馬 玲，阿里木江·賽提瓦爾地，單 莉，張 黎，劉春玲，韓志剛

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肺內(nèi)一科，新疆烏魯木齊，830011；2.新疆烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，新疆烏魯木齊，830002；3.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肺內(nèi)二科，新疆烏魯木齊，830011）

新疆維吾爾族非小細(xì)胞肺癌患者表皮生長(zhǎng)因子受體及KRAS基因突變與臨床病理特征的關(guān)系

馬 玲1，阿里木江·賽提瓦爾地1，單 莉1，張 黎2，劉春玲3，韓志剛1

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肺內(nèi)一科，新疆烏魯木齊，830011；2.新疆烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，新疆烏魯木齊，830002；3.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肺內(nèi)二科，新疆烏魯木齊，830011）

目的探討新疆維吾爾族非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者組織中表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）及KRAS基因突變與臨床病理特征的關(guān)系。方法應(yīng)用探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（ARMS）檢測(cè)50例NSCLC組織中EGFR基因第18、19、20和21外顯子及KRAS基因12、13密碼子上7種熱點(diǎn)體細(xì)胞的突變情況，分析EGFR及KRAS基因突變與維吾爾族NSCLC患者臨床病理特征之間的相關(guān)性。結(jié)果50例標(biāo)本中，EGFR總檢出率為12.0%，其中4例為19外顯子缺失突變，2例為21外顯子L858R點(diǎn)突變；KRAS總檢出率為10%，均位于12密碼子Gly12Ala突變；無(wú)1例發(fā)生EGFR與KRAS同時(shí)突變。腺癌、鱗癌、大細(xì)胞癌EGFR及KRAS基因突變檢出率分別為27.8%、3.5%、0%和22.2%、3.5%、0%。腺癌患者EGFR基因突變率（27.8%）明顯高于非腺癌者（3.1%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腺癌與非腺癌患者KRAS基因突變比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。維吾爾族患者EGFR及KRAS基因突變與年齡、性別、吸煙狀況、TNM分期及ECOG評(píng)分均無(wú)關(guān)。結(jié)論與漢族人群相比，新疆維吾爾族NSCLC患者EGFR突變率較低，KRAS突變率較高，類(lèi)似于歐美高加索人群的突變特點(diǎn)。

維吾爾族；表皮生長(zhǎng)因子受體；KRAS；基因突變

肺癌是發(fā)病率及死亡率均居首位的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）最常見(jiàn)，約占總數(shù)80%，而NSCLC中85%以上患者屬于中晚期，喪失了根治性手術(shù)治療的最佳機(jī)會(huì)［1-2］。表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFRTKIs）對(duì)部分NSCLC患者具有高效、低毒的良好療效，但并非所有患者都表現(xiàn)出良好的效果。因此，尋找能夠預(yù)測(cè)EGFR-TKI藥物敏感性的預(yù)后指標(biāo)非常重要。NSCLC中最常見(jiàn)的2個(gè)突變基因分別編碼表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）和KRAS。EGFR基因突變位點(diǎn)主要是19外顯子缺失突變及21外顯子的L858R點(diǎn)突變，與TKI藥物療效呈正相關(guān)。KRAS基因是一種原癌基因，突變位點(diǎn)主要集中在12及13位密碼子上，其突變患者對(duì)EGFR-TKI療效差，提示預(yù)后不良［3-4］。由于這種基因突變與TKI藥物的敏感性及耐藥性相關(guān)，因此檢測(cè)NSCLC患者腫瘤組織中2種基因的表達(dá)，有助于為肺癌患者提供精確的個(gè)體化治療。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)新疆維吾爾族NSCLC患者關(guān)于基因突變的研究較為罕見(jiàn)。為進(jìn)一步了解新疆當(dāng)?shù)孛褡錘SCLC患者的EGFR及KRAS突變情況，本研究對(duì)本院維吾爾族NSCLC患者組織標(biāo)本進(jìn)行EGFR及KRAS基因檢測(cè)，旨在分析突變狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般材料

