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        蝙蝠葛堿對(duì)阿爾茨海默病小鼠腦組織形態(tài)學(xué)的影響

        2014-06-05 04:33:32張朝穎費(fèi)洪新張英博賈博宇韓玉生樸成玉周忠光
        黑龍江科學(xué) 2014年6期
        關(guān)鍵詞:細(xì)胞質(zhì)顳葉皮質(zhì)

        張朝穎,費(fèi)洪新,張英博,賈博宇,韓玉生,杜 徽,白 云,樸成玉,周忠光

        (1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 附屬第四醫(yī)院,哈爾濱150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱 150040)

        阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是目前許多國(guó)家常見的老年性疾病,主要的機(jī)制是腦組織部位出現(xiàn)淀粉樣物質(zhì)的沉積,淀粉樣物質(zhì)的主要成分是β-淀粉樣蛋白(Amyloid beda,Aβ)[1]。Aβ 的沉積會(huì)引起機(jī)體氧化反應(yīng),腦組織形態(tài)學(xué)的改變,主要引起的是與機(jī)體學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的部位,例如海馬部位、顳葉皮質(zhì)區(qū)域的改變[2,3]。蝙蝠葛堿(Dauricine,DAU)具有廣泛的生物學(xué)作用,如抗氧化作用[4]、腦缺血保護(hù)作用[5,6]等。基于此本試驗(yàn)采用APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型,研究DAU對(duì)AD小鼠腦組織的保護(hù)作用。

        1 試驗(yàn)材料

        1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

        3月齡雄性、APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠(B6.Cg-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax)、體重23 ±2g,由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)解剖教研室吳樹亮教授贈(zèng)送,并進(jìn)行基因鑒定。動(dòng)物常溫、常濕飼養(yǎng),自由攝取食物。另外做對(duì)照的小鼠是同月齡、同背景小鼠,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評(píng)價(jià)中心李寶龍副教授購(gòu)買提供。

        1.2 主要藥物

        吡拉西坦購(gòu)于湖南迪諾制藥有限公司,批號(hào)130325;DAU購(gòu)于 MUST公司,批號(hào) MUST—13010313,純度為98.66%;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

        2 試驗(yàn)方法

        2.1 動(dòng)物一般狀態(tài)觀察

        該品種小鼠一般狀態(tài)觀察包括進(jìn)食、飲水、體重、毛發(fā)、色澤、活動(dòng)度、光澤度、糞便顏色、墊料潮濕度等指標(biāo)。

        2.2 動(dòng)物分組

        選擇AD小鼠18只,分3組,其中模型組6只、治療組6只、DAU組6只,另設(shè)立同月齡、同背景的C57小鼠對(duì)照組6只。

        2.3 動(dòng)物給藥

        每天上午選擇對(duì)照組小鼠6只給予生理鹽水灌胃。模型組6只給予生理鹽水灌胃。治療組6只給予吡拉西坦(0.62 g·kg-1·d-1)灌胃。DAU 組 6 只給予 DAU(20 mg·kg-1·d-1)灌胃,持續(xù)2W。

        2.4 多聚甲醛固定

        小鼠乙醚麻醉、剪開腹腔、胸腔、右心耳,針頭插入左心室,緩慢勻速對(duì)小鼠灌注生理鹽水,肝變白后緩慢勻速灌注4%多聚甲醛50 mL,斷頭取腦組織固定。

        2.5 制備石蠟切片

        小鼠灌注固定后流水沖洗、脫水、透明、包埋、-20℃冰箱冷凍組織、切片5μm、做成石蠟切片。

        2.6 動(dòng)物腦組織HE染色

        石蠟切片脫蠟、脫水、水洗、蘇木精染10 min、沖洗、鹽酸乙醇分化數(shù)秒、水洗、氨水處理、水洗、伊紅染色、水洗、脫水、透明、干燥、樹膠封片、顯微鏡觀察腦組織顳葉皮質(zhì)和海馬的結(jié)構(gòu)。

        2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

        3 結(jié)果

        3.1 動(dòng)物一般狀態(tài)觀察

        對(duì)照組小鼠活動(dòng)自如,逃避反應(yīng)靈敏,皮膚光滑,無(wú)瘀斑,毛色光亮,飲食飲水正常。模型組小鼠活動(dòng)能力下降,怕冷,受到刺激躲避反應(yīng)較差,不活躍,皮膚松弛。治療組小鼠,皮膚較光滑,活躍,較模型組改善明顯。DAU組小鼠狀態(tài)比較活躍,飲食飲水正常,反應(yīng)較靈敏。

