zhangfuxian@yahoo.com