朱元元，楊雙旺，邱 彥

細(xì)菌可在各種生物和非生物的表面形成生物膜，生物膜包含蛋白質(zhì)、多糖和核酸等基質(zhì)。生物膜形成是一個(gè)復(fù)雜的發(fā)展過程［1-4］，生物膜在器械相關(guān)的感染發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色。細(xì)菌生物膜的形成是院內(nèi)感染的重要來源，可導(dǎo)致導(dǎo)尿管、血管內(nèi)導(dǎo)管相關(guān)的菌血癥和呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎［5-6］。生物膜的形成使細(xì)菌避開免疫系統(tǒng)的攻擊，因?yàn)樵谏锬ぶ械募?xì)菌有基質(zhì)的保護(hù)，且細(xì)胞的代謝速度較慢，使它們能夠在高于最小抑菌濃度100～1000倍的抗生素中生存下去［7-9］。而大量使用抗生素則增加了抗生素耐藥性［10-11］，因此對(duì)新的抗菌藥物的需求日益迫切。

在幾乎所有的病原體中，鐵離子(Fe3+)在DNA合成，呼吸鏈和關(guān)鍵酶的功能和氧化應(yīng)激防御反應(yīng)中均有重要作用，是細(xì)菌生長所必需的［12］。金屬鎵的離子半徑幾乎和鐵一樣，而且許多生物都無法區(qū)分鎵離子(Ga3+)和Fe3+，因此Ga3+可用以破壞依賴Fe3+的生化反應(yīng)。體外和體內(nèi)研究表明Ga3+通過干擾Fe3+的功能，可抑制各種病原體生長［13］。

本課題組的前期研究中已制備了一種可以黏附在塑料表面的硝酸鎵聚合物［14］。本研究對(duì)此材料以硝酸鎵聚合物包被并對(duì)其抗菌活性進(jìn)行對(duì)比分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來源和培養(yǎng)［15］銅綠假單胞菌(ATCC27853)購自國家衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。銅綠假單胞菌在LB液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基由10.0 g/L的蛋白胨，5.0 g/L的酵母提取物，10.0 g/L的氯化鈉組成，pH 7.0～7.2)，37℃下振蕩培養(yǎng)24 h。收集菌種并用生理鹽水稀釋。

1.2 最小抑菌濃度的測(cè)定［14］37℃過夜培養(yǎng)的試驗(yàn)菌株用新鮮的胰蛋白酶大豆肉湯稀釋10倍。由于吸光度和細(xì)菌密度成正比，因此采用酶標(biāo)儀測(cè)其在600 nm處的吸光度(OD值)作為相對(duì)定量，并以此代表細(xì)菌的生長程度。37℃下培養(yǎng)試驗(yàn)菌株以酶標(biāo)儀測(cè)其600 nm的OD值達(dá)到1.5左右，即為達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需的指數(shù)生長階段。將其加入到含不同濃度硝酸鎵的孔中，無菌對(duì)照孔不加細(xì)菌，陽性對(duì)照孔不加硝酸鎵。

1.3 表面涂層 0.5%的明膠水溶液高壓滅菌。冷卻后，將明膠溶液、硝酸鎵(Sigma公司產(chǎn)品)和乙二胺四乙酸(EDTA)溶液混合，硝酸鎵終濃度為20 μM，EDTA的終濃度為10 μM。將聚氯乙烯(polyvinyl chloride polymer，PVC)片用打孔機(jī)制備成直徑6 mm的圓片，用無水乙醇、去離子水超聲波振蕩清洗15 min，放入清潔干燥的青霉素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包扎。經(jīng)15磅15～20 min高壓消毒后，放在37℃溫箱2 d，使完全干燥。將薄片浸入到上述明膠-硝酸鎵-EDTA混合液，取出置于超凈臺(tái)中自然干燥，備用。

1.4 抗生物膜持久性檢測(cè)［14］將10 mL消毒的尿液置于50 mL聚苯乙烯管(Falcon公司產(chǎn)品)。加入薄片，37℃靜置。分別在1、2、4、7 d后取出薄片，無菌過濾紙吸干，進(jìn)行Kirby-Bauer法(K-B法)擴(kuò)散試驗(yàn)。在超凈臺(tái)中，嚴(yán)格按無菌程序用接種環(huán)挑取適量細(xì)菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細(xì)菌涂布到平皿培養(yǎng)基上，再取薄片貼到LB固體培養(yǎng)基(每升含蛋白胨10 g、酵母膏5 g、氯化鈉10 g和瓊脂15 g)表面，在平皿中央貼1片，外周等距離貼5片，使薄片與培養(yǎng)基緊密相貼。將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24 h后，測(cè)量抑菌圈的直徑。

