錢 亭， 陳茂振， 高 峰， 尹化斌

VX2肝癌模型已廣泛應(yīng)用于介入治療的實(shí)驗(yàn)研究，其造模方法有多種，常用的有開腹包埋及穿刺種植兩種［1］。本實(shí)驗(yàn)對兩種建模方法進(jìn)行比較，篩選簡單、有效的模型制作方法，并探討其影像學(xué)表現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

新西蘭白兔40只，雌雄不限，體重2.0～3.0 kg，購自上海國睿生命科技有限公司。荷瘤兔由上海市第九人民醫(yī)院提供。將動(dòng)物隨機(jī)分成A、B兩組，每組20只。A組采用開腹包埋植入VX2瘤塊，B組采用CT引導(dǎo)下穿刺種植VX2瘤塊。

1.2 VX2瘤株的制備

采用鹽酸氯胺酮 （福建古田藥業(yè)有限公司）∶陸眠寧Ⅱ（1.5 ml∶30 mg，吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司）1∶1混合液（0.2～0.3 ml/kg）肌肉注射麻醉荷瘤兔，常規(guī)備皮、消毒、鋪洞巾，于兔后肢外側(cè)逐層分離至肌肉，完整剝離出腫瘤組織，放入盛有少量生理鹽水的換藥碗中。用生理鹽水沖洗瘤塊3～4次，剪去多余的筋膜、肌肉組織及瘤塊內(nèi)壞死組織，隨后放入另一無菌換藥碗內(nèi)，倒入少量生理鹽水，將瘤塊剪成1～2 mm3小塊備用。

1.3 兔VX2肝癌模型的建立

VX2肝癌模型制備前，所有實(shí)驗(yàn)兔禁食12 h，鹽酸氯胺酮：陸眠寧Ⅱ1∶1混合液 （0.2～0.3 ml/kg）肌肉注射麻醉。

1.3.1 開腹包埋植入VX2瘤塊 A組兔取仰臥位，四肢固定于手術(shù)臺(tái)上。上腹部常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，于劍突下偏左2 cm處沿肋間隙開腹2～3 cm，暴露肝左葉，在較厚處用穿刺針尖沿肝門方向插入肝實(shí)質(zhì)內(nèi)做成深約1 cm切口，取2塊組織塊植入，壓迫止血，確認(rèn)無活動(dòng)性出血后逐層縫合。術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素40萬u，連續(xù)3 d。

1.3.2 CT引導(dǎo)下穿刺種植VX2瘤塊 B組兔仰臥位固定于CT檢查床上（自制相關(guān)簡易工具），根據(jù)CT平掃確定進(jìn)針位置及深度，明確接種位置 （均選用肝左葉）。接種時(shí)，用細(xì)針尖（5 ml注射器針尖折斷制成）在皮膚上定位，再用18 G穿刺針（NIPRO）經(jīng)皮肋間穿刺至肝左外葉，深度約10 mm，拔出針芯，注意有無出血，用眼科剪夾取2塊瘤組織塞入鞘內(nèi)，再用穿刺針將瘤塊推入肝實(shí)質(zhì)內(nèi)，需多次重復(fù)推注針芯，確定所取瘤塊均接種于肝左葉，見圖1。

圖1 CT引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺瘤塊植入

1.4 影像學(xué)檢查

1.4.1 CT檢查 兩組實(shí)驗(yàn)兔均于術(shù)后2周行16排螺旋 CT 檢查（LightSpeed，GE），掃描前禁食 12 h，全麻后將實(shí)驗(yàn)兔固定于自制檢查板上。仰臥位，頭先進(jìn)。平掃的掃描參數(shù)為：120 kV，200 mA，F(xiàn)OV 20，Pitch 1.375，層厚 5 mm，1.25 薄層重建；增強(qiáng)掃描：采用耳緣靜脈高壓團(tuán)注方式，對比劑為碘佛醇注射液（加拿大），劑量為2 ml/kg，注入速度為1 ml/s，分別于注入對比劑后12、25、50及150 s時(shí)行動(dòng)脈早期、動(dòng)脈晚期、門脈期及延遲期掃描。

1.4.2 DSA血管造影 實(shí)驗(yàn)兔全麻，備皮，仰臥位固定，腹股溝區(qū)常規(guī)消毒、鋪巾，觸摸右側(cè)股動(dòng)脈搏動(dòng)最強(qiáng)處，經(jīng)右側(cè)腹股溝下方沿股動(dòng)脈搏動(dòng)處做與股動(dòng)脈走行一致的長約4 cm的手術(shù)切口，分離和暴露股動(dòng)脈約2 cm。在已分離的股動(dòng)脈遠(yuǎn)端和近端分別放置2條3.0絲線，先把動(dòng)脈遠(yuǎn)端用絲線結(jié)扎，然后提起近端絲線使兩絲線間的股動(dòng)脈充盈，用20 G穿刺針穿刺股動(dòng)脈，利用微導(dǎo)絲引導(dǎo)微導(dǎo)管插管［2］，在透視情況下將微導(dǎo)管選擇性插入腹腔干，推注碘化油注射液（法國加柏公司）約1 ml造影，然后超選擇性插入肝左動(dòng)脈，再次推注對比劑造影，以確定微導(dǎo)管的位置及腫瘤血供情況。術(shù)后拔除導(dǎo)管，同時(shí)結(jié)扎股動(dòng)脈近端，縫合包扎切口。