收集2003年1月—2011年12月本院保存的晚期維吾爾族NSCLC患者的組織蠟塊50例。經(jīng)病理證實(shí)，診斷明確。其中男39例，女11例；年齡21～75歲，中位年齡57.9歲；TNM分期：Ⅲa期2例，Ⅲb期26例，Ⅳ期22例；功能狀態(tài)評(píng)分（PS）評(píng)分：0～1分28例，2分18例，＞3分4例；組織學(xué)類(lèi)型：鱗癌29例，腺癌18例，大細(xì)胞癌3例；既往經(jīng)過(guò)化療和／或放療和／或介入治療45例，未經(jīng)過(guò)任何抗腫瘤治療5例。

1.2 方法

1.2.1 取材：所有病理標(biāo)本在4%中性甲醛液中固定，經(jīng)石蠟包埋，常規(guī)HE染色，篩選出腫瘤成分＞80%的瘤組織塊切片。

1.2.2 基因檢測(cè)：檢測(cè)內(nèi)容為肺癌EGFR基因18、19、20、21外顯子，主要研究對(duì)象為19和21外顯子，肺癌KRAS基因12、13密碼子上7種熱點(diǎn)體細(xì)胞突變。檢測(cè)方法：探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（ARMS）又名等位基因特異聚合酶鏈反應(yīng)（AS -PCR）。檢測(cè)試劑采用廈門(mén)艾德生物醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)的人類(lèi)EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒及人類(lèi)KRAS基因7種突變檢測(cè)試劑盒，實(shí)驗(yàn)具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用StrataGene MX3000P實(shí)時(shí)PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，每次檢測(cè)樣品包括1個(gè)陽(yáng)性質(zhì)控品、1個(gè)NTC對(duì)照。如果Ct值為0或Ct值＞30，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果為野生型。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性25s，64℃退火20s，72℃延伸20 s，15個(gè)循環(huán)；93℃變性25 s，60℃退火35 s，72℃延伸20 s，31個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 EGFR與KRAS基因突變檢測(cè)結(jié)果

EGFR總檢出率為12.0%（6／50），其中4例為19外顯子缺失突變，突變率為8%（4／50），2例為2l外顯子L858R點(diǎn)突變，突變率為4%（2／50）。未檢測(cè)到18及20外顯子突變。KRAS總檢出率為10%（5／50），均位于12密碼子Gly12Ala突變。

2.2 EGFR與KRAS基因突變的關(guān)系

50例標(biāo)本中，無(wú)1例發(fā)生EGFR與KRAS同時(shí)突變。6例EGFR基因突變標(biāo)本未檢測(cè)到KRAS基因突變，而5例KRAS基因突變標(biāo)本也未檢測(cè)到EGFR基因突變。

2.3 EGFR及KRAS基因突變與臨床病理特征的關(guān)系

腺癌、鱗癌、大細(xì)胞癌EGFR基因突變檢出率分別為27.8%（5／18）、3.5%（1／29）、0%（0／3），腺癌患者EGFR基因突變率明顯高于鱗癌（P＜0.05）。腺癌EGFR基因突變率為27.8%，非腺癌突變率為3.1%，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。維吾爾族患者EGFR基因突變與年齡、性別、吸煙狀況、TNM分期、ECOG評(píng)分均無(wú)關(guān)（P＞0.05），而與病理類(lèi)型顯著相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 維吾爾族NSCLC患者EGFR基因突變與臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］

表2 維吾爾族NSCLC患者KRAS基因突變與臨床病理類(lèi)型的關(guān)系［n（％）］

腺癌、鱗癌、大細(xì)胞癌KRAS基因突變檢出率分別為22.2%（4／18）、3.5%（1／29）、0%（0／3），腺癌患者KRAS基因突變率明顯高于鱗癌及其他組織類(lèi)型（P＜0.05）。腺癌與非腺癌KRAS基因突變比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。KRAS基因突變與年齡、性別、吸煙狀況、TNM分期及ECOG評(píng)分均無(wú)關(guān)（P＞0.05），而與病理類(lèi)型顯著相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