采用稀釋法測(cè)定膜上依附的細(xì)菌數(shù)量。分別取不做處理的PVC片和經(jīng)過涂層處理的PVC片各6片，置于含20 mL銅綠假單胞菌LB培養(yǎng)液，37℃恒溫培養(yǎng)7 d。取經(jīng)培養(yǎng)的PVC片置于5 mL生理鹽水震蕩30 min，倒出生理鹽水，再加1 mL生理鹽水震蕩15 min后取出薄片，合并生理鹽水以10倍梯度連續(xù)稀釋至10 000倍，各梯度樣本分別以0.1 mL量加入無菌LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中涂布培養(yǎng)，置37℃培養(yǎng)18 h，觀察菌落生長情況，作菌落計(jì)數(shù)。按以下公式計(jì)算出細(xì)菌數(shù):細(xì)菌數(shù)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)所得計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間均數(shù)間的兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 在96孔板中將細(xì)菌接種于含硝酸鎵5～30 μM的培養(yǎng)液中。37℃培養(yǎng)24 h后測(cè)定600 nm的OD值。結(jié)果顯示，硝酸鎵劑量依賴性地抑制細(xì)菌生長，MIC約為20 μM。

圖1 硝酸鎵對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用

2.2 對(duì)生物膜的抑制作用 將PVC片在尿液中浸泡1～7 d后，測(cè)定PVC片的抑菌作用。7 d后K-B擴(kuò)散試驗(yàn)顯示，抑菌圈均保持在20.0mm以上［第0、1、2、4、7 天抑菌圈直徑分別為(22.1 ±1.3)mm、(22.3 ±1.2)mm、(21.8 ±0.9)mm、(21.1 ±0.7)mm、(20.1 ±1.7)mm］，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，抑菌效果較為穩(wěn)定。

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)硝酸鎵涂膜抑制細(xì)菌生物膜形成的能力，分別將經(jīng)硝酸鎵處理過的和未處理過的PVC片放到銅綠假單胞菌的細(xì)胞懸液中，并在37℃條件下培養(yǎng)24 h，無需振蕩，再采用稀釋法分別測(cè)定膜上依附的細(xì)菌數(shù)量。結(jié)果顯示，未處理的PVC片上每片的平均細(xì)菌數(shù)為(2.29±0.13)×107個(gè)，而處理過的為(3.33±0.92)×103個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。

3 討論

越來越多的臨床治療需要使用植入式器械。這些器械，不論是作為短期使用還是植入體內(nèi)終身使用，均可因?yàn)榧?xì)菌生物膜的形成導(dǎo)致嚴(yán)重的全身感染。這在整形外科中極為常見，細(xì)菌生物膜的形成會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，包括義肢感染等，致死亡率和醫(yī)療費(fèi)用的增加［16-17］。本文研究了常用作醫(yī)療植入材料的PVC上的硝酸鎵涂層對(duì)生物膜形成的影響。

生物膜的形成是個(gè)復(fù)雜的發(fā)展過程，包括細(xì)菌黏附和表面固定形成菌落，并融合生物膜［1-4］。生物膜的消除亦非常困難，固定在生物膜中的細(xì)菌比游離狀態(tài)的細(xì)菌更耐抗生素。已經(jīng)證明用Ga3+取代Fe3+可以干擾細(xì)菌DNA和蛋白質(zhì)的合成，抑制細(xì)菌生物膜的形成。Ga3+已被FDA批準(zhǔn)治療惡性高鈣血癥，具有很好的安全性，本文硝酸鎵終濃度為20 μM。明膠是以動(dòng)物的皮、骨為原料制成的蛋白分子聚合物質(zhì)。明膠分子結(jié)構(gòu)上有大量的羥基、羧基和氨基，使得明膠具有極強(qiáng)的親水性，又因其具有無毒、生物相容性好并在生物體中可完全降解等優(yōu)點(diǎn)，故選用明膠作為溶解基質(zhì)。結(jié)果表明，涂布EDTA-鎵-明膠的PVC具有較好的抗菌作用。將EDTA-鎵-明膠涂覆在PVC表面，在防止醫(yī)療器械感染上的用途值得進(jìn)一步研究。

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