蔡曉軍，陳 萍，曹風軍，李林均，李 芳，鄧守恒

（湖北省十堰市人民醫(yī)院腫瘤中心，湖北十堰，442000）

核心蛋白聚糖在Ishikawa細胞中的表達及意義

蔡曉軍，陳 萍，曹風軍，李林均，李 芳，鄧守恒

（湖北省十堰市人民醫(yī)院腫瘤中心，湖北十堰，442000）

目的觀察表皮生長因子受體（EGFR）信號通路抑制劑RG-14260（RG）單用及RG聯(lián)合mTOR信號通路抑制劑亞羅莫司（RA）體外對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞增殖及核心蛋白聚糖（DCN）表達的影響。方法子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞經(jīng)RG及RG聯(lián)合RA作用后，采用免疫組織化學法檢測細胞增殖細胞核抗原（PCNA）的表達，反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）及免疫印跡法分別檢測細胞內(nèi)DCN基因和蛋白表達的變化。結果RG單用及聯(lián)合RA均可降低Ishikawa細胞PCNA陽性細胞表達率，促進細胞DCN基因和蛋白的表達，但二者合用效果更為顯著。結論單獨和聯(lián)合EGFR及mTOR信號通路抑制劑均可在基因和蛋白水平上上調(diào)Ishikawa細胞內(nèi)DCN的表達，而升高的DCN反過來又可增強信號通路抑制劑對細胞增殖的抑制作用。

Ishikawa；RG-14260；亞羅莫司；增殖細胞核抗原；核心蛋白聚糖

子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展與一些信號通路的活性改變密切相關，而以往的研究［1］多集中在表皮生長因子受體（EGFR）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）2條信號通路。前期研究［2］結果發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞中還存在著mTOR信號通路的過度激活。當前，針對相關信號傳導通路展開分子靶向治療已成為腫瘤個體化治療的新策略。本研究擬在體外采用EGFR及mTOR 2條信號通路抑制劑單獨和聯(lián)合作用于Ishikawa細胞，觀察子宮內(nèi)膜癌細胞在處理前后細胞增殖及細胞內(nèi)核心蛋白聚糖（DCN）基因和蛋白水平的表達變化，為進一步明確子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制及更好地指導臨床制定治療方案提供理論依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥品試劑與儀器

小牛血清（美國GIBCO公司），表皮生長因子（EGF）（美國Sigma公司），EGFR抑制劑RG-14620（RG）及mTOR抑制劑亞羅莫司（RA）（美國Biomol公司），DCN抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司），小鼠抗人增殖細胞核抗原（PCNA）單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），SABC免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒（武漢博士德公司），ECL發(fā)光液（美國Pierce公司），Trizol總RNA抽提試劑盒及RevertAidTM First strand cDNA synthesis kit（Fermentas產(chǎn)品），BMP型倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS公司），AM-PLITRON II型PCR擴增儀（美國Barnscread／Thermolyme公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組：子宮內(nèi)膜癌細胞株Ishikawa由本院臨床醫(yī)學研究所提供，培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，于37℃、飽和濕度、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 免疫組化法檢測細胞PCNA表達［3］：參照文獻3方法將經(jīng)EGF預處理2 h的細胞懸液分別接種于鋪有蓋玻片的6孔板中，孵育24 h后分為A（對照組）、B（10μmol／LRG處理組）、C（10μmol／LRA處理組）、D（10μmol／LRG＋10μmol／L RA處理組）4組，孵育24 h后取出蓋玻片，采用免疫組織化學法檢測PCNA表達，比較各組PCNA陽性細胞率，即每100個細胞中的陽性細胞數(shù)。