1.5 觀察指標(biāo)

記錄兩組實(shí)驗(yàn)兔種植所需時(shí)間、術(shù)后感染及死亡情況，2周后根據(jù)CT和DSA圖像記錄兩組肝內(nèi)、外成瘤情況、腫瘤體積（CT增強(qiáng)分別測得腫瘤的最大層面長徑L，與L垂直的最寬徑W，用公式：V=L × W2/2）［3］，觀察有無腹腔種植性轉(zhuǎn)移及腹腔積液，并比較術(shù)前、術(shù)后實(shí)驗(yàn)兔體重變化情況。觀察腫瘤在不同影像學(xué)檢查中的表現(xiàn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用Fisher檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型制備情況

A組中4只于術(shù)后3 d死亡，2只經(jīng)CT檢查均未見肝內(nèi)、肝外成瘤，10只肝內(nèi)成瘤，2只腹壁浸潤，2只腹腔種植性轉(zhuǎn)移并見腹腔積液（圖2a）。B組2周內(nèi)未見死亡，2只經(jīng)CT檢查均未見肝內(nèi)、肝外成瘤，17只肝內(nèi)成瘤，1只腹壁浸潤（圖 2b），未見腹腔種植性轉(zhuǎn)移。

圖2 增強(qiáng)CT所見肝外成瘤

種植操作時(shí)間A組為（32±5）min，B組為（8±2）min，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。術(shù)后實(shí)驗(yàn)兔體重 A組為 （2.37±0.25）kg，B組為 （2.26±0.34）kg，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。 肝內(nèi)腫瘤體積 A組為 （4 739.29±530.2）mm3，B組為（4 789 ± 626.27）mm3，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。 死亡率 A 組為 20%（4/20），B 組為 0（0/20），組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.037）。肝內(nèi)成瘤率A組為 50%（10/20），B 組為 85%（17/20），組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.02）。

2.2 CT 表現(xiàn)

兩組建模成功，實(shí)驗(yàn)兔在CT上均表現(xiàn)為局灶孤立結(jié)節(jié)，CT平掃為低密度結(jié)節(jié)影，A組平掃CT值約為（42.3 ± 5.4）Hu，B 組為（45.6 ± 3.7）Hu。 增強(qiáng)掃描腫瘤周邊環(huán)形強(qiáng)化，動(dòng)脈早期、動(dòng)脈晚期、門脈期及延遲期掃描A組CT值分別為 （89.6±7.2）、（111.3 ± 6.4）、（108 ± 6.7）和（92.5 ± 9.3）Hu，B 組分別為（83.5 ± 4.7）、（120.7 ± 6.3）、（113.2 ± 3.7）和（93.2±5.8）Hu，腫瘤于增強(qiáng)動(dòng)脈早期即出現(xiàn)強(qiáng)化，動(dòng)脈晚期進(jìn)一步強(qiáng)化，門脈期與肝實(shí)質(zhì)強(qiáng)化水平一致，到延遲期對比劑部分退出，見圖3。兩組平掃及增強(qiáng)各期比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 B組各期CT增強(qiáng)掃描所見

2.3 血管造影表現(xiàn)

兩組模型兔肝動(dòng)脈造影均可見腫瘤供血?jiǎng)用}增粗，分支被腫瘤推壓形成“抱球征”，腫瘤呈環(huán)形染色（圖4）。兩組模型兔腹腔干動(dòng)脈均自T12～L1水平由腹主動(dòng)脈前壁稍偏右側(cè)發(fā)出。腹腔干造影尋找肝總動(dòng)脈，可見肝總動(dòng)脈向右水平發(fā)出胃十二指腸動(dòng)脈，向上發(fā)出肝固有動(dòng)脈。肝固有動(dòng)脈發(fā)出肝左、右葉動(dòng)脈。供血的肝動(dòng)脈增粗，顯影較濃，向腫瘤中心發(fā)出腫瘤血管，形成抱球狀腫瘤染色。其中2只實(shí)驗(yàn)兔插管造影未成功。

3 討論

3.1 兔VX2肝癌模型制備

VX2瘤株是由Shope病毒誘發(fā)的兔乳頭狀瘤衍生的鱗狀細(xì)胞癌經(jīng)70次傳代而建立的腫瘤細(xì)胞株，具有很強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移性［4］。接種2周后行相關(guān)檢查，原因?yàn)榇穗A段腫瘤生長最旺盛，體積迅速增大，切面多呈實(shí)質(zhì)性，轉(zhuǎn)移及壞死較少。此階段為腫瘤血管形成期，毛細(xì)血管大量形成，易實(shí)施介入手術(shù)。

