劉 宏王莉君

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830000；

2.新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司,新疆烏魯木齊 830000)

豬圓環(huán)病毒1型陰性PK-15細(xì)胞的單細(xì)胞克隆與鑒定

劉 宏1王莉君2

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830000；

2.新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司,新疆烏魯木齊 830000)

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）屬圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是目前為止已知的最小的動(dòng)物病毒之一。根據(jù)致病性、抗原性和核酸序列的差異，可將PCV分為PCV-1及PCV-2兩個(gè)型。PCV1為非致病性的病毒，由德國(guó)學(xué)者Tischer于1974年從多株連續(xù)傳代的PK-15細(xì)胞中最先發(fā)現(xiàn)。PCV2為致病性的病毒，來(lái)源于制備PK-15細(xì)胞的豬腎組織。豬圓環(huán)病毒對(duì)外界的抵抗力較強(qiáng)，對(duì)氯仿不敏感，不凝集豬、牛、羊、雞等動(dòng)物和人的紅細(xì)胞。研究表明，該病毒可在RK-15細(xì)胞上生長(zhǎng)，但不引起細(xì)胞病變，可在細(xì)胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)較多包涵體，少數(shù)感染的細(xì)胞還可能內(nèi)含有核內(nèi)包涵體。PCV不能在原代胎豬腎細(xì)胞、恒河猴腎細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞上生長(zhǎng)。

調(diào)查表明，PK-15細(xì)胞在被ATCC收藏后不久即檢測(cè)出PCV1，然而確切的污染來(lái)源目前尚未查清，很有可能最初的豬腎細(xì)胞PK-2a就存在PCV1，或是其他的細(xì)胞培養(yǎng)物污染導(dǎo)致。所以，國(guó)內(nèi)細(xì)胞供給實(shí)驗(yàn)室的PK-15細(xì)胞均有不同程度的PCV1污染。雖然PCV1無(wú)致病性，但由于其的存在會(huì)與PCV2發(fā)生相互污染，影響PCV2的傳代增殖，而且不利于PCV2疫苗研發(fā)及抗體檢測(cè)。綜上，有必要篩選出一株無(wú)PCV1污染的PK-15細(xì)胞。

本研究擬采用有限稀釋法篩選單細(xì)胞進(jìn)行克隆，并經(jīng)PCR檢測(cè)，逐步篩選出一株豬圓環(huán)病毒1型陰性的PK-15細(xì)胞，用于PCV2的分離與傳代培養(yǎng)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 無(wú)支原體胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶均購(gòu)自Hyclone公司公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)板（nunce）、Taq DNA Polymerase、dNTP Mix、DL2000 DNA Marker、FITC-兔抗豬IgG（二抗）、氨芐青霉素、鏈霉素均購(gòu)自寶信生物技術(shù)有限公司。PCV2陽(yáng)性血清（一抗）購(gòu)于武漢科前生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.2 細(xì)胞株 PK-15細(xì)胞，購(gòu)于武漢細(xì)胞培養(yǎng)中心。

1.1.3 引物 由于PK-15細(xì)胞起源于豬，因此細(xì)胞中存在多種豬源病毒污染。以下病毒的引物設(shè)計(jì)參見(jiàn)文獻(xiàn)[16]。引物序列具體如下：

引物名稱引物序列片段大小(bp) PCV1P1 5’-CAACTGCTGTCCCAGCTGTAG-3’1252bp P2 5’-TTCTTTATTCTGCTGGTCGG-3’1168bp P3 5’-GGTACCCGAAGGCCGATTTG-3’PCV2上游 5’-AAGGGCTGGGTTATGGTATG-3’353bp下游 5’-CGCTGGAGAAGGAAAAATGG-3’PPV上游 5’-AGGCTAACGCATGGGGAGT-3’582bp下游 5’-TGTTCCTGGGTGTTGGTCTC-3’PRV上游 5’-AGTACTCGCAGGGGCGCAACT-3’372bp下游 5’-GCCGATCTTGGTGTAGGTGT-3’CSFV上游 5’-CATTTCTTTATAGGCTCATC-3’173bp下游 5’-CTGTGGCTAATAGTGACCTAC-3’

以上引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 PK-15細(xì)胞單克隆

將PK-15細(xì)胞培養(yǎng)于細(xì)胞瓶形成細(xì)胞單層，用0.25%胰酶-EDTA消化，加入適量DMEM生長(zhǎng)液（含2%犢牛血清和1%雙抗）吹打，分散細(xì)胞成單個(gè)，加入DMEM生長(zhǎng)液（含10%犢牛血清和1%雙抗），做10倍梯度稀釋至大約20個(gè)細(xì)胞/ml，取100μl鋪于96孔板中，即2個(gè)細(xì)胞/孔。左右、上下?lián)u晃后放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h，次日鏡下觀察孔內(nèi)細(xì)胞，單個(gè)細(xì)胞的孔做好標(biāo)記。培養(yǎng)7～10d后，長(zhǎng)成單細(xì)胞克隆時(shí)，用胰酶將其消化下來(lái)，再次稀釋成單個(gè)細(xì)胞，做進(jìn)一步的亞克隆，方法同上。經(jīng)兩次亞克隆后，挑選出單細(xì)胞克隆株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。細(xì)胞進(jìn)行10次傳代，每傳代一次，進(jìn)行一次PCV檢測(cè)。最后，對(duì)PCR檢測(cè)結(jié)果為陰性的細(xì)胞克隆株命名，并將其凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PK-15中PCV1檢測(cè)