研究［5］顯示，EGFR在40%～89%的NSCLC中表達(dá)，其在腫瘤的形成及生物學(xué)行為上發(fā)揮重要的作用，目前是NSCLC治療的重要靶點(diǎn)之一。EGFR基因位于人類(lèi)第7號(hào)染色體短臂上，由188 307個(gè)堿基組成，包括28個(gè)外顯子，主要突變位點(diǎn)為外顯子18、19、20、21，常見(jiàn)于外顯子19缺失突變和外顯子21 L858R突變，與小分子TKIs的敏感度相關(guān)［6］。通過(guò)分子水平檢測(cè)EGFR基因突變狀態(tài)，為晚期NSCLC患者進(jìn)行EGFR-TKI治療已成為定論［7-8］。研究［9］表明，EGFR突變率在亞洲人群較高（30%～50%），高加索人群較低（＜10%）。目前，絕大多數(shù)研究以亞洲、歐美人群實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為主，而關(guān)于中東及中亞地區(qū)的研究卻很少見(jiàn)。研究［10］表明，漢唐時(shí)期，匈奴、吐蕃、漢人、突厥等民族進(jìn)入今天的新疆地區(qū)，融合形成現(xiàn)在的維吾爾族，故維吾爾族屬于羅馬人種，被歸于高加索人群。本研究中，維吾爾族患者EGFR基因突變率為12.0%，與亞洲人群EGFR基因高突變率相比有明顯差異，接近于歐美人群的突變水平，這與高加索人群EGFR基因突變率較低結(jié)果相一致［9］，同時(shí)也是導(dǎo)致維吾爾族患者經(jīng)過(guò)TKI治療效果差的原因之一。

除人種差別之外，地域因素也對(duì)EGFR突變有一定影響。歐美地區(qū)高加索人群肺癌患者EGFR突變率僅不到10%，而東亞地區(qū)突變率高達(dá)50%，證明肺癌的發(fā)生受環(huán)境因素和遺傳學(xué)背景的影響。新疆維吾爾自治區(qū)是以維吾爾族為主體的少數(shù)民族聚居地區(qū)，各民族之間在遺傳、人種、文化飲食、生活習(xí)慣、住所等各個(gè)方面存在差異。本研究結(jié)果顯示，維吾爾族患者EGFR突變總檢出率為12%，其中腺癌患者突變率（27.8%）明顯高于非腺癌者（3.1%）；患者EGFR基因突變與年齡、性別、吸煙狀況、TNM分期及ECOG評(píng)分均無(wú)關(guān)，這與EGFR基因突變與吸煙史、性別相關(guān)結(jié)果［9］相悖，考慮可能與樣本量小，2組樣本量明顯不平衡有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，EGFR基因突變主要類(lèi)型為外顯子19缺失突變，突變率為8%，外顯子21 L858R點(diǎn)突變率為4%，二者間無(wú)顯著差異，原因可能在于本研究入組樣本量少，無(wú)法進(jìn)一步明確當(dāng)?shù)孛褡錏GFR主要的突變類(lèi)型。

RAS基因被激活后就成為具有致癌活性的癌基因，其突變多發(fā)生在N端第12、13密碼子上。KRAS是介導(dǎo)EGFR下游信號(hào)活化的信號(hào)通路，當(dāng)其發(fā)生點(diǎn)突變，就會(huì)導(dǎo)致蛋白異常表達(dá)，造成細(xì)胞惡性增殖病變，最終導(dǎo)致肺癌的發(fā)生。KRAS突變被認(rèn)為是預(yù)后不良的分子生物標(biāo)記物［11］。研究［12］發(fā)現(xiàn)，美國(guó)和澳大利亞肺癌患者KRAS突變率明顯高于中國(guó)臺(tái)灣和日本，歐美人群KRAS突變率為20%～40%，其中肺腺癌占30%～56%，鱗癌占0～25%，大細(xì)胞肺癌占8%～33%，腺鱗癌約8%～11%。早年有學(xué)者報(bào)道KRAS突變與吸煙狀況、病理組織學(xué)分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中吸煙的腺癌患者突變率較高。而中國(guó)臺(tái)灣的一項(xiàng)研究［13］顯示，237肺癌患者標(biāo)本中，KRAS突變率僅為3.8%，其中腺癌為5.03%，鱗癌為1.56%，說(shuō)明東亞人和西方人KRAS突變率有顯著差異。種族及地域的不同，導(dǎo)致NSCLC患者KRAS基因突變情況可能差異較大［14-15］。本研究結(jié)果顯示，50例標(biāo)本中，腺癌、鱗癌、大細(xì)胞癌KRAS基因突變檢出率分別為22.2%、3.5%、0%；腺癌與非腺癌KRAS基因突變比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；維吾爾族患者KRAS突變率（10%）明顯高于亞洲人群（3.8%），印證了維吾爾族屬于高加索人群的種族特點(diǎn)。

EGFR和KRAS突變與病理類(lèi)型、性別及地域相關(guān)，TKI藥物治療的優(yōu)勢(shì)人群為不吸煙、亞裔、女性及腺癌患者。通過(guò)TRIBUTE及BR.21等大型臨床研究［15］證實(shí)，KRAS突變更多見(jiàn)于男性和吸煙患者。本研究結(jié)果顯示，KRAS基因突變狀態(tài)與患者性別、吸煙狀況無(wú)關(guān)，考慮與標(biāo)本量少，且不吸煙患者明顯多于吸煙患者有關(guān)。KRAS總檢出率為10%，均位于12密碼子Gly12Ala突變，與60%～80%的KRAS突變位于12號(hào)密碼子上的結(jié)果相一致。EGFR及KRAS基因不會(huì)同時(shí)存在于同1例患者中，二者相互排斥，這可能與EGFR傳導(dǎo)通路下游的KRAS MARK信號(hào)途徑相關(guān)。本研究也未發(fā)現(xiàn)2種基因突變同時(shí)出現(xiàn)的患者。

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Relationship between the mutation of epidermal growth factor receptor and KRAS genes and clinical pathological features in Uyghur patients with non-small cell lung cancer in Xinjiang

MA Ling1，ALIMUJIANG·Saitiwaerdi1，SHAN Li1，ZHANG Li2，LIU Chunling3，HAN Zhigang1
（1.First Department of Pulmonary Medicine，The Affiliated Tumor Hospital of Xinjiang Medical University，Urumchi，Xinjiang，830011；2.Department of Oncology，Urumchi Hospital of Traditional Chinese Medicine，Urumchi，Xinjiang，830002；3.Second Department of Pulmonary Medicine，Affiliated Tumor Hospital of Xinjiang Medical University，Urumchi，Xinjiang，830011）

ObjectiveTo explore the relationship between the mutation of epidermal growth factor receptor（EGFR）and KRAS genes and clinical pathological features in Uyghur patients with non-small cell lung cancer（NSCLC）in Xinjiang.MethodsThe mutations of EGFR gene exons 18，19，20 and 21 as well as 7 sorts of hot somatic cells in KRASgene codons 12 and 13 in 50 NSCLC tissues were detected by probe amplification refractory mutation system，and the correlation between the mutation of EGFR and KRAS genes and clinical pathological features in Uyghur patients was analyzed.ResultsAmong 50 specimens，the total detection rate of EGFR was 12.0%，in which 4 belonged to deletion mutantion of exon 19，and 2 to L858R point mutation of exon 21.The total detection rate of KRAS was 10%，all of which belonged to Gly12Ala mutation on codon 12.No one simultaneously occurred EGFR and KRAS mutations.The detection rates of EGFR and KRAS genes in adenocarcinoma，squamous carcinoma and large cell carcinoma were2 7.8%，3.5%，0%and 2 2.2%，3.5%，0%respectively.Themutation rateof EGFRin patients with adenocarcinoma（27.8%）was significantly higher than those without adenocarcinoma（3.1%）.There was significant difference of the KRASgene mutation between patients with／without adenocarcinoma.The mutations of EGFR and KRAS genes in Uyghur patients were not related to the age，gender，smoking，TNM staging and ECOG score.ConclusionCompared with Chinese population，the mutation rate of EGFR in Uyghur patients with NSCLC is lower，but that of KRASis higher，similar to the mutation of European Caucasian population.

Uyghur；epidermal growth factor receptor；KRAS；gene mutation

R 734.2

A

1672-2353（2014）05-030-04

10.7619／jcmp.201405010

2013-11-27

新疆烏魯木齊市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（Y111310025）

韓志剛，E-mail：1378213986＠qq.com