1.2.3 RT-PCR檢測DCN mRNA表達：細胞接種于6孔板，經(jīng)EGF預處理2 h后分為A（對照組）、B（10μmol／LRG處理組）、C（10μmol／LRG＋10μmol／L RA處理組）3組，培養(yǎng)24 h后收集細胞。Trizol提取細胞總RNA，cDNA合成體系20μL，小鼠白血病病毒（M-MLV）逆轉(zhuǎn)錄酶200U，二硫蘇糖醇（DTT）0.2μmol／L，RNA酶抑制劑（RNasin）20U，4種脫氧核苷酸混合物（dNTP）20 nmol／L，隨機引物100 ng，RNA模板1μg，25℃10 min，42℃60 min，95℃1 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，冰浴1 min。PCR反應引物為：DCN上游引物5′-ACCGAAATCAAAGATGGAGACT-3′，下游引物5′-ATCAGCAATGCGGATGTAGGAG-3′，擴增產(chǎn)物348 bp，反應體系25μL，94℃預變性5 min，94℃變性30 s，49℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)，最后72℃5 min結束反應；β-actin上游引物5′-ACGGATTTGGTCGTATTGG G-3′，下游引物為5′-TGATTTTGGAGGGATCTCG C-3′，擴增產(chǎn)物230 bp。各取10μL擴增產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，紫外燈下觀察并照相，凝膠圖像分析儀分析，根據(jù)DCN與β-actin灰度比值，進行目的基因表達的半定量分析。

1.2.4 Western blot法檢測DCN蛋白表達：細胞分組及處理同上，收集細胞，PBS洗2次，裂解，離心，收集上清，即為細胞總蛋白，進行蛋白定量，調(diào)節(jié)每份樣品蛋白濃度，加等量蛋白于上樣緩沖液，煮沸，在SDS聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳。電泳后轉(zhuǎn)膜，依次加入DCN一抗和二抗，加入底物液顯色，拍照。蛋白條帶用Quanti Scan軟件進行密度掃描分析。

2 結 果

2.1 Ishikawa細胞內(nèi)PCNA表達的結果

顯微鏡下可見，PCNA陽性細胞整個核內(nèi)分布著大小均勻的淺黃色、棕黃色或黃色細小顆粒，而陰性細胞核無著色，胞漿呈淡黃色。

細胞記數(shù)結果顯示，未經(jīng)處理的對照組細胞內(nèi)陽性細胞數(shù)目較高，陽性率為80.3%；RG和RA抑制劑單用可使細胞PCNA陽性表達率分別降至46.7%和48.2%，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；二者合用PCNA陽性表達率進一步降至31.4%，效果更為顯著（P＜0.01）。見表1。

表1 RG、RA單用及合用對Ishikawa細胞PCNA表達的影響

2.2 抑制劑對Ishikawa細胞DCN mRNA表達的影響

RT-PCR檢測結果表明，Ishikawa細胞內(nèi)存在著DCN

mRNA表達。RG及RG＋RA處理組均可明顯上調(diào)細胞內(nèi)DCN mRNA表達，表現(xiàn)為條帶明顯增粗、增亮，二者合用效果更明顯，見圖1。

半定量分析結果顯示，對照組Ishikawa細胞內(nèi)DCN mRNA比值為（0.258±0.033），經(jīng)RG及RG＋RA作用24h后，比值分別上升至（0.595± 0.064）（P＜0.05）和（0.858±0.071）（P＜0.01），上調(diào)率分別為130%和233%。

圖1 RG、RA單用及合用對Ishikawa細胞DCN m RNA表達的影響

2.3 抑制劑對Ishikawa細胞DCN蛋白表達的影響

Western blot定量檢測結果發(fā)現(xiàn)，Ishikawa細胞中存在著DCN蛋白表達。RG及RG＋RA處理組細胞內(nèi)DCN蛋白表達量均有不同程度的增多，且二者合用效果更明顯，見圖2。

圖2 RG、RA單用及合用對Ishikawa細胞DCN蛋白表達的影響

定量分析結果顯示，未經(jīng)處理的Ishikawa細胞內(nèi)DCN灰度值為（0.191±0.026），經(jīng)RG及RG＋RA作用后，灰度值分別上升至（0.288± 0.090）（P＜0.05）和（0.437±0.017）（P＜0.01），上調(diào)率分別為60.8%和118%。

3 討 論

對惡性腫瘤實行多靶點聯(lián)合靶向治療已成為抗腫瘤治療的研究熱點，主要原因在于腫瘤不大可能只依賴一種受體或是一條信號轉(zhuǎn)導通路來維持生長和生存。另外，在腫瘤復雜的信號轉(zhuǎn)導通路中不同受體之間存在代償性信號通路。目前，研究較多的是將抗EGFR與抗Ras［4］或Raf／MEK／MAPK等Ras下游分子治療相結合。同時，越來越多的證據(jù)［5-6］也證實了抗EGFR與阻斷其下游PI3K／Akt／mTOR信號通路聯(lián)合應用的合理性和可行性。