        3.2 動(dòng)物腦組織HE染色

        3.2.1 顳葉皮質(zhì)區(qū)域HE染色

        腦組織對(duì)照組顳葉皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)正常,細(xì)胞核清晰可見,細(xì)胞質(zhì)豐富(見圖1A)。模型組顳葉皮質(zhì)神經(jīng)元較小,細(xì)胞核較小,細(xì)胞質(zhì)不豐富(見圖1B)。治療組神經(jīng)元比較正常,排列較規(guī)則(見圖1C)。DAU組神經(jīng)元變性的數(shù)目較少,神經(jīng)元基本正常(見圖1D)。

        圖1 小鼠腦組織顳葉皮質(zhì)HE染色(高倍鏡10×40)Fig.1 M ouse cerebral tem poral lobe cortex HE staining(High magnification 10×40)

        3.2.2 海馬區(qū)域HE染色

        腦組織對(duì)照組錐體細(xì)胞層數(shù)較多,神經(jīng)元錐體形,細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)清晰可見(見圖2A)。模型組錐體細(xì)胞層數(shù)減少,細(xì)胞變性明顯,可見到細(xì)胞核固縮(見圖2B)。治療組和DAU組細(xì)胞形態(tài)和排列方式均得到明顯的改善(見圖2C、2D)。

        圖2 小鼠腦組織海馬HE染色(高倍鏡10×40)Fig.2 M ouse hippocampal brain tissue HE staining(High magnification 10×40)

        4 討論

        生物體衰老的過(guò)程是極其復(fù)雜的變化過(guò)程,其中自由基的反應(yīng)在其中起到很重要的作用,自由基的大量產(chǎn)生使機(jī)體產(chǎn)生氧化的物質(zhì),這些物質(zhì)會(huì)引起腦組織的損傷,腦組織損傷后神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)就會(huì)發(fā)生改變[2]。DAU具有抗氧化的作用,因此本試驗(yàn)主要研究DAU對(duì)腦組織因抗氧化引起的的形態(tài)學(xué)變化,觀察腦組織顳葉皮質(zhì)和海馬的神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)。

        針對(duì)AD模型很多,包括 D-半乳糖加亞硝酸鈉[7]、APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因[8]等模型對(duì)機(jī)體的癡呆進(jìn)行研究。本試驗(yàn)采用APP、PS1兩個(gè)基因同時(shí)轉(zhuǎn)入C57小鼠的癡呆模型進(jìn)行研究,觀察DAU對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因的形態(tài)學(xué)影響。試驗(yàn)中觀察了各組小鼠的生長(zhǎng)狀態(tài),顯示該品種小鼠對(duì)飼養(yǎng)條件要求很高,需要清潔的飲用水,飼料和墊料專門購(gòu)買,即使如此,該小鼠生長(zhǎng)也非常緩慢。

        試驗(yàn)中對(duì)小鼠進(jìn)行了心臟灌注、石蠟切片、常規(guī)的HE染色,染色結(jié)果顯示小鼠腦組織的結(jié)構(gòu)變化。顳葉皮質(zhì)區(qū)域經(jīng)過(guò)HE染色顯示腦組織對(duì)照組顳葉皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)正常,細(xì)胞核清晰可見,細(xì)胞質(zhì)豐富。模型組顳葉皮質(zhì)神經(jīng)元較小,細(xì)胞核較小,細(xì)胞質(zhì)不豐富。治療組神經(jīng)元比較正常,排列較規(guī)則。DAU組神經(jīng)元變性的數(shù)目較少,神經(jīng)元基本正常。

        試驗(yàn)對(duì)海馬區(qū)域HE染色顯示腦海馬組織對(duì)照組錐體細(xì)胞層數(shù)較多,神經(jīng)元錐體形,細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)清晰可見。模型組錐體細(xì)胞層數(shù)減少,細(xì)胞變性明顯,可見到細(xì)胞核固縮。治療組和DAU組細(xì)胞形態(tài)和排列方式均得到明顯的改善。綜上所述,DAU可以維持AD小鼠腦組織神經(jīng)元正常的形態(tài)結(jié)構(gòu),減輕AD的臨床癥狀,從而保護(hù)AD小鼠的腦組織結(jié)構(gòu)。

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