圖4 兔肝固有動(dòng)脈動(dòng)脈造影，可見腫瘤供血豐富，瘤區(qū)呈環(huán)形染色

本實(shí)驗(yàn)中，B組操作過程簡單，操作時(shí)間明顯短于A組，成瘤率高于A組，部分原因?yàn)榭s短了瘤塊離體的時(shí)間，減少了瘤塊缺血再灌注損傷，同時(shí)降低了瘤塊感染性。A組術(shù)后4只死亡，由于手術(shù)對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物創(chuàng)傷大，術(shù)中麻醉要求高，腫瘤可沿手術(shù)切口向腹腔蔓延，且實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后免疫力下降，易發(fā)生腹腔種植性轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)A組中有2只發(fā)生腹腔轉(zhuǎn)移，而B組未見轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)中共有4只接種2周后未見肝內(nèi)及肝外腫瘤生長，考慮與瘤塊取材有關(guān)，因此取材時(shí)應(yīng)盡可能選取腫瘤邊緣生長旺盛的魚肉樣組織，盡量去除壞死及結(jié)締組織，以提高接種成功率。另一方面原因可能與實(shí)驗(yàn)兔免疫防御機(jī)制有關(guān)。

兩組實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后體重及腫瘤體積未見明顯差別，表明兩種種植方式對實(shí)驗(yàn)兔的體重及腫瘤體積無顯著影響。

CT引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺較開腹種植簡單、實(shí)用，但對操作者要求高，進(jìn)針要快且不易太淺（1.0～1.5 cm），否則組織塊易沿竇道流出或由于供血不足而生長緩慢。腫瘤組織塊注入針芯后，需多次重復(fù)推注，確定瘤塊接種于肝左葉。拔出針芯后按壓穿刺點(diǎn)30 s，防止瘤塊溢出。

3.2 CT表現(xiàn)

兩組兔VX2肝癌模型CT表現(xiàn)一致，平掃上均表現(xiàn)為低密度。增強(qiáng)檢查掃描4期，可使動(dòng)脈血管清晰顯示，利于指導(dǎo)血管造影檢查。增強(qiáng)檢查發(fā)現(xiàn)不同于人類肝細(xì)胞性肝癌“快進(jìn)快出”的強(qiáng)化特點(diǎn)［5］，表現(xiàn)為動(dòng)脈早期環(huán)形強(qiáng)化，動(dòng)脈晚期進(jìn)一步強(qiáng)化，到延遲期部分退出。

3.3 血管造影表現(xiàn)及技術(shù)要點(diǎn)

兩組實(shí)驗(yàn)兔血管造影均顯示腫瘤供血?jiǎng)用}增粗，分支被腫瘤推壓形成“抱球征”，腫瘤環(huán)形染色。其中，腹腔干動(dòng)脈多開口于T12～L1水平，應(yīng)先行腹主動(dòng)脈造影明確腹腔干動(dòng)脈開口，之后直接用導(dǎo)管頭端指向腹側(cè)稍偏右于T12～L1水平反復(fù)探尋腹腔干動(dòng)脈，可縮短手術(shù)時(shí)間及減少對比劑的用量，進(jìn)而減輕對實(shí)驗(yàn)兔腎功能的影響。行腹腔干動(dòng)脈造影時(shí)，可將球管向右側(cè)傾斜10°～15°，能較好的辨認(rèn)肝固有動(dòng)脈，肝固有動(dòng)脈迂曲纖細(xì)，微導(dǎo)管在微導(dǎo)絲配合下可進(jìn)入肝固有動(dòng)脈，但如果進(jìn)一步超選擇肝左右動(dòng)脈則較困難。如進(jìn)行血管內(nèi)介入治療，導(dǎo)管頭位于肝固有動(dòng)脈，由于腫瘤供血?jiǎng)用}較正常肝動(dòng)脈增粗且血流較快，緩慢注藥可優(yōu)先進(jìn)入腫瘤供血?jiǎng)用}。因此，介入治療時(shí)，如超選肝左動(dòng)脈困難，不可強(qiáng)行進(jìn)入，否則易引起血管痙攣、損傷，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。實(shí)驗(yàn)中2只血管造影未成功，原因可能為肝固有動(dòng)脈起源異常。其中1只實(shí)驗(yàn)兔腫瘤較小，直徑約1.2 mm，供瘤血管少而細(xì)小也是實(shí)驗(yàn)失敗的原因之一。

本實(shí)驗(yàn)通過比較開腹及穿刺植入瘤塊法，證實(shí)開腹包埋法制作動(dòng)物模型創(chuàng)傷大，動(dòng)物死亡率高，易發(fā)生腹腔種植性轉(zhuǎn)移，對手術(shù)者手術(shù)技巧要求高，同時(shí)手術(shù)切口不利于后續(xù)觀察與研究。CT引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺VX2瘤塊植入操作簡單，創(chuàng)傷小，成瘤率高，可重復(fù)性強(qiáng)，優(yōu)于開腹包埋法。VX2肝癌模型血供豐富，類似人類肝轉(zhuǎn)移癌模型，在肝癌介入治療研究中將得到越來越廣泛的應(yīng)用。

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