本研究將EGFR及mTOR信號通路抑制劑RG、RA作用于Ishikawa細胞，結果發(fā)現(xiàn)無論RG、RA單用或聯(lián)用均能明顯降低細胞內(nèi)PCNA的陽性表達率，聯(lián)用效果更為顯著。由于PCNA是一種主要表達在細胞增殖周期S期的核內(nèi)蛋白，其作為DNA復制時δ聚合酶的輔助物，可直接參與核內(nèi)DNA的合成，與細胞增殖有明顯關系，被認為是一種可準確反映細胞增殖狀態(tài)的評判指標［7］。PCNA檢測［8－9］結果說明，EGFR和mTOR信號通路抑制劑均可明顯抑制Ishikawa細胞增殖，與四甲基偶氮唑鹽（MTT）法和流式細胞法檢測結果相一致。

DCN是在腫瘤微環(huán)境外基質(zhì)中存在的一些小分子蛋白聚糖，是一種腫瘤生長負性調(diào)節(jié)因子［10］。研究［11－12］表明，DCN抑制腫瘤的作用主要是通過使EGFR的酪氨酸激酶持續(xù)性失活，下調(diào)EGFR酪氨酸激酶的表達，減弱EGFR介導的胞內(nèi)鈣動員而實現(xiàn)。本研究結果顯示，EGFR和mTOR信號通路抑制劑單用或聯(lián)用均可明顯上調(diào)Ishikawa細胞內(nèi)DCN基因和蛋白的表達水平，推測RG及RA對Ishikawa細胞增殖的抑制作用除了直接阻斷EGFR和mTOR信號傳導外，還可通過促發(fā)DCN的表達而抑制EGFR的酪氨酸激酶活性來實現(xiàn)。此外，Wu等［13］研究發(fā)現(xiàn)，DCN還能上調(diào)腫瘤細胞內(nèi)P21的表達，而筆者在前期研究中也證實了RG及RA可上調(diào)Ishikawa細胞內(nèi)P21的表達［14］，這可能是RG及RA能夠?qū)shikawa細胞增殖產(chǎn)生抑制作用的另一個原因。

本研究結果為聯(lián)合EGFR和mTOR信號通路抑制劑用于子宮內(nèi)膜癌治療提供了理論依據(jù)。但由于臨床上子宮內(nèi)膜癌病理類型較多，且人10號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白類似物（PTEN）突變在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［15］，因此PTEN基因的表達可否影響到相關靶向治療的療效仍需進一步研究。

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Expression and significance of decorin in Ishikawa cells

CAIXiaojun，CHEN Ping，CAO Fengjun，LI Linjun，LIFang，DENG Shouheng
（Oncology Center，Shiyan People′s Hospital，Shiyan，Hubei，442000）

Objective To observe the effectof epidermal growth factor receptor（EGFR）signal transduction inhibitor RG-14260（RG）alone or combined with mTOR signal transduction inhibitor rapamycin（RA）on the proliferation and expression of decorin（DCN）in Ishikawa cells in vitro.M ethodsAfter treated with RG alone or combined with RA for24 hours，immunohistochemicalmethod was used to detect the expression of proliferating cell nuclear antigens（PCNA）.Reverse transcriptase-polymerase chain reaction（RT-PCR）and Western blotmethod were used to detect the expression changes of DCN genes and proteins in cells respectively.ResultsRG alone or combined with RA were able to decrease the expression rate of positive PCNA cells in Ishikawa cells，promote the expression of DCN genes and proteins，but the efficacy of combined application was more significant.ConclusionSingle and combined applications of EGFR and mTOR signal transduction inhibitors can up-regulate the expression of DCN in Ishikawa cells at the levels of genes and proteins，andmeanwhile the increased DCN can reinforce the inhibitory effect of signal transduction inhibitors on the cell proliferation.

Ishikawa；RG-14260；rapamycin；proliferating cell nuclear antigens；decorin

R 737.33

A

1672-2353（2014）05-013-03

10.7619／jcmp.201405005

2013－12－10

湖北省教育廳基金（Q20092401）；湖北醫(yī)藥學院基金（2008CXZ02）；中國高校醫(yī)學期刊臨床專項資金（11321499）

鄧守恒，E－mail：dshblue＠163.com