應(yīng)用半巢式PCR的方法檢測(cè)PCV，采用25μl PCR反應(yīng)體系。首先利用P1和P2引物進(jìn)行第一步PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min后，按94℃變性45s，64.5℃退火 60s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。然后，利用P2和P3引物進(jìn)行第二步PCR擴(kuò)增，以第一次PCR產(chǎn)物作為模板，除退火溫度為56℃之外，其他反應(yīng)條件與第一步PCR相同。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察結(jié)果。

1.2.3 PK-15中外源病毒檢測(cè)

我們對(duì)克隆的PK-15細(xì)胞進(jìn)行外源病毒檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：PCR反應(yīng)體系（25μl/管）：10×PCR Buffer 2.5 μl、2.5mm/l dNTPs 2 μl、DNA模板、上下游引物各0.5 μl、Taq DNA polymerase 0.25 μl、ddH2O 17.25μl。各試劑加完后，吹打均勻，瞬時(shí)離心，進(jìn)行如下反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s；（PPV 56.8℃、PRV 58℃、CFSV 55℃）退火45 s；72℃延伸2 min；共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PK-15細(xì)胞單細(xì)胞克隆與PCV1檢測(cè)

PK-15細(xì)胞（含PCV1）經(jīng)第一次有限稀釋法克隆，得到35個(gè)克隆。細(xì)胞形態(tài)良好，輪廓清晰，比克隆前的PK-15細(xì)胞在整體上要好（圖1）。經(jīng)半套式PCR檢測(cè)，27個(gè)克隆為PCV1陽(yáng)性，片段大小為1168 bp，8個(gè)克隆為PCV1陰性，沒(méi)有任何條帶（圖2-2）。說(shuō)明PK-15細(xì)胞確實(shí)受到PCV1的污染。將獲得的8株細(xì)胞進(jìn)行兩次亞克隆后，最終PCR檢測(cè)為PCV1陰性的單細(xì)胞克隆株命名為PK-15MC。

圖1 PK15細(xì)胞克隆前與克隆后72 h

另外將第一次PCR檢測(cè)為PCV1陰性的8個(gè)克隆株進(jìn)行兩次亞克隆，并進(jìn)行擴(kuò)大化培養(yǎng)10代、20代、30代。每代次的細(xì)胞均進(jìn)行PCR檢測(cè)，最終獲得3個(gè)PCV1陰性細(xì)胞克隆株，分別命名為PK-15MC1、PK-15MC2、PK-15MC3。

圖2 PK-15MC1克隆株的PCV1檢測(cè)

2.2 PK-15中外源病毒檢測(cè)

將最終獲得的PCV陰性克隆株P(guān)K-15MC1、PK-15MC2、PK-15MC3進(jìn)行外源病毒的檢測(cè)。PCR鑒定結(jié)果如下：

圖3 PK-15MC克隆株的PRV、PPV、CSFV檢測(cè)

3 討論

因?yàn)镻CV不表現(xiàn)CPE，并可長(zhǎng)期持續(xù)污染PK15細(xì)胞而不被發(fā)現(xiàn)。另外被PCV1污染的PK15細(xì)胞，在增殖培養(yǎng)PCV2時(shí)會(huì)出現(xiàn)病毒增殖速度變慢的現(xiàn)象。這給病毒的分離純化工作帶來(lái)極大不便。有研究證實(shí)，在快速生長(zhǎng)的細(xì)胞中會(huì)有少數(shù)細(xì)胞未被PCV1感染，因此可以通過(guò)軟瓊脂法、顯微操作法和有限稀釋法等多種方法進(jìn)行單細(xì)胞的篩選，獲得無(wú)PCV存在的PK-15細(xì)胞。本研究選用相對(duì)簡(jiǎn)單的有限稀釋法對(duì)PK-15細(xì)胞進(jìn)行單克隆篩選。

半套式PCR是用第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為第二次PCR擴(kuò)增的模板，并且因?yàn)榈诙蜳CR反應(yīng)中的一個(gè)引物縮進(jìn)，會(huì)使靶DNA序列得到有效的選擇性擴(kuò)增，大大提高了擴(kuò)增的特異性和靈敏性。本試驗(yàn)中在第一次克隆得到35個(gè)克隆孔中，PCR檢測(cè)有8個(gè)克隆孔為陰性，第二次亞克隆后再進(jìn)行PCR檢測(cè)，僅有3個(gè)克隆孔為陰性。這種在陰性克隆中又出現(xiàn)PCV1陽(yáng)性的原因，可能與病毒含量低半套式PCR檢測(cè)不出來(lái)有關(guān)。因此，本人將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后10代、20代、30代，在進(jìn)行PCV1檢測(cè)，此時(shí)病毒核酸數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)檢測(cè)PCR下限，有利于檢測(cè)出病毒核酸來(lái)。這樣才可以獲得穩(wěn)定的不存在PCV1的PK-15細(xì)胞。本研究將獲得的3株P(guān)CV1陰性的PK-15細(xì)胞，傳代30代次后進(jìn)行PCV1、PPV、PRV、CSFV等外源病毒檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均為陰性。PK-15陰性細(xì)胞的獲得為臨床分離和鑒定PCV和PCV相關(guān)疫苗研制等工作提供了良好的物質(zhì